謝景春 李洪亮 金奇 袁賢赟 謝保平

骨質疏松癥 (osteoporosis，OP) 是一種全身性骨代謝負性失衡疾病，其特征是骨量減少和骨組織微結構破壞，臨床表現為骨骼疼痛和骨折[1]。骨量的動態(tài)平衡主要是由破骨細胞 (osteoclast，OC)、成骨細胞 (osteoblast，OB)、骨細胞和骨髓間充質干細胞 (BMSCs) 調控[2]。其中 OC 是機體內惟一具有骨吸收功能的多核巨細胞，OB 和 OC 則在骨重建中扮演了重要的角色[3]。因此，OP 的發(fā)病機理主要由骨組織內的 OC 和 OB 的功能活動失衡所致[4]。OP是一致退行性疾病，隨著年齡的增加和人口老齡化問題的加劇，OP 患病率呈現上升的趨勢，已成為危害居民公共衛(wèi)生安全的關鍵問題。

RNA 甲基化修飾廣泛存在于脊椎動物、植物、酵母菌、細菌、古細菌和病毒中，主要包括 m6A (N6-methyladenosine) 甲基化、5 甲基胞嘧啶甲基化 (m5C)、N1-甲基腺嘌呤甲基化 (m1A) 等[5]。其中 m6A 甲基化是真核生物中最普遍且最豐富的 RNA 修飾，大約占到了 RNA 甲基化修飾的 80% 左右，目前，m5C 和 m1A 的研究還處于起步階段，其修飾酶、動態(tài)調控和生物學功能需要進一步研究[6-7]。m6A 甲基化修飾是發(fā)生在腺嘌呤第 6 位 N 原子上的甲基化修飾，并在 m6A 甲基轉移酶 (Writers)、m6A 去甲基化酶 (Erasers) 和甲基化識別蛋白 (Readers) 共同調節(jié) (圖1) 下影響著 mRNA 的剪接、轉錄、翻譯和降解，進而影響基因的表達，并參與調節(jié)細胞分化、胚胎發(fā)育和疾病發(fā)生的細胞生物學功能[8-9]。同時除 mRNA 外，m6A 修飾還對 miRNA、LncRNA，rRNA、tRNA、snRNA等具有重要的調節(jié)功能[10]。近年來，越來越多的研究表明 m6A 甲基化修飾在 OP 的調控中扮演了重要的角色，特別是在調控骨穩(wěn)態(tài)和骨量方面[11-12]。有學者發(fā)現條件敲除骨髓間充質干細胞 (MSCs) 中的 m6A 甲基轉移酶樣 3(methyltransferase-like 3，METTL3) 可誘導小鼠 OP 的發(fā)生，METTL3 功能喪失導致骨形成受損、成骨分化潛能降低，且 MSCs 中 METTL3 過表達可以抑制小鼠雌激素缺乏誘導的 OP[10]。Zhang 等[12]研究發(fā)現 RNA 去甲基化酶脂肪與肥胖相關蛋白 (fat mass and obesity-associated protein，FTO) 是維持骨量和降低 OB DNA 損傷和凋亡率所必需的基因。因此，筆者綜述了 m6A 甲基化修飾調節(jié)酶和識別蛋白，以及 m6A 甲基化修飾調控 OC 和 OB 分化的機制，特別是 m6A 對 BMSCs 向 OB 和脂肪細胞分化的機制，以期為 OP 的診斷和治療尋找新的分子標志物。

圖1 m6A 甲基化修飾的生物學調節(jié)過程Fig.1 Regulatory process of m6A methylation modification

一、調節(jié) m6A 甲基化修飾的酶和蛋白

1.m6A 甲基轉移酶：m6A 修飾由甲基化轉移酶復合物催化，主要包括 METTL3、METTL14 以及 Wilms 腫瘤 1 結合蛋白 (Wilms tumor 1 associated protein，WTAP)(表1)[13]。其中 METTL3 是第一個被鑒定的 m6A 甲基轉移酶，METTL3 N 端包含兩個 Cys-Cys-Cys-His (CCCH)型鋅指結構域和一個催化結構域，它在 RNA 生命周期的所有階段都發(fā)揮作用，包括前 mRNA 剪接、核輸出、翻譯、衰變等[14]。METTL14 具有和 METTL3 幾乎相同的拓撲結構，但 METTL14 不具備催化功能，通常 METTL3與 METTL14 相互作用形成催化復合物，催化甲基從 S-腺苷甲硫氨酸轉移到特定的 RNA 腺嘌呤上[15-16]。WTAP 是m6A 甲基轉移酶復合物的關鍵成份，由于其缺乏催化結構域，WTAP 本身不具有甲基化修飾的活性，但在 WTAP 敲低的細胞系中的整體 m6A 水平顯著降低，提示 WTAP 在mRNA 甲基化中具有重要意義[17]。

表1 m6A 修飾調節(jié)蛋白Tab.1 Enzymes and proteins in m6A modification

此外，除了 METTL3、METTL14 和 WTAP 的核心復合物外，其它幾種蛋白質也參與甲基轉移酶復合物的形成。如 CCCH 型鋅指蛋白 13 (ZC3H13)[18]、CCHC 型鋅指蛋白 4 (zinc finger CCHC-type containing 4，ZCCHC4)[19]和METTL16[20]等 (圖1)。

2.m6A 去甲基化酶：m6A 去甲基化酶包括 FTO[21]、AlkB 同源蛋白 5 (AlkB homologue 5，ALKBH5)[22]、ALKBH3[23]和 ALKBH1[24](表1)。其中 FTO 是第一個被發(fā)現的去甲基化酶，也稱為 ALKBH9，在熱休克應激狀態(tài)下 FTO 被抑制，mRNA 甲基化水平升高[21]。FTO和 ALKBH5 都屬于 α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶家族蛋白，并以 Fe2+和 α-酮戊二酸依賴性方式促使 m6A 去甲基化[25]。有研究表明 ALKBH5 可以逆轉 METTL3 的對轉錄因子 TFEB 的甲基化水平的影響，減輕缺氧誘導的心肌凋亡，增加心肌細胞自噬水平[22]。ALKBH3 是最近發(fā)現的一種 m6A 去甲基化酶，ALKBH3 介導的 tRNA 去甲基化可提高蛋白質翻譯效率[23]。

3.m6A 甲基化識別蛋白：m6A 甲基化識別蛋白包括 YT521-B 同源 (YT521-B homology，YTH) 結構域蛋白家族 (YTHDF1～3、YTHDC1～2) 和異質核糖核蛋白 (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，HNRNP) 家族(表1)。其中 YTHDF1、YTHDF2 和 YTHDF3 主要存在于細胞質中，YTHDF1 可以與 mRNA 中終止密碼子周圍的 m6A位點結合，并通過招募 eIF3、eIF4E、eIF4G、PABP 和 40S核糖體亞基促進蛋白質的翻譯[26]。YTHDF2 是第一個被鑒定的具有選擇性識別 m6A 甲基化的蛋白，YTHDF2 的結合位點主要位于富含 GAC 序列的 3’-UTR，從而加速 mRNA底物的降解[27]。YTHDF3 可以與 YTHDF1 和 YTHDF2 相互作用，增強 YTHDF1 或 YTHDF2 與 m6A 修飾底物的結合能力[28]。YTHDC1 和 YTHDC2 則主要存在于細胞核內，YTHDC1 調節(jié) mRNA 的剪接，YTHDC2 再進一步加速mRNA 的降解[29-30]。

HNRNP 家族成員主要包括 HNRNPA2B1[31]、HNRNPC[32]、HNRNPG[33]和 HNRNPD[21]是潛在的 m6A 甲基化識別蛋白 (表1)。有研究表明 METTL3 可以通過催化TFEB pre-mRNA 的 m6A 甲基化，促進心肌細胞中 HNRNPD與 TFEB pre-mRNA 的結合，從而降低 TFEB mRNA 表達并促進心肌細胞凋亡[22]。此外，胰島素樣生長因子 2 mRNA結合蛋白 (insulin-like growth factor 2 mRNA binding proteins，IGF2BPs) 是一種只在細胞質中表達的新型 m6A 識別蛋白，可識別 mRNA 上保守的 GG (m6A) C 序列，增強目標mRNA 的穩(wěn)定性，增強 mRNA 穩(wěn)定性，提高 mRNA 翻譯效率[34]。

二、m6A 甲基化修飾與 OP

骨組織中直接參與骨代謝調控機制的細胞有：骨源性始祖細胞 (osteogenic progenitor cell，OPC)、OB、骨襯細胞 (bonelining cells，BLC)、骨細胞 (osteocyte，OS)、OC 等5 種。OP 主要是骨組織內的 OC 和 OB 的功能活動平衡被破壞所致。因此，OC 和 OB 常作為抗骨質疏松研究的靶細胞，且進一步的了解 m6A 甲基化修飾在 OC 和 OB 分化中扮演的角色為對抗 OP 臨床研究和藥物研發(fā)具有重要的意義。

1.m6A 對甲基化修飾與 OC 分化：OC 是機體內惟一具有骨吸收功能的多核巨噬細胞，OC 最典型的特征是由單核破骨細胞的細胞 -細胞融合產生的多核化，OC 前體的細胞融合是重組細胞骨架和發(fā)揮骨吸收功能所必需的，OC 通過分泌酸性水解酶和蛋白水解酶來溶解骨骼中的礦物質和細胞外基質，常作為骨代謝疾病臨床治療和藥物研發(fā)的靶細胞[35-36]。近年來，有研究發(fā)現 METTL3 上調非編碼 RNA circ_0008542 的 m6A 水平，促進 Circ_0008542 與miRNA-185-5p 的競爭性結合，上調 miRNA-185-5p 靶基因RANK 的表達，促進 OC 分化，增強骨吸收功能，且這一作用可被去甲基化酶 ALKBH5 逆轉，其中 RANK 是 OC 分化必須因子 RANKL 的受體[37-38]。提示 RANKL/ RANK 可能是 m6A 甲基化修飾調控 OC 分化的主要通路之一。

OC 分化受多種炎癥因子和炎癥信號通路的調控，業(yè)已證實炎癥因子 IL-6、IL-1β、TNF-α 是 OC 分化的負性調控因子[39-40]。YTHDF2 在 LPS 和 RANKL 誘導的破骨細胞前體 (RAW264.7、BMMs) 中的表達顯著增加，且YTHDF2 敲低顯著提高了 LPS 誘導的 IL-6、TNF-α、IL-1β和 IL-12 的表達，以及 NF-κB 和 MAPK 信號傳導中 p65、ERK1/ 2、IKKα/ β、IκBα、P38 和 JNK 的磷酸化，促進了MAP4K4 和 MAP2K4 表達，并激活 MAPK 和 NF-κB 信號通路，增強 LPS 誘導的 RAW264.7 向 OC 分化的潛能[41-42]。Li 等[43]研究發(fā)現在 OC 分化過程中 RNA m6A 水平和METTL3 的表達顯著增加，METTL3 敲低提高了 Atp6v0d2 mRNA 穩(wěn)定性，降低了 MAPK、NF-κB 和 PI3K-AKT 信號通路中關鍵分子的磷酸化水平降低。因此，NF-κB 和MAPK 等炎癥信號通路可能是 m6A 調控 OC 生成和炎癥反應的主要機制。

2.m6A 甲基化修飾與 OB 分化：OB 是骨形成的主要功能細胞，能特異性分泌多種生物活性物質，負責骨基質的合成、分泌和礦化，調節(jié)并影響骨形成和骨重建過程。有研究表明條件敲除 OB 中 FTO 的情況下，在 12 周齡時小鼠與野生型小鼠的骨體積沒有差異，而 FTO 敲除 30 周齡小鼠的骨體積比野生型小鼠低，提示 m6A 在 OB 分化中扮演了重要的角色[12]。目前，研究較多的成骨細胞誘導模型是 MC3T3-E1 細胞和 BMSCs 細胞[44-45]。其中 m6A 調控 BMSCs 向 OB 分化的機制將在下節(jié)論述。有研究表明METTL3 在 OB 分化中顯著上調，METTL3 抑制 Smad 信號傳導，以及 Smad7 和 Smurf1 mRNA 表達和穩(wěn)定性，促進OB 分化[46]。Miao 等[47]報道 METTL3 促進淋巴增強因子-1(LEF1) m6A 水平，并激活 Wnt/ β-catenin 信號通路，其中Wnt/ β-catenin 信號通路是 OB 分化的關鍵通路[48]。此外，也有研究表明 m6A 可能通過 miRNA 調控 OB 分化，Mi等[49]報道 METTL3 促進 miR-7212-5p 的成熟靶向 FGFR3 抑制 MC3T3-E1 細胞的 OB 分化，Sun 等[50]報道 miR-103-3p靶向 METTL14 抑制 OB 形成。

3.m6A 甲基化修飾與 BMSCs 分化：BMSCs 具有向OB 和脂肪細胞分化的潛能，且 OP 的一個重要特征是脂肪組織在骨髓中的積累。因此，調節(jié) BMSCs 向 OB 分化和脂肪細胞分化的動態(tài)平衡是抗 OP 的新策略。有研究表明 METTL3 是調控 BMSCs 向 OB 分化的關鍵去甲基化酶[12,51-54]。在 METTL3 敲低的小鼠中，小鼠骨髓中脂肪組織積累加劇，抑制成骨分化和骨礦化相關基因表達，且 BMSCs 向脂肪細胞分化潛能增加，成骨分化潛能降低，且 METTL3 敲低抑制甲狀旁腺激素受體-1 (parathyroid hormone receptor-1，Pth1r) 和 p-Akt 的表達，降低 PTH 誘導 BMSCs 向 OB 分化的潛能[12,51]。METTL3 還可以通過JAK1/ STAT5/ C/ EBPβ 通路抑制 BMSCs 向脂肪細胞分化，且 YTHDF2 參與 METTL3 對 JAK1 表達的調控，促進了 JAK1 的 mRNA 的降解，進而激活 JAK1/ STAT5/ C/EBP 通路[52]。Yan 等[53]通過基因芯片測序發(fā)現在 METTL3敲低的 BMSCs 中 pre-miR-320 的 m6A 水平顯著升高，miR-320 可以抑制 BMSCs 中成骨分化轉錄因子 Runx2 表達，從而抑制 BMSCs 向 OB 分化。有研究發(fā)現 METTL3 可能是誘導促進 BMSCs 向 OB 分化正向調節(jié)因子。此外，也有研究表明 METTL3 通過增強 m6A 對 MYD88-RNA 的修飾來上調 MYD88 的表達，從而導致 NF-κB 的激活，NF-κB 是一種成骨抑制因子，且 METTL3 對 NF-κB 的調控作用可被 ALKBH5 動態(tài)逆轉[54]。

通常認為單獨的 METTL14 不具有催化 RNA 甲基化修飾的能力。然而，近年來有研究表明，METTL14 在 BMSC中的過表達增強了細胞增殖和成骨分化能力，mRNA 測序結果表明 PTPN6 是 METTL14 的下游靶標，METTL14 通過m6A 增加 PTPN6 mRNA 穩(wěn)定性，調節(jié) PTPN6 的表達[55]。此外，有研究表明 OP 患者的 BMSCs 中 m6A 甲基化 RNA水平顯著升高，而去甲基化酶 FTO 的水平在 BMSC 中持續(xù)下降，同時去甲基化酶 ALKBH1 敲除促進 BMSC 的脂肪生成分化，而骨髓中 BMSCs 中 ALKBH5 的條件敲除增強了小鼠的骨量，提示去甲基化酶 FTO、ALKBH1 和ALKBH5 廣泛參與了調節(jié) BMSCs 向成骨分化[24,56-57]。在機制上，FTO 靶向 PPARγ mRNA 去甲基化，上調 PPARγ 表達，抑制轉錄因子 Runx2 的表達，促進 BMSCs 向脂肪細胞的分化，且 miR-149-3p 通過靶向 FTO 抑制 BMSCs 向脂肪細胞分化，并增強其成骨分化能力，ALKBH5 則通過提高蛋白精氨酸甲基轉移酶 6 (PRMT6) 的 mRNA 衰變率，抑制 BMSCs 向 OB 分化[57-59]。綜上所述，m6A 修飾在調節(jié)BMSCs 向 OB 分化和脂肪細胞分化之間的轉換中發(fā)揮著重要作用，METTL14 和 METTL3 促進 BMSCs 向 OB 分化，而 FTO 則相反 (圖2)。

圖2 m6A 甲基化修飾調節(jié) BMSCs 細胞向 OB 和脂肪細胞分化Fig.2 Mechanisms of m6A regulating BMSCs differentiation

三、小結與展望

m6A 甲基化修飾在 OP 調節(jié)中具有重要的作用，能夠調節(jié) OC、OB 分化以及 BMSCs 分化譜系，且 m6A 甲基化修飾能夠提高 RNA 的穩(wěn)定性，改變 RNA 的剪切和翻譯，在眾多生物樣品中用作指導診斷、預后、治療的生物標志物的潛力。但目前仍無 OP 甲基化檢測的試劑盒，以及外周血 RNA 甲基化標記用于 OP 患者的臨床篩檢和療效監(jiān)測的可行方法，特別是針對 m6A 甲基化修飾的藥物研發(fā)較為滯后。因此，致力于開發(fā) OP 中 m6A 甲基化修飾檢測試劑和藥物研發(fā)可能成為 OP 研究的熱點。