李建 甄東 郭彩芬

正常肌腱止點(diǎn)是一系列高度特異排序的組織，包括骨、鈣化的纖維軟骨層、非鈣化的纖維軟骨層和肌腱[1]。這一結(jié)構(gòu)在力學(xué)傳導(dǎo)中能避免應(yīng)力集中，提供足夠的強(qiáng)度[2]。手術(shù)修復(fù)是腱骨界面損傷的主要治療手段，術(shù)中為了促進(jìn)腱骨愈合需要對骨及肌腱組織進(jìn)行新鮮化，清除殘留的纖維軟骨層，但在愈合過程中腱骨界面的纖維軟骨層再生很困難。多項研究表明，通過促進(jìn)腱骨愈合過程中纖維軟骨層形成，能明顯提高腱骨愈合后的生物力學(xué)強(qiáng)度[3-5]。這說明腱骨愈合的核心問題是肌腱與骨之間纖維軟骨層的形成。因此，如何提高腱骨界面纖維軟骨層的形成是腱骨愈合的關(guān)鍵。

巨噬細(xì)胞參與機(jī)體損傷應(yīng)答，在組織炎癥調(diào)控、修復(fù)中發(fā)揮重要作用[2]。在炎癥微環(huán)境中巨噬細(xì)胞可極化為經(jīng)典活化性巨噬細(xì)胞 (M1 型) 和選擇活化性巨噬細(xì)胞 (M2型)[2]。研究表明，巨噬細(xì)胞浸潤貫穿腱骨愈合的整個階段，其功能也隨著病情進(jìn)展而發(fā)生改變，在損傷的早期主要以 M1 型巨噬細(xì)胞浸潤，分泌重組人白細(xì)胞介素-1β(human IL-1 beta protein，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α) 等促炎因子，參與清除病原體并促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，而隨后巨噬細(xì)胞極化為 M2 型，分泌大量的白介素-10 (interleukin-10，IL-10)、乙型轉(zhuǎn)化生長因子 (transforming growth factor beta，TGF-β) 等抗炎因子促進(jìn)組織的修復(fù)[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo) M1 型巨噬細(xì)胞極化為具有抗炎作用的 M2 型可降低肌腱損傷后炎癥水平，并改善肌腱的生物力學(xué)性能[8-9]。因此，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型改變有望成為治療腱骨愈合的有效策略。筆者廣泛查閱近年國內(nèi)外有關(guān)巨噬細(xì)胞極化在腱骨愈合治療作用的相關(guān)研究報道，以“巨噬細(xì)胞”“腱骨”“愈合”“腱骨愈合”“機(jī)制”作為關(guān)鍵詞，在中國知網(wǎng)和萬方數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索；以“macrophage”“tendon-bone”“healing”“tendon-bone healing”“mechanism”為主題詞，在 PubMed、Web of Science、Embase 數(shù)據(jù)庫檢索。對巨噬細(xì)胞極化在腱骨愈合中的作用進(jìn)行總結(jié)，為后續(xù)腱骨愈合的研究提供新思路。

一、腱骨界面的結(jié)構(gòu)和功能

腱骨界面結(jié)構(gòu)復(fù)雜，它雖然很窄，大約為 200 μm 至1 mm 之間，卻存在典型的四層結(jié)構(gòu)：骨組織、鈣化的纖維軟骨層、非鈣化的纖維軟骨層和肌腱。第一層是肌腱/韌帶組織，主要由成纖維細(xì)胞填充，具有與肌腱/ 韌帶相似的力學(xué)特性。細(xì)胞外基質(zhì)主要由線狀排列的 Ⅰ 型膠原纖維組成[1]。第二層是未鈣化的纖維軟骨，主要由纖維軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成，纖維軟骨細(xì)胞沿肌腱方向呈柱狀排列，細(xì)胞外基質(zhì)主要由 Ⅱ 型和 Ⅲ 型膠原及少量的蛋白多糖和核心蛋白[1]。第三層是鈣化的纖維軟骨，細(xì)胞主要為肥厚的纖維軟骨細(xì)胞，細(xì)胞外基質(zhì)主要是 Ⅱ 型膠原[1]。第四層是骨組織，細(xì)胞由骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞組成，細(xì)胞外基質(zhì)為礦化的 Ⅰ 型膠原。

盡管腱骨界面被分為典型的四層結(jié)構(gòu)，且每層結(jié)構(gòu)的組織成分不同，但這四層在結(jié)構(gòu)上是連續(xù)的，具有明顯的梯度變化特點(diǎn)，使得力學(xué)特性也逐漸發(fā)生變化，由質(zhì)硬的骨組織逐漸過渡到柔軟的肌腱組織，在力學(xué)傳導(dǎo)中避免了應(yīng)力集中，提供足夠的強(qiáng)度傳導(dǎo)強(qiáng)大的肌肉力量，從而提供一種獨(dú)特的機(jī)制來減少腱骨界面處的應(yīng)力集中[10-11]。

手術(shù)為腱骨界面損傷的主要治療方法，臨床研究表明，將斷裂的肌腱通過手術(shù)重新至骨組織上，腱骨愈合界面不再是典型的四層結(jié)構(gòu)，而多為瘢痕組織所替代，由于瘢痕組織的細(xì)胞外基質(zhì)不規(guī)則，彈性降低，缺乏應(yīng)力分散作用，其生物力學(xué)性能顯著降低，導(dǎo)致術(shù)后再撕裂率增加[11]。腱骨界面的復(fù)雜結(jié)構(gòu)奠定了其力學(xué)特性的基礎(chǔ)[12]。因此，腱骨界面愈合的主要問題是如何恢復(fù)腱骨界面的正常梯度結(jié)構(gòu)。

二、巨噬細(xì)胞在腱骨愈合中的作用

腱骨愈合包括三個階段：炎癥期、修復(fù)期和重塑期[13]。第一階段為炎癥期，主要表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞浸潤 (如中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞)，巨噬細(xì)胞吞噬消化壞死物質(zhì)，持續(xù)約 3 天。第二階段為修復(fù)期，本階段巨噬細(xì)胞釋放生長因子招募和活化肌腱成纖維細(xì)胞，共同合成纖連蛋白、Ⅲ 型膠原蛋白和初始無定形的細(xì)胞外基質(zhì)，而后 Ⅲ 型膠原蛋白逐漸被更牢固的 Ⅰ 型膠原蛋白替代，這一階段持續(xù)約數(shù)周。第三階段為重塑期，此階段腱細(xì)胞的新陳代謝很旺盛，而且腱細(xì)胞和膠原纖維開始沿應(yīng)力方向排列以恢復(fù)抗拉強(qiáng)度和肌腱剛度。此外，Ⅲ 型膠原蛋白繼續(xù)轉(zhuǎn)化為 Ⅰ 型膠原蛋白，肌腱成纖維細(xì)胞逐漸分化為成肌纖維細(xì)胞。

腱骨愈合是機(jī)體內(nèi)損傷后組織的修復(fù)過程，炎癥反應(yīng)在其中起著重要的作用，參與組織修復(fù)的巨噬細(xì)胞貫穿整個愈合過程，通過分泌各種炎癥因子和生長因子調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞外基質(zhì)形成，在炎癥早期階段，外周血、骨髓和滑膜組織中的 M0 巨噬細(xì)胞被募集到腱骨界面，主要極化為 M1 型巨噬細(xì)胞，清除壞死物質(zhì)，如過度活化后會影響腱骨愈合；而在隨后的修復(fù)和重塑階段，以M2 型巨噬細(xì)胞占主導(dǎo)地位，可促進(jìn)腱骨愈合[13]。

1.巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控機(jī)制：巨噬細(xì)胞在不同的環(huán)境刺激下可極化為 M1 和 M2 型巨噬細(xì)胞。在脂多糖(lipopolysaco haride，LPS)、TNF-α、干擾素 γ (interferon gamma，IFN-γ) 的刺激下，M0 巨噬細(xì)胞可極化為 M1 巨噬細(xì)胞，同時產(chǎn)生大量的活性氧 (reactive oxygen species，ROS) 和炎癥因子 (如 IL-1β、TNF-α、IL-6)[14]。M2 型巨噬細(xì)胞可極化為 M2a、M2b、M2c、M2d 四種亞型，每種亞型發(fā)揮各自不同的作用。在 IL-4、IL-13 刺激下，巨噬細(xì)胞可極化為 M2a 型，并分泌精氨酸酶-1 (arginase-1，Arg-1) 和胰島素樣生長因子-1 (insulin-like growth factor 1，IGF-1) 以促進(jìn)血管新生和膠原蛋白形成，從而參與細(xì)胞外基質(zhì)的合成，這表明，M2a 巨噬細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)的合成中是必不可少的[15]。M2b 巨噬細(xì)胞的極化可被免疫復(fù)合物和 LPS 誘導(dǎo)并表達(dá)白細(xì)胞分化抗原 86 (cluster of differentiation 86，CD86)、CD68 和主要組織相融復(fù)合體 Ⅱ (major histocompatibility complex class Ⅱ，MHCⅡ)CD86、CD68 和 MHCⅡ，其可分泌 IL-10 抑制炎癥反應(yīng)，同時分泌大量的炎癥因子 (如 TNF-α、IL-1β)[16]。M2c 巨噬細(xì)胞的極化可被糖皮質(zhì)激素、IL-10 和 TGF-β 誘導(dǎo)，能夠分泌 IL-10 和基質(zhì)金屬蛋白酶，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)重塑和纖維化[17]。IL-6 和腺苷可誘導(dǎo) M2d 巨噬細(xì)胞的極化，其分泌轉(zhuǎn)化生長因子 β (transforming growth factor-β，TGF-β)和血管內(nèi)皮生長因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF) 促進(jìn)肉芽組織的形成[18]。以上研究結(jié)果表明，不能將巨噬細(xì)胞極化簡單地分為 M1 和 M2 型，不同巨噬細(xì)胞表型的極化以及在組織愈合中的作用仍需進(jìn)一步研究。

2.M1 巨噬細(xì)胞極化對腱骨愈合的影響：在炎癥早期階段，外周血、骨髓和滑膜組織中的 M0 巨噬細(xì)胞被募集到腱骨界面，主要極化為 M1 型巨噬細(xì)胞[19]。研究發(fā)現(xiàn)，腱骨界面損傷后的第 3 天 M1 巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)達(dá)到峰值，隨后逐漸下降[20]。M1 巨噬細(xì)胞可以吞噬細(xì)胞碎片，清除外來病原體，并通過分泌炎癥因子 (IL-1β、TNF-α 和 IL-6) 及趨化因子 [趨化因子配體 2 (chemokine ligand 2，CCL2)、抗人白介素 8 (anti-human IL-8，CXCL8)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1 (stromal cell derived factor 1，SDF-1)、CCL2、CXCL8、SDF-1]影響腱骨愈合。

(1) IL-1β 對腱骨愈合的影響：IL-1β 是 M1 巨噬細(xì)胞分泌的一種炎癥因子，在正常腱骨界面低表達(dá)，但在腱骨界面損傷后的瘢痕組織及周圍關(guān)節(jié)液中過表達(dá)，表明IL-1β 與腱骨愈合不佳密切相關(guān)[21]。體外實驗研究表明，IL-1β 可顯著降低肌腱干細(xì)胞中 Ⅰ 型膠原 mRNA 的表達(dá)，并促進(jìn)人肌腱細(xì)胞中環(huán)氧合酶-2 (cyclooxygenase-2，COX-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶 1 (matrix metallopeptidase 1，MMP1)、基質(zhì)金屬蛋白酶 3 (matrix metallopeptidase 3，MMP3)、COX-2、MMP1、MMP3 及前列腺素 E2 的表達(dá)，從而參與腱骨界面細(xì)胞外基質(zhì)的降解[21]。此外，IL-1β 還可通過核因子 κB (nuclear factor kappa-B，NF-κB) 信號通路影響腱骨愈合，具體機(jī)制為通過激活 IκB 激酶 (inhibitor of nuclear factor kappa-B，IKK) 復(fù)合體的磷酸化，從而降解 NF-κB 二聚體抑制劑 I-B，使 NF-κB 二聚體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，增加促炎因子基因的表達(dá)[21]。在對過表達(dá) IKK 小鼠腱骨界面的研究中發(fā)現(xiàn)，IKK 和 NF-κB 在肩袖撕裂患者肌腱組織和小鼠急性肩袖撕裂腱骨界面組織中過表達(dá)，腱骨界面 CD68+巨噬細(xì)胞大量浸潤和纖維軟骨明顯退變；與野生型或 IKK 過表達(dá)小鼠相比，敲除 IKK 基因的小鼠腱骨界面損傷后的愈合能力明顯增強(qiáng)，這表明激活 NF-κB 信號通路對腱骨愈合產(chǎn)生了有害影響，這可能與 M1 巨噬細(xì)胞浸潤及促炎細(xì)胞因子分泌增加有關(guān)[22]。進(jìn)一步研究表明，當(dāng)激活 NF-κB 信號通路時，腱骨界面轉(zhuǎn)錄因子 9 (tranion factor sox-9) 的表達(dá)減少，從而阻礙了間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstem cells，MSCs) 的成軟骨分化，這也表明腱骨愈合不良的關(guān)鍵可能在纖維軟骨層[23]。IL-1β 還能誘導(dǎo)腱骨界面破骨細(xì)胞的過度活化，導(dǎo)致腱骨愈合過程中骨質(zhì)丟失和再生不良[24]。綜上所述，IL-1β 通過激活 NF-κB信號通路，直接或間接的影響了腱骨愈合，NF-κB 信號通路是腱骨界面愈合不佳重要的信號通路。

(2) TNF-α 對腱骨愈合的影響：TNF-α 也是一種 M1 巨噬細(xì)胞在腱骨愈合過程中分泌的炎癥因子[25]。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α 在撕裂肩袖肌腱組織中的表達(dá)明顯高于正常肩袖肌腱組織，其可引起肌腱干細(xì)胞凋亡、基質(zhì)金屬蛋白酶合成增加及 Ⅰ 型膠原合成減少，從而導(dǎo)致腱骨界面細(xì)胞外基質(zhì)降解[26]。TNF-α 亦可激活 NF-κB 信號通路分泌大量促炎因子，加劇腱骨愈合過程中的炎癥反應(yīng)[27]。在 TNF-α 的誘導(dǎo)下，單核細(xì)胞可分化為破骨細(xì)胞，引起腱骨愈合過程中骨質(zhì)丟失[27]。研究表明，下調(diào) Lewis 大鼠腱骨愈合過程中TNF-α 的水平可減少 M1 巨噬細(xì)胞的數(shù)量，從而誘導(dǎo)纖維軟骨層的再生，最終提高腱骨愈合生物力學(xué)強(qiáng)度[28]。

(3) IL-6 對腱骨愈合的影響：IL-6 是 NF-κB 信號通路的下游產(chǎn)物，在肩袖撕裂的肌腱組織中大量表達(dá)，其在腱骨愈合中發(fā)揮雙重作用[29]。IL-6 具有抗炎和促炎的雙重特性，膜結(jié)合受體 IL-6R 介導(dǎo)其抗炎作用，可溶性的IL-6R 介導(dǎo)其促炎作用[30]。研究發(fā)現(xiàn)，雖然 IL-6 可以募集單核細(xì)胞并促進(jìn)其分化為破骨細(xì)胞，但同時也可以增強(qiáng)IL-1 受體拮抗劑和 IL-10 的釋放，以抑制炎癥[29]。在 IL-6基因敲除小鼠髕腱損傷模型中，TNF-α 水平高于野生型小鼠，Ⅲ 型膠原與 Ⅰ 型膠原的比值也升高，表明 IL-6 參與了肌腱修復(fù)過程中的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞外基質(zhì)的重塑，與對照組相比，IL-6 基因敲除小鼠促炎因子 TNF-α 上調(diào)，機(jī)械性能降低[31]。以上結(jié)果表明 IL-6 在腱骨愈合中的作用是復(fù)雜的，IL-6 對腱骨愈合的影響有待進(jìn)一步研究。

(4) 趨化因子對腱骨愈合的影響：M1 巨噬細(xì)胞不僅通過分泌炎癥因子調(diào)控腱骨愈合，還釋放趨化因子 (如CCL2、CXCL8、SDF-1) 將 MSCs 募集到損傷部位參與腱骨愈合[32]。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠肩袖腱骨愈合模型中，與對照組相比，鉆骨道修復(fù)組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs) 可通過肱骨大結(jié)節(jié)上的骨隧道浸潤到腱骨界面，促進(jìn)腱骨愈合[33]。Yang 等[34]通過紅外熒光成像跟蹤技術(shù)觀察外源性 MSCs 在小鼠腱骨愈合中的分布，建立腱骨愈合模型后，立即向肩關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射外源性 MSCs，研究發(fā)現(xiàn)，于注射后第 3 天腱骨界面出現(xiàn)大量的 MSCs 并促進(jìn)了腱骨愈合。這些研究均表明，無論是內(nèi)源性還是外源性 MSCs 均可以被募集到腱骨界面促進(jìn)腱骨愈合，在此過程中，M1 巨噬細(xì)胞釋放的趨化因子在募集MSCs 到損傷部位參與腱骨愈合的過程中發(fā)揮重要作用。

總之，在腱骨愈合早期，大量 M1 巨噬細(xì)胞浸潤可以吞噬細(xì)胞碎片和外來病原體，同時通過分泌趨化因子將MSCs 招募到腱骨界面，可促進(jìn)腱骨愈合，但一旦炎癥因子分泌過量，局部微環(huán)境的炎癥反應(yīng)就會加劇，這對腱骨愈合是有害的。因此，如何精準(zhǔn)調(diào)控巨噬細(xì)胞表型向有利腱骨愈合方法的極化是未來研究的方向和重點(diǎn)。

3.M2 巨噬細(xì)胞對腱骨愈合的影響：在肌腱骨愈合的炎癥期，巨噬細(xì)胞以 M1 型巨噬細(xì)胞為主，而在隨后的修復(fù)和重塑階段，以 CD206 和 Arg-1 為特征的 M2 型巨噬細(xì)胞占主導(dǎo)地位[35]。由于巨噬細(xì)胞的可塑性，組織愈合過程中 M2 巨噬細(xì)胞可能有兩方面的來源，一是 M1 巨噬細(xì)胞的復(fù)極化，二是 M0 巨噬細(xì)胞在 IL-4、IL-13 等刺激下誘導(dǎo)極化而來[35]。與 M1 巨噬細(xì)胞相比，M2 巨噬細(xì)胞吞噬病原體和產(chǎn)生促炎因子的能力有限，而其釋放 IL-4 和 IL-10 等抗炎因子的能力明顯增強(qiáng)，這些抗炎因子為腱骨愈合提供了合適的微環(huán)境[36]。體外研究表明，M2 巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基可促進(jìn) MSCs 成骨分化，但加入 IL-10 中和抗體后，這種成骨作用減弱，這表明 IL-10 是 M2 巨噬細(xì)胞發(fā)揮腱骨愈合功能的重要因子[37]。M2 巨噬細(xì)胞被認(rèn)為在炎癥后期逐漸取代 M1 巨噬細(xì)胞，通過分泌各種抗炎和生長因子來調(diào)節(jié)組織再生。雖然 M2 巨噬細(xì)胞通過抑制炎癥反應(yīng)促進(jìn)腱骨愈合的研究證據(jù)相當(dāng)充分，但 M2 巨噬細(xì)胞分泌的生長因子在肌腱 -骨愈合中的作用仍不明確且存在爭議。

(1) TGF-β 對腱骨愈合的影響：TGF-β 是一組具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的 TGF-β 超家族。TGF-β 可通過誘導(dǎo)M2 型巨噬細(xì)胞分泌 TGF-β1、TGF-β3 等生長因子形成正反饋調(diào)控作用[38]。研究發(fā)現(xiàn)，在瘢痕形成和組織再生中，TGF-β 起著決定性作用[39]。在大鼠急性肩袖損傷后腱骨愈合過程中，TGF-β1 在第 10 天時達(dá)到峰值，且富含纖維瘢痕組織，其中主要成分為 Ⅲ 型膠原，表明 TGF-β1 參與損傷腱骨界面纖維瘢痕組織的形成[40]。在大鼠急性肩袖損傷模型中，加入外源性 TGF-β1 可促進(jìn)腱骨愈合，提高生物力學(xué)強(qiáng)度，但同時亦增強(qiáng)了 Ⅲ 型膠原蛋白的轉(zhuǎn)錄水平，促進(jìn)纖維瘢痕組織的形成[41]。相反，在腱骨愈合過程中，具有促進(jìn)纖維軟骨形成的 TGF-β3 卻低表達(dá)[42]。研究發(fā)現(xiàn)，在腱骨界面加入 TGF-β3 可促進(jìn)腱骨界面纖維軟骨的再生，從而提高了愈合后的生物力學(xué)強(qiáng)度，且瘢痕形成較少。以上結(jié)果表明，TGF-β 對腱骨愈合具體重要的作用，通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞向 M2 型極化，促進(jìn) TGF-β3 的生成可能成為促進(jìn)腱骨愈合的有效策略。

(2) VEGF 和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 (bone morphogenetic protein type 2，BMP-2) 對腱骨愈合的影響：巨噬細(xì)胞釋放的生長因子 VEGF、BMP-2 也在組織再生中發(fā)揮重要作用[43]。在小鼠模型中，硫酸殼聚糖可誘導(dǎo) M2 巨噬細(xì)胞極化，從而促進(jìn)內(nèi)源性血管內(nèi)皮生長因子 VEGF 的表達(dá)，從而促進(jìn)缺血性疾病的血管新生[44]。研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs 來源的外泌體可誘導(dǎo) M2 巨噬細(xì)胞極化，增加 VEGF 的表達(dá)，促進(jìn)大鼠損傷腱骨界面周圍血管新生，有利于腱骨愈合[45]。此外，通過改變蜂窩狀二氧化鈦的表面形貌來調(diào)控 M2 巨噬細(xì)胞的極化可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放更多的BMP-2，以促進(jìn)小鼠脛骨植骨模型中的成骨[46]。以上結(jié)果表明，M2 型巨噬細(xì)胞分泌釋放 VEGF 和 BMP-2 分別促進(jìn)血管新生和成骨來提高腱骨愈合質(zhì)量，其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

三、總結(jié)與展望

腱骨界面結(jié)構(gòu)特殊，損傷后腱骨愈合過程復(fù)雜，常規(guī)手術(shù)修復(fù)后再撕裂率高。巨噬細(xì)胞是促進(jìn)腱骨愈合的重要靶點(diǎn)，貫穿于腱骨愈合的整個過程，在骨腱界面修復(fù)過程中，如何精準(zhǔn)調(diào)控巨噬細(xì)胞在時空順序向不同表型極化對骨腱界面的愈合至關(guān)重要。如何定向誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子充分發(fā)揮促進(jìn)腱骨愈合的作用是發(fā)揮臨床療效的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。未來的研究應(yīng)進(jìn)一步探索巨噬細(xì)胞調(diào)控腱骨愈合的機(jī)制，利用組織工程技術(shù)精確調(diào)控巨噬細(xì)胞表型，促進(jìn)腱骨界面愈合。