洪麗

(福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院 國(guó)家加工食品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心,福建 福州 350002)

頭孢菌素是一類(lèi)含有β內(nèi)酰胺環(huán)的抗生素,具有廣譜抗菌特性,毒副作用小,因此在人類(lèi)和動(dòng)物的疾病治療中廣泛應(yīng)用[1]。然而,在動(dòng)物飼養(yǎng)過(guò)程中,濫用頭孢菌素會(huì)導(dǎo)致藥物在動(dòng)物體內(nèi)積累,進(jìn)而產(chǎn)生超級(jí)細(xì)菌。這些細(xì)菌可能通過(guò)食物鏈進(jìn)入人類(lèi)體內(nèi),對(duì)人類(lèi)健康造成潛在威脅[2-4]。為此,全球各國(guó)已制定了動(dòng)物源性食品中頭孢菌素殘留的最大限量,其中包括中國(guó)、日本、美國(guó)和歐盟。在中國(guó)最新的獸藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)(GB 31650—2019)中,規(guī)定了頭孢氨芐、頭孢喹肟和頭孢噻呋在動(dòng)物源性食品中的限量分別為0.2,0.05和1.0 mg/kg。然而,該標(biāo)準(zhǔn)只針對(duì)這三種頭孢菌素設(shè)定了限量,而其他頭孢菌素則沒(méi)有相應(yīng)的規(guī)定。此外,該標(biāo)準(zhǔn)只適用于肉類(lèi),未對(duì)雞蛋中的頭孢菌素殘留限量做出明確規(guī)定。然而,中國(guó)是雞蛋生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó),因此建立一種準(zhǔn)確、高效地同時(shí)檢測(cè)雞蛋中多種頭孢菌素的方法具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

目前,有多種方法可用于頭孢菌素的檢測(cè)。其中,高效液相色譜法[5-13]和毛細(xì)管電泳法[14]的靈敏度較低且易受干擾;電化學(xué)法[15]和流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法[16-18]的效率較低且重現(xiàn)性較差。相比之下,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合固相萃取技術(shù),具有更高的靈敏度和更強(qiáng)的抗干擾能力,同時(shí)前處理方式更為簡(jiǎn)單,已成為目前食品檢測(cè)行業(yè)中最廣泛使用的分析方法?，F(xiàn)有的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法[19-22]針對(duì)的主要是肉類(lèi)、水產(chǎn)品、牛奶蜂蜜等基質(zhì),缺少雞蛋中頭孢菌素的測(cè)定方法,文獻(xiàn)也未見(jiàn)報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,結(jié)合固相萃取技術(shù),建立了雞蛋中11種頭孢菌素的測(cè)定方法,為今后雞蛋中頭孢菌素的監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

頭孢氨芐(CAS號(hào):15686-71-2)、頭孢拉定(CAS號(hào):38821-53-3)、頭孢唑林(CAS號(hào):25953-19-9)、頭孢哌酮(CAS號(hào):62893-19-10)、頭孢乙腈(CAS號(hào):10206-21-0)、頭孢匹林(CAS號(hào):21593-23-7)、頭孢洛寧(CAS號(hào):15686-71-2)、頭孢喹肟(CAS號(hào):98753-19-6)、頭孢噻肟(CAS號(hào):63527-52-6)、去乙?；^孢匹林(CAS號(hào):38115-21-8)、頭孢噻呋(CAS號(hào):80370-57-6)均購(gòu)自于天津阿爾塔公司,質(zhì)量濃度均為100 μg/mL的液體單標(biāo);所用有機(jī)試劑均為色譜純;水為一級(jí)水。

1.2 儀器與設(shè)備

液質(zhì)聯(lián)用儀:1290液相色譜(安捷倫)-5500(AB SCIEX)串聯(lián)質(zhì)譜;稱(chēng)量天平(JY3003,1mg感量,廣州市予華儀器有限公司);渦旋器(MixMax,ABSON公司);超聲波洗器(HU3120B,恒奧有限公司);離心機(jī)(4R Pro,賽默飛公司); UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×150 mm,1.8 μm,沃特世公司);MAX陰離子固相萃取柱(3 mL/60 mg,沃特世公司)。

1.3 試驗(yàn)部分

1.3.1 色譜條件

色譜柱:UPLC HSS T3(2.1 mm×150 mm,1.8 μm,Waters 公司);流動(dòng)相A:0.02 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸),流動(dòng)相B:甲醇;流速:0.3 mL/min,洗脫程序:0～6.00 min,5%B～90%B;6.00～8.00 min,90%B～90%B;8.00～8.01 min,90%B～5%B;8.01～10.00 min,5%B～5%B。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧離子源(ESI+);掃描模式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);離子化電壓:5 500 V;Gas1氣壓:0.345 MPa(50 psi);Gas2氣壓:0.345 MPa(50 psi);反吹氣氣壓:0.241 MPa(35 psi);離子源溫度:600 ℃;質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)中間液及標(biāo)準(zhǔn)系列曲線(xiàn)的配制

準(zhǔn)確移取各標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL至10 mL容量瓶,以甲醇稀釋得到11種頭孢菌素質(zhì)量濃度均為1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液,再準(zhǔn)確分取適量的標(biāo)準(zhǔn)中間液,以10%乙腈溶液稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.5,1.0,2.0,5.0,10.0和50.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作系列,待測(cè)。

1.3.4 樣品前處理

稱(chēng)取雞蛋樣品2.0 g,加入5 mL 60%乙腈溶液置于超聲波中提取30 min后,以5 000 r/min離心并轉(zhuǎn)移上層清液,殘?jiān)偌尤? mL 提取液再提取1次,合并兩次提取液,經(jīng)采用3 mL甲醇、3 mL水活化后的MAX柱凈化,3 mL水和3 mL甲醇淋洗后,以 5%甲酸甲醇5 mL溶液洗脫,收集洗脫液于30 ℃水浴中氮吹至干,加入1.0 mL的10%乙腈溶液溶解并混勻,過(guò)0.22 μm PTFE濾膜后UHPLC/MS/MS測(cè)試。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

吸取100 μL混合中間液,以50%乙腈稀釋得到200 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,先進(jìn)行Q1母離子掃描,得到11種頭孢化合的母離子[M+H]+,再進(jìn)行碎片離子掃描Q2獲得相應(yīng)的碎片離子,選取豐度最高產(chǎn)物離子作為定量離子,次高的作為定性離子,最后進(jìn)行MRM優(yōu)化每個(gè)離子對(duì)的去簇電壓和碰撞能,優(yōu)化后的參數(shù)見(jiàn)表1。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的優(yōu)化

對(duì)比了常用的BEH C18和HSS T3兩種色譜柱對(duì)11種頭孢類(lèi)化合物的分離效果。發(fā)現(xiàn)強(qiáng)極性化合物去乙?；^孢在HSS T3色譜柱中具有更強(qiáng)的保留,而在BEH C18幾乎不保留,且多數(shù)頭孢菌素化合物的峰形也更尖銳,分離度也更好,因此采用 HSS T3作為色譜柱。

2.2.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

分別對(duì)比了水(含0.1%甲酸)-甲醇、水(含0.1%甲酸)-乙腈、0.02 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)-甲醇、0.02 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)-乙腈4種流動(dòng)相的效果。結(jié)果顯示,采用甲醇作為有機(jī)相時(shí),多數(shù)頭孢菌素的響應(yīng)更好;當(dāng)含有乙酸銨時(shí),頭孢菌素化合物的峰更窄且更尖銳,分離度也更好。因此,選擇0.02 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)-甲醇作為流動(dòng)相體系,再進(jìn)行梯度洗脫優(yōu)化,11種頭孢菌素化合物的總流離子圖見(jiàn)圖1。

1.去乙?；^孢匹林;2.頭孢匹林;3.頭孢喹肟;4.頭孢氨芐;5.頭孢拉定;6.頭孢洛寧;7.頭孢乙腈;8.頭孢噻肟;9.頭孢唑林;10.頭孢哌酮;11.頭孢噻呋。

2.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇

文獻(xiàn)報(bào)道的提取溶劑主要為乙腈-水溶液。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇陰性雞蛋樣品進(jìn)行2.0 μg/kg的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),對(duì)比了50%乙腈水(體積比)～90%乙腈水(體積比)作為提取溶劑的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著提取液中水相比例增大,頭孢菌素的回收率也逐漸提高,當(dāng)水相比例達(dá)到40%時(shí),11種頭孢菌素的回收率達(dá)到高點(diǎn),回收率為85.6%～95.8%;而當(dāng)水相超過(guò)40%時(shí),回收率反而有所下降,這是由于當(dāng)水相高于40%時(shí),乙腈沉淀蛋白的能力降低,所得的提取液也更渾濁,基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)導(dǎo)致回收率下降,最終選擇60%乙腈作為提取溶劑。

2.3.2 凈化方式的選擇

由于雞蛋樣品中含有大量的脂肪、磷脂等雜質(zhì),需盡量除去以減少對(duì)儀器的污染以及降低基質(zhì)效應(yīng)。因此,選用陰性雞蛋為基質(zhì),分別進(jìn)行2.0 μg/kg的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),對(duì)比了C18、HLB、MAX三種凈化小柱對(duì)結(jié)果的影響。結(jié)果顯示采用C18和HLB小柱凈化時(shí),7/11(63.6%)化合物的平均回收率在50%以下,這是由于提取溶劑為60%的乙腈,而頭孢菌素極性均較強(qiáng),無(wú)法在C18和HLB小柱上保留;而采用MAX小柱時(shí),11種頭孢菌素的平均回收率均在80%以上,這是由于頭孢菌素類(lèi)化合物大部分含有羧基,呈弱酸性,而MAX除了具有陰離子交換作用,還具有HLB和C18小柱的反向吸附功能。因此,最終選擇MAX小柱作為凈化柱。

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.4.1 線(xiàn)性范圍、檢出限和定量限

以頭孢菌素的峰面積為Y軸,濃度為X軸進(jìn)行線(xiàn)性回歸,發(fā)現(xiàn)11種目標(biāo)物在0.5～50.0 ng/mL質(zhì)量濃度范圍具有較好的線(xiàn)性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R2>0.99。以3倍信噪比對(duì)應(yīng)的濃度為檢出限、10倍信噪比對(duì)應(yīng)的濃度為定量限,11種頭孢化合物在的檢出限為0.2 μg/kg,定量限為0.5 μg/kg(結(jié)果見(jiàn)表2),說(shuō)明該方法具有較高的靈敏度。

表2 11種頭孢菌素的線(xiàn)性方程、檢出限和定量限

2.4.2 準(zhǔn)確度與精密度

在陰性雞蛋樣品中進(jìn)行1.00,2.00,10.0 μg/kg的加標(biāo)回收試驗(yàn),平行實(shí)驗(yàn)n=6。從表3可見(jiàn),11種頭孢化合物的平均回收率在81.7%～97.1%,RSD在2.8%～6.8%,說(shuō)明開(kāi)發(fā)的方法準(zhǔn)確度與精密度均較好,說(shuō)明該方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度,可滿(mǎn)足分析要求。

表3 準(zhǔn)確度與精密度(n = 6)

3 結(jié)論

采用UHPLC-MS/MS結(jié)合MAX固相萃取技術(shù)建立了雞蛋中11種頭孢菌素含量的同步測(cè)定方法。在最優(yōu)條件下進(jìn)行方法驗(yàn)證,證明了建立的方法簡(jiǎn)單高效、靈敏度高、準(zhǔn)確度和精密度好,適用于雞蛋中頭孢菌素的測(cè)定。