蔣金芳,杜宇,劉琪,陳紹璞,王志浩

(中國(guó)刑事警察學(xué)院 法醫(yī)病理教研室,遼寧 沈陽(yáng) 110854)

苯二氮卓類藥物(Benzodiazepines,BZDs)具有抗焦慮、肌松、催眠、抗驚厥和鎮(zhèn)靜作用,其大量衍生物及其不同的藥理作用導(dǎo)致此類化合物被廣泛應(yīng)用?；颊邽榱巳〉弥委熜Ч娱L(zhǎng)使用時(shí)間,往往會(huì)導(dǎo)致苯二氮卓類藥物的濫用。近年來(lái),一類被稱為苯二氮卓類策劃藥(Designer Benzodiazepines,DBZDs)的新型精神類活性藥(New Psychoactive Substances,NPS)因其可獲得性在非法藥物市場(chǎng)中受到關(guān)注。DBZDs中最活躍的化合物之一便是阿普唑侖(Alprazolam)的衍生物氯硝唑侖(Clonazolam)[1]。2015年,在瑞典查獲毒品中,歐盟毒品預(yù)警系統(tǒng)檢索到關(guān)于氯硝唑侖的信息。此后在全球非法藥物緝獲中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)氯硝唑侖,并且毒物信息中心關(guān)于氯硝唑侖相關(guān)的查詢也有所增加[2]。本文對(duì)氯硝唑侖的應(yīng)用、檢測(cè)以及鑒別檢驗(yàn)等進(jìn)行系統(tǒng)綜述,以期為氯硝唑侖的相關(guān)研究提供參考。

1 氯硝唑侖概述

氯硝唑侖(Clonazolam,CAS-33887-02-4)于1971年首次合成,屬于苯二氮卓類化合物中最活躍的化合物之一[3]。氯硝唑侖化學(xué)式為C17H12CIN5O2,是注冊(cè)藥物氯硝西潘的三唑類似物,其核心苯二氮卓骨架中含有氯、硝化和甲基化的三唑取代基,摩爾質(zhì)量為353.9 g/mol[4];沸點(diǎn)為(576.0±60.0) ℃;在水中的溶解度為0.042 6 mg/mL。

氯硝唑侖具有催眠、抗焦慮、鎮(zhèn)靜、肌肉松弛和抗驚厥作用,可被用作全身性癲癇的初期治療藥物[5]。氯硝唑侖在20～44歲的年輕人中濫用現(xiàn)象很普遍,以30～34歲的男性為主[6]。氯硝唑侖常存在于片劑、膠囊、丸劑、溶液中,使用劑量為0.5～4 mg[7]。

氯硝唑侖與大腦中的γ-氨基丁酸A受體(GABA-A)結(jié)合。γ-氨基丁酸(GABA)是一種活躍于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。在三種GABA受體亞型A、B、C中,GABA-A是苯二氮卓類藥物作用的受體[8]。當(dāng)氯硝唑侖與GABA-A受體結(jié)合時(shí),氯離子通道的構(gòu)象發(fā)生變化,氯離子通道頻繁開放,導(dǎo)致氯離子的電導(dǎo)性增強(qiáng),在突觸后間隙中高濃度的氯離子降低了膜電位,進(jìn)而降低了神經(jīng)元放電,導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制,主要涉及的神經(jīng)區(qū)域包括杏仁核和網(wǎng)狀激活系統(tǒng)[9-12]。GABA-A受體可按其α亞基類型細(xì)分為α1、α2、α3和α5。GABA-A-α1受體負(fù)責(zé)鎮(zhèn)靜,GABA-A-α2受體引起肌肉松弛[13]。從生理學(xué)角度來(lái)看意味著機(jī)體出現(xiàn)鎮(zhèn)靜和放松。

氯硝唑侖具有很強(qiáng)的藥效,服用氯硝唑侖后能引起愉快的印象并消除恐懼,低劑量服用可引起明顯的鎮(zhèn)靜和失憶。服藥后30～40 min內(nèi)效果緩慢增加,產(chǎn)生輕微放松感、鎮(zhèn)靜感和所謂的“懸浮感”,大約1～1.5 h后達(dá)到效果高峰[14]。

氯硝唑侖的藥代動(dòng)學(xué)仍處于研究階段。相關(guān)研究認(rèn)為,一般情況下氯硝唑侖的半衰期為3.6 h[15]。由于在組織中快速再分布,氯硝唑侖主要通過(guò)肝臟系統(tǒng)代謝,因此在老年人和肝損傷患者中半衰期較長(zhǎng)[5]。大多數(shù)苯二氮卓類藥物體內(nèi)作用時(shí)間主要取決于其活性代謝物的代謝速率,氯硝唑侖作用持續(xù)時(shí)間為6～10 h[16]。氯硝唑侖呈中等脂溶性,可被酶分解成代謝物,包括還原(8-氨基氯硝唑侖)、乙?；?8-乙酰氨基氯硝唑侖)、羥基化(羥基氯硝唑侖)和葡萄糖醛酸化[17]。本體和代謝物均經(jīng)腎臟通過(guò)尿液排出。

苯二氮卓類策劃藥中許多是制藥行業(yè)幾十年前開發(fā)但從未上市,而其他多是在秘密實(shí)驗(yàn)室合成后出現(xiàn)在非法藥物市場(chǎng)或在互聯(lián)網(wǎng)上非法銷售,未被任何國(guó)家批準(zhǔn)用于醫(yī)療用途[7]。目前,氯硝唑侖在英國(guó)屬C類藥物,持有、生產(chǎn)或供應(yīng)都是非法行為[5];美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)尚未批準(zhǔn)氯硝唑侖用于治療[1]。

2 氯硝唑侖的檢測(cè)

苯二氮卓類策劃藥是藥物輔助性侵犯(Drug-facilitated Sexual Assault,DFSA)案件的常用藥物,在低劑量下具有高效活性,快速分布,并且可以容易地口服給藥。此外,DFSA犯罪的典型特征是受害者延遲報(bào)案或選擇沉默,原因或是由于藥物產(chǎn)生健忘特性,或是受害者恐懼、羞恥的心理特點(diǎn)[18]。因此對(duì)藥物檢測(cè)帶來(lái)了額外的挑戰(zhàn)。氯硝唑侖半衰期僅為3.6 h,代謝和排泄迅速。體液內(nèi)低濃度含量和短時(shí)間范圍需要采用高靈敏度的分析方法來(lái)檢測(cè)本體及其代謝物。

氯硝唑侖的檢測(cè)可以提取現(xiàn)場(chǎng)發(fā)現(xiàn)的可疑藥劑、粉末、受害者飲用過(guò)的剩余液體等,還需提取服用者血液、尿液、毛發(fā)、指甲等常規(guī)檢材[19]。其中尿液和血液在臨床檢測(cè)中最常用,其他組織檢材則作為備選。

為獲得最佳檢測(cè)結(jié)果,在檢測(cè)前通常需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理。由于許多苯二氮卓類策劃藥及其相應(yīng)的I期代謝物在其II期代謝過(guò)程中與葡萄糖醛酸結(jié)合,因此通常在樣品制備前進(jìn)行結(jié)合步驟,以增強(qiáng)對(duì)非結(jié)合分析物的檢測(cè)并提高整體靈敏度[20]。

樣品處理方法取決于分析物的理化性質(zhì)以及特定分析所需的靈敏度和特異性水平[21]?？梢允褂玫鞍踪|(zhì)沉淀法、液-液提取法(LLE)、鹽析輔助液-液提取法(SALLE)、固相提取(SPE)或微波輔助提取(MAE)等方法提取血樣[22-23]。尿液樣本的提取可通過(guò)固相萃取或液-液提取(LLE)[21]。與血液和尿液基質(zhì)相比,毛發(fā)在提取目標(biāo)分析物之前需要多步預(yù)處理程序。碎片化的毛發(fā)可提高回收率,毛發(fā)分割粉碎后還需要去污處理,隨后將粉碎或分段的頭發(fā)在不同溶劑下混合孵化24 h左右[24]。

精神活性類藥物的檢測(cè)和鑒定方法通常由兩個(gè)分析步驟組成,即初篩實(shí)驗(yàn)和確證實(shí)驗(yàn)[21-25]。使用初步篩選方法來(lái)篩選陽(yáng)性樣本,從而進(jìn)行后續(xù)確證檢測(cè)。

紅外光譜可對(duì)疑似氯硝唑侖的化合物進(jìn)行檢驗(yàn)。何思陽(yáng)等[26]研究發(fā)現(xiàn),在選定測(cè)試條件下,氯硝唑侖在1 700～500 cm-1中紅外區(qū)域內(nèi)有明顯特征峰,1 512和1 351 cm-1處出現(xiàn)芳香族NO2的反稱和對(duì)稱吸收峰。

基于免疫學(xué)的NPS篩選檢測(cè)原理是利用抗原抗體特異性結(jié)合來(lái)確定氯硝唑侖或排除其他NPS。免疫學(xué)檢測(cè)在識(shí)別苯二氮卓類策劃藥中具有成功進(jìn)展,包括酶增強(qiáng)免疫法(EMIT)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、同質(zhì)酶免疫分析(HEIA)、動(dòng)態(tài)微粒免疫測(cè)定(KMI)和克隆酶供體免疫測(cè)定(CEDIA)。由于其高效便捷,根據(jù)苯二氮卓類策劃藥在結(jié)構(gòu)上與母體化合物類似這一特點(diǎn),使用特異性結(jié)合抗體可提高檢測(cè)靈敏度。Bergstrand等[27]研究發(fā)現(xiàn),在4種常見的免疫分析方法(CEDIA、HEIA、EIT II Plus和KIMS II)中對(duì)含有氯硝唑侖的尿液進(jìn)行檢測(cè),氯硝唑侖在每種免疫分析中的交叉反應(yīng)分別為118%,261%,49%和99%。免疫學(xué)檢測(cè)法便捷快速,適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)或初篩檢測(cè),但需要實(shí)驗(yàn)室同步開發(fā)與新結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合的抗體,由于開發(fā)時(shí)間和成本原因,免疫學(xué)檢測(cè)法無(wú)法全面推廣應(yīng)用。

色譜法通常用于免疫分析法初步篩選后的確證檢測(cè),目前是實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測(cè)技術(shù)。研究顯示,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)是進(jìn)行驗(yàn)證性檢測(cè)的常用方法[28]。大多數(shù)應(yīng)用報(bào)告使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),不需要在氣相色譜-質(zhì)譜分析前進(jìn)行繁瑣耗時(shí)的樣品制備。當(dāng)常規(guī)臨床毒物檢測(cè)到免疫分析陽(yáng)性結(jié)果并通過(guò)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS-MS)或類似技術(shù)進(jìn)行確認(rèn)檢測(cè)時(shí)觀察到陰性結(jié)果,應(yīng)考慮可能為苯二氮卓類策劃藥。通過(guò)LC-MS/MS分析鑒定血液、尿液中的氯硝唑侖。氯硝唑侖在母體化合物在尿液中的濃度較低(7～23 ng/mL)[29]。由于氯硝唑侖濃度極低并且半衰期只有3.6 h,若無(wú)法在攝入后3 h內(nèi)進(jìn)行毒理學(xué)試驗(yàn),則需要對(duì)氯硝唑侖的活性代謝物進(jìn)行檢測(cè)。

Meyer等[30]通過(guò)納米液相色譜高分辨質(zhì)譜(HRMS)鑒定尿液中氯硝唑侖及主要代謝物發(fā)現(xiàn),8-氨基氯硝唑侖活性最高。因此,對(duì)氯硝唑侖篩查方法可集中于主要代謝物。

Kong等[4]利用液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道質(zhì)譜(LC-Q-Orbitrap MS)來(lái)分析氯硝唑侖在人肝微粒體和斑馬魚模型的主要代謝產(chǎn)物及代謝途徑。該研究基于LC-Q-Orbitrap MS分析結(jié)果,在人肝微粒體和斑馬魚中均檢測(cè)到M1結(jié)構(gòu),通過(guò)碎片離子結(jié)構(gòu)證明M1為氯硝唑侖硝基還原生成的代謝物并建議將其硝基還原產(chǎn)物M1結(jié)構(gòu)作為檢測(cè)標(biāo)志物。此外,該研究采用的斑馬魚模型能良好地模擬人體代謝,對(duì)未來(lái)苯二氮卓類策劃藥代謝產(chǎn)物篩選的實(shí)驗(yàn)研究提供了參考。

3 氯硝唑侖濫用的危害

作為近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的精神類活性藥,氯硝唑侖在低劑量下表現(xiàn)出極高的活性,常規(guī)劑量服用有鎮(zhèn)靜和記憶消除的作用,在急性中毒時(shí)表現(xiàn)為長(zhǎng)時(shí)間昏迷、肌張力降低等。氯硝唑侖與酒精或其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制劑聯(lián)用或引起更為嚴(yán)重的中毒后果。

氯硝唑侖過(guò)量服用致急性中毒表現(xiàn)為深度昏迷和輕度竇性心動(dòng)過(guò)速[31-32],多數(shù)患者可在24 h內(nèi)恢復(fù)。關(guān)于氯硝唑侖過(guò)量服用致中毒的病例報(bào)告數(shù)量有限,因?yàn)槭褂谜哒J(rèn)為他們攝入的是處方類苯二氮卓類藥物,而非強(qiáng)效類似物。Syrjanen等[2]報(bào)道多起氯硝唑侖過(guò)量服用中毒的案例。一名男性和三名女性在服用苯二氮卓類藥物后被送往醫(yī)院。其中3例出現(xiàn)竇性心動(dòng)過(guò)速,格拉斯哥評(píng)分(GCS)為8～13。其中2例經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)氯硝唑侖及其代謝物8-氨基氯硝唑侖,質(zhì)量濃度分別為0.2～2.1 mg/L和5.9～19.1 mg/L。給予鎮(zhèn)靜通氣治療,觀察恢復(fù)正常意識(shí)狀態(tài)。Sommerfeld-klatta等[7]報(bào)道一起26歲女性因氯硝唑侖意外中毒而被收治的案例。該女子因患急性支氣管炎持續(xù)咳嗽難以入睡故服用氯硝唑侖緩解,入院前4 h服用了10 mg 非正規(guī)渠道購(gòu)得的氯硝唑侖粉劑,超過(guò)了推薦劑量的20倍。該患者無(wú)慢性病,之前未服用任何精神活性物質(zhì)?；颊呒毙灾卸竞蟊憩F(xiàn)為持續(xù)深度昏迷,竇性心動(dòng)過(guò)速(100～110 次/min)。入院后在醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的初步毒理學(xué)試驗(yàn)顯示,通過(guò)免疫學(xué)定性試驗(yàn)檢測(cè)到尿液中存在苯二氮卓類藥物,GC-FID在血液中未檢測(cè)出乙醇。LC-MS/MS分別檢測(cè)4,8,12 h節(jié)點(diǎn)血液中氯硝唑侖質(zhì)量濃度,分別為0.077,0.015和0.009 mg/L。經(jīng)過(guò)治療,患者出院后無(wú)任何后遺癥,無(wú)精神障礙也無(wú)成癮表現(xiàn)。

氯硝唑侖中毒致死者,死亡機(jī)制與氯硝唑侖引起的腦部和呼吸抑制作用一致。尸體檢驗(yàn)可見大腦有明顯的水腫表現(xiàn),腦回變寬腦溝變窄;肺臟表現(xiàn)為中度肺充血和水腫,氣管和支氣管內(nèi)有大量泡沫狀液體;肝臟、脾臟等臟器異常改變不明顯[33]。在未知氯硝唑侖的情況下,實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)具有難度。尸體檢驗(yàn)后采集死者靜脈血、尿液送檢進(jìn)行毒物檢測(cè)。Moore等[33]報(bào)道首例單獨(dú)過(guò)量服用氯硝唑侖致死的案例。14歲男性在服用大量阿普唑侖后,次日發(fā)現(xiàn)已經(jīng)死亡。法醫(yī)學(xué)尸體檢驗(yàn)以及病理分析結(jié)果確定大腦和呼吸抑制符合急性氯硝唑侖中毒的死亡機(jī)制。在最初的血液檢測(cè)中未檢出苯二氮卓類藥物,包括預(yù)期的阿普唑侖。在收到苯二氮卓類藥物的假陽(yáng)性結(jié)果后,使用LC-MS/MS對(duì)氯硝唑侖的代謝物8-氨基氯硝唑侖進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示死者血液8-氨基氯硝唑侖的質(zhì)量濃度為140 ng/mL。

除中毒外,還可導(dǎo)致氯硝唑侖相關(guān)毒品促成的性侵害案件發(fā)生。Skov等[34]在2022年的一項(xiàng)全球藥物輔助性侵犯的回顧性研究中統(tǒng)計(jì),存在3起使用氯硝唑侖達(dá)成的性侵害案件。

4 總結(jié)與展望

苯二氮卓類策劃藥的濫用逐漸引起人們的關(guān)注。由于動(dòng)態(tài)NPS市場(chǎng)的快速更新,常用的快速篩查精神活性藥物的免疫測(cè)定往往無(wú)法檢測(cè)到NPS;LC-MS/MS或GC-MS檢測(cè)結(jié)果譜圖可能不包含最新的NPS,在很大程度上導(dǎo)致漏檢。NPS市場(chǎng)的日益復(fù)雜突出了不斷加強(qiáng)檢測(cè)、識(shí)別和定量此類物質(zhì)的最先進(jìn)分析策略的必要性。因此,使用多種檢測(cè)手段綜合檢測(cè)是鑒別此類化合物的關(guān)鍵。除此之外,涉及藥物輔助性侵害案件中,對(duì)可疑化合物的準(zhǔn)確分析檢測(cè)結(jié)果至關(guān)重要,應(yīng)對(duì)偵查人員或醫(yī)務(wù)人員進(jìn)行培訓(xùn),充分調(diào)查案情,及時(shí)收集受害者的生物檢材進(jìn)行檢查。同時(shí),對(duì)此類藥物檢測(cè)的數(shù)據(jù)譜圖應(yīng)及時(shí)更新并添加到相關(guān)檢索數(shù)據(jù)庫(kù),可以更快地進(jìn)行識(shí)別,對(duì)相關(guān)案例的匯總分析同樣有助于確定當(dāng)前的藥物趨勢(shì),并為臨床治療以及毒物檢測(cè)提供參考。