郭君鑫，林天寶，呂志強(qiáng)＊

（1. 畫水君鑫家庭農(nóng)場(chǎng)，浙江 東陽(yáng) 322102； 2. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 蠶桑與茶葉研究所，浙江 杭州 310021）

便秘是現(xiàn)代人群中比較常見的一種腸道疾病，特別是在老年人群多發(fā)，同時(shí)給患者帶來(lái)一些并發(fā)癥［1］。近年來(lái)，伴隨著現(xiàn)代飲食結(jié)構(gòu)的改變和生活節(jié)奏加快，便秘的發(fā)病率顯著升高，嚴(yán)重影響著國(guó)民的身體健康［2］。中醫(yī)藥已被證實(shí)在臨床上具有良好的便秘預(yù)防與治療療效。

桑椹（Fructus Mori），又名桑果、桑棗、文武實(shí)等，為桑屬?？粕涞某墒旃麑?shí)，是一種美味、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的漿果類水果；同時(shí)，桑椹還是我國(guó)一味傳統(tǒng)中藥材，入藥始載于唐代《新修本草》；味甘、性寒；歸心、肝、腎經(jīng)［3］。桑椹，具有滋陰補(bǔ)血、生津潤(rùn)腸、填精補(bǔ)腦等功效；具有良好的抗氧化、抗微生物、抗高血糖、抗高脂血癥、抗炎、抗癌作用，常用于眩暈耳鳴，心悸失眠，須發(fā)早白，津傷口渴，內(nèi)熱消渴，血虛便秘［4］。

桑椹已經(jīng)被臨床上證實(shí)具有治療便秘的作用，但其主要活性成分、作用靶點(diǎn)與調(diào)控機(jī)制等尚不明確。因此，本研究以桑椹為研究對(duì)象，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選桑椹治療便秘的有效成分及潛在靶點(diǎn)，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，得到桑椹分子作用機(jī)制，為進(jìn)一步理論研究及臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 數(shù)據(jù)來(lái)源

1.1 桑椹化學(xué)成分篩選及靶點(diǎn)獲取

從TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入“桑椹”，檢索藥物化學(xué)組分及該組分靶基因，以口服生物利用度（OB）＞30%，并且化合物類藥性（DL）＞0.1為篩選條件，檢索桑椹的主要化學(xué)成分并收集化合物的相應(yīng)靶點(diǎn)。

1.2 便秘相關(guān)靶點(diǎn)的獲得

從Gene Cards、OMIM共2個(gè)疾病相關(guān)靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索便秘相關(guān)靶點(diǎn)，篩選關(guān)鍵詞設(shè)置為“constipation”，設(shè)定物種為“Homosapiens”，取2數(shù)據(jù)庫(kù)共性靶點(diǎn)為便秘相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)交集

利用R語(yǔ)言，對(duì)“1.1”與“1.2”所得到的桑椹預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)集合的靶點(diǎn)名稱，取交集，得到桑椹治療便秘的靶點(diǎn)。

1.4 構(gòu)建藥材-化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

將上述分析得到的桑椹作用便秘主要化合物以及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，導(dǎo)入Cytoscapev3.9.1中進(jìn)行可視化，得到藥材-化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖，并對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析。

1.5 靶蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選到的靶點(diǎn)蛋白于STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/）進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建，選擇“Homo Sapiens”為分析的生物體，置信度得分設(shè)置為最高置信度（0.900）之后進(jìn)行整合和評(píng)估。

1.6 GO與KEGG分析

在DAVID網(wǎng)站（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行靶點(diǎn)的基因本體（GO）功能分析和KEGG（京都基因與基因組百科全書，Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 主要成分信息

從TCMSP（https：//old.tcmsp- e.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入“桑椹”，設(shè)置口服生物利用度（OB）＞30%”、“DL＞0.1”，得到桑椹中12種活性成分，見表1，共獲得370個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。從Gene Cards、OMIM共2個(gè)疾病相關(guān)靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索便秘相關(guān)靶點(diǎn)452個(gè)。通過取交集，共找到桑椹化合物治療便秘靶點(diǎn)211個(gè)。

將桑椹與交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape中，得到藥材-化合物-靶點(diǎn)-疾病通路網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖1。圖中節(jié)點(diǎn)數(shù)量有214個(gè)，349條邊，平均相鄰節(jié)點(diǎn)數(shù)量為3.24。在化合物中節(jié)點(diǎn)最大為quercetin 和oleic acid，提示桑椹主要通過quercetin和oleic acid調(diào)控靶點(diǎn)發(fā)揮治療便秘的功效。此網(wǎng)絡(luò)中度值排名前5 的靶點(diǎn)為PTGS1、RXRA、NCOA2、HSP90AA1和PPARG。

圖1 化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 1 Network of ingredients，targets，and disease

2.2 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）及hub蛋白的提取

將211 個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)，以互作分?jǐn)?shù)（Interaction score）≥0.9為參照，獲取PPI網(wǎng)絡(luò)，共獲取39個(gè)節(jié)點(diǎn)，100條邊，平均度值為1.59，見圖2。通過Degree分析識(shí)別篩選其中的hub蛋白，hub蛋白包括：AR、AKT1、BCL2、CREBBP、FABP1、HMGCR、RXRA、PPARD、PPARG、MMP1、MMP2、TIMP1、TIMP2。

圖2 桑椹-便秘靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)Fig. 2 Ppi network of targets of mulberry fruits for constipation therapy

2.3 靶點(diǎn)GO與KEGG富集分析

在線對(duì)于桑椹治療便秘的作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO與KEGG 富集分析。通過GO 富集分析，211 靶點(diǎn)顯著富集于127 個(gè)GO 分類（P＜0.05），其中，分子功能（MF）29個(gè)、細(xì)胞組分（CC）12個(gè)、生物學(xué)過程（BP）86個(gè)，3 個(gè)分類排名前10 位分類如圖3 所示。分子功能分類，靶點(diǎn)主要富集于鋅離子結(jié)合（zinc ion binding）、氧化還原酶活性（oxidoreductase activity）與酶結(jié)合（enzyme binding）；細(xì)胞組分主要富集于液泡（cytosol）、細(xì)胞質(zhì)膜（plasma membrane）和膜的整體成分（integral component of membrane）；生物學(xué)過程主要富集于藥物反應(yīng)（response to drug）、炎癥應(yīng)答（inflammatory response）和凋亡過程的負(fù)調(diào)控（negative regulation of apoptotic process）。

圖3 桑椹防治便秘作用靶點(diǎn)GO富集分析柱狀圖Fig. 3 Histogram of GO enrichment analysis of targets of mulberry fruits for constipation therapy

KEGG功能注釋富集分析結(jié)果顯示，211個(gè)作用靶點(diǎn)顯著富集到28條信號(hào)通路（P＜0.05），前20條信號(hào)通路如圖4 所示?？梢钥闯觯琍PAR 信號(hào)通路（PPAR signaling pathway）、酒精性肝?。╝lcoholic liver disease）、糖尿病并發(fā)癥AGR 受體信號(hào)通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化（lipid and atherosclerosis）、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、酪氨酸代謝（tyrosine metabolism）、脂肪細(xì)胞內(nèi)脂類分解調(diào)控（regulation of lipolysis in adipocytes）及藥物代謝-細(xì)胞色素P450（drug metabolism-cytochrome P450）等。

圖4 桑椹防治便秘作用靶點(diǎn)KEGG富集分析氣泡圖Fig. 4 Bubble diagram of KEGG functional enrichment analysis of targets of mulberry fruits for constipation therapy

3 討論

桑椹性味甘寒，人肝腎經(jīng)，具有滋陰補(bǔ)血、生津潤(rùn)燥功效，能治心腎不交或習(xí)慣性便秘（閩南民間草藥）［5］。

本研究結(jié)果從數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出桑椹候選活性化合物12 個(gè)，預(yù)測(cè)潛在參與便秘治療的相應(yīng)靶點(diǎn)211 個(gè)。通過構(gòu)建活性成分和靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)模型并分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)度值較高的候選活性分子分別是quercetin 和oleic acid，度值較高的靶點(diǎn)為PTGS1、RXRA、NCOA2、HSP90AA1 和PPARG，提示桑椹主要通過quercetin 和oleic acid 調(diào)控這些靶點(diǎn)發(fā)揮治療便秘的功效。通過富集分析和通路分析得出，桑椹中活性成分的靶點(diǎn)主要參與的生物過程包括鋅離子結(jié)合、氧化還原酶活性、液泡、藥物反應(yīng)與炎癥應(yīng)答等，主要在PPAR 信號(hào)通路、酒精性肝病、糖尿病并發(fā)癥AGR 受體信號(hào)通路等發(fā)揮其藥理作用。