曾雨嫻，盧汝梅，劉美余，楊潔儀，廖廣鳳

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530200）

草龍［Ludwigia hyssopifolia（G.Don）Exell］為柳葉菜科丁香蓼屬一年生草本植物，可全草入藥，味淡、性涼。分布于中國(guó)臺(tái)灣、廣東、海南、廣西和云南等省（自治區(qū)），野生資源十分豐富，具有清熱、解毒、利尿、涼血止血之功效［1］，抗菌作用明顯［2］。其在廣西壯族自治區(qū)（以下簡(jiǎn)稱廣西）分布廣泛，是壯醫(yī)臨床和民間長(zhǎng)期習(xí)用的解毒藥材，《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》記載其壯名為Gvahgya，常用于貧痧（感冒發(fā)熱）、貨煙媽（扁桃體炎）、口腔炎、屙瀉（泄瀉）、喯咁（疳癥）、唄膿（癰瘡）等疾病的治療［3，4］。

國(guó)內(nèi)外對(duì)中藥材草龍的化學(xué)成分、藥理作用及其質(zhì)量控制的研究較少。文獻(xiàn)報(bào)道中藥材草龍中主要含有黃酮、三萜、酚類、大環(huán)內(nèi)酯、生物堿、香豆素等類型化學(xué)成分［5-7］。筆者所在的廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院盧汝梅團(tuán)隊(duì)前期從草龍中分離鑒定出異葒草苷、葒草苷、齊墩果酸、ozoroalide、de-O-methyllasiodiplodin 等40 多種化合物［5，6］。Rao 等［7］從草龍中分離出2α、3β、19α、6β、24-penta hydroxylurs-12-en-18-oic acid、xanthyletin 等6 種化合物，朱丹等［8］采用HPLC 法測(cè)定了不同產(chǎn)地草龍中沒食子酸的含量，11 批草龍藥材沒食子酸含量為0.52%～5.14%，平均為2.61%。壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中草龍TLC 鑒別法采用沒食子酸作為指標(biāo)成分［9］，為草龍藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了一定的科學(xué)依據(jù)。受藥材產(chǎn)地、采收時(shí)間等因素影響，草龍藥材的化學(xué)成分種類、含量及藥理作用可能存在一定差異?！稄V西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定草龍藥材中沒食子酸含量不得少于0.45%，但沒食子酸在中草藥中廣泛存在，并不具有特征性，作為草龍質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分沒有專屬性，難以達(dá)到真正控制藥材質(zhì)量的目的。

預(yù)試驗(yàn)從草龍中分離得到的異葒草苷和葒草苷為黃酮碳苷，在其他植物中鮮見，葒草苷具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗凝血、抗菌等作用；異葒草苷具有抗氧化、抗炎、抗病毒、降血糖、抗腫瘤等藥理作用，都是清熱解毒的活性成分［10，11］，其藥理活性與草龍的功效和臨床用途直接相關(guān)。因此，為了提高草龍質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的專屬性和相關(guān)性，本研究以預(yù)試驗(yàn)分離得到的異葒草苷和葒草苷作為測(cè)定指標(biāo)，采用HPLC 法分別對(duì)廣西不同產(chǎn)地草龍的葒草苷及異葒草苷成分進(jìn)行了含量測(cè)定，旨在為提升中藥材草龍的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

Agilent 1100 型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；COSMOSIl5 C18-PAQ色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；SQP 萬分之一電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；KQ5200B 型超聲波清潔器（昆山市超聲儀器有限公司）；Direct-QR5UV 型自動(dòng)純水蒸餾器（廣西南寧市博美生物科技有限公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品葒草苷（批號(hào)28608-75-5，純度99.9%）、異葒草苷（批號(hào)4261-42-1，純度99.9%）均購(gòu)自成都麥德生科技有限公司；甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)Fisher 公司）；乙醇、甲醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。草龍藥材采自廣西6 個(gè)不同產(chǎn)地，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)梁子寧教授鑒定為柳葉菜科丁香蓼屬植物草龍的干燥全草。樣品信息詳見表1。

表1 樣品信息

1.3 方法

1.3.1 供試品溶液的制備 精密稱定草龍藥材（L1）1.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇20 mL，提取2 次，每次超聲波1 h，補(bǔ)重、過濾，合并濾液，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，得到供試品溶液。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密量取對(duì)照品葒草苷1.03 mg、異葒草苷1.19 mg，分別置于50 mL 容量瓶中，加70%乙醇溶解后稀釋至刻度，搖勻，得到0.020 6 mg/mL 的葒草苷、0.023 7 mg/mL 的異葒草苷對(duì)照品溶液。

1.3.3 色譜條件 色譜柱：COSMOSIl5C18-PAQ（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.2%甲酸水（15∶85）；等度洗脫40 min；流速1 mL/min；柱溫40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)340 nm；進(jìn)樣量15 μL。

1.3.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取各對(duì)照品溶液0.4、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 mL 于5 mL 容量瓶中，用70%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，過濾，取濾液于樣品瓶后，按“1.3.3”色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。

1.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批次樣品（L1）1.0 g，按照“1.3.1”方法制備供試品溶液。按“1.3.3”色譜條件，分別于0、4、6、8、12、20、24 h 測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算RSD。

1.3.6 精密度試驗(yàn) 取同一批次樣品（L1）1.0 g，按照“1.3.1”方法制備供試品溶液。在“1.3.3”色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積，計(jì)算RSD。

1.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次樣品（L1）6 份，每份1.0 g，分別按照“1.3.1”方法制備供試品溶液，按“1.3.3”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算RSD。

1.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的同一批樣品（L1）6 份，每份0.500 0 g，分別加入與樣品含量等量的葒草苷（0.187 4 mg/mL）、異葒草苷（0.351 7 mg/mL）各1 mL 進(jìn)行提取，按照“1.3.1”方法制備供試品溶液，在“1.3.3”色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算回收率，計(jì)算RSD。

1.3.9 樣品含量測(cè)定 取6 批不同產(chǎn)地草龍藥材各3 份，每份1.0 g，精密稱定，按照“1.3.1”方法分別制備供試品溶液，按照“1.3.3”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算葒草苷和異葒草苷的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系考察

樣品HPLC 色譜見圖1。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），建立線性回歸方程，其線性范圍和相關(guān)系數(shù)（r）詳見表2。結(jié)果表明，葒草苷和異葒草苷分別在0.001 6～0.016 4 μg/μL、0.001 9～0.018 9 μg/μL 水平上線性關(guān)系良好。

圖1 樣品HPLC 色譜

表2 各成分線性關(guān)系

2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

經(jīng)測(cè)定，葒草苷和異葒草苷峰面積的RSD分別為0.89%、1.12%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3 精密度試驗(yàn)

經(jīng)測(cè)定，葒草苷和異葒草苷峰面積的RSD分別為0.89%、1.13%，表明該儀器的精密度良好。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

經(jīng)測(cè)定，葒草苷和異葒草苷峰面積RSD分別為2.74%、2.67%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.5 加樣回收率試驗(yàn)

加樣回收試驗(yàn)結(jié)果見表3。葒草苷和異葒草苷的平均回收率分別為109.37%、96.40%，RSD分別為1.96%、2.84%，說明該方法的回收率符合要求。

表3 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.6 樣品含量測(cè)定

樣品測(cè)定結(jié)果見表4。從表4 可以看出，6 批不同產(chǎn)地草龍藥材，葒草苷和異葒草苷的平均含量分別為0.148 3、0.246 7 mg/g。

表4 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（n=3）（單位：mg/g）

3 討論

3.1 含量測(cè)定指標(biāo)的選擇

鮮見草龍藥材相關(guān)質(zhì)量控制研究，現(xiàn)行壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中草龍的TLC 鑒別方法采用沒食子酸作為指標(biāo)成分。朱丹等［8］采用HPLC 法測(cè)定了不同產(chǎn)地草龍中沒食子酸的含量，但僅有沒食子酸的含有量測(cè)定，指標(biāo)成分專屬性和相關(guān)性不強(qiáng)。需要建立草龍藥材安全、有效的質(zhì)量控制方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。黃酮類成分作為一類重要的天然有機(jī)化合物，廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果實(shí)等中，種類繁多，且結(jié)構(gòu)類型復(fù)雜多樣，具有抗氧化、抑菌消炎、抗癌、降血壓和保護(hù)心血管等作用［12，13］。異葒草苷和葒草苷為黃酮碳苷，研究表明其藥理活性與草龍藥材的功效、臨床用途直接相關(guān)。故本研究采用預(yù)試驗(yàn)分離得到的異葒草苷和葒草苷作為含有量測(cè)定指標(biāo)，符合中藥質(zhì)量標(biāo)志（Q-marker）［14，15］的選擇條件。所建立的含量測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定可靠，可用于草龍藥材的質(zhì)量控制。

3.2 提取方法的選擇

不同因素對(duì)草龍的提取率影響不同。在提取方式方面，預(yù)試驗(yàn)考察了超聲、回流、冷浸3 種不同的提取方式，發(fā)現(xiàn)超聲提取法的異葒草苷、葒草苷含量較高，所以本研究選擇超聲提取方法；在溶劑選擇方面，預(yù)試驗(yàn)考察了60%、70%、80%乙醇和50%、60%、70%、80%甲醇，發(fā)現(xiàn)70%乙醇和60%甲醇的提取效果較好，二者提取率率相差不大，從安全和經(jīng)濟(jì)角度考慮，乙醇毒性較小、更安全，工業(yè)乙醇價(jià)格更便宜且易回收，故選擇70%乙醇作為提取溶劑；在料液比方面，預(yù)試驗(yàn)考察了1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（m∶V，g/mL）4 個(gè)比例，發(fā)現(xiàn)隨著溶劑比例增加，提取率增大，在1∶20 時(shí)提取率最高；同時(shí)，隨著提取時(shí)間和提取次數(shù)的增加，提取率增加，在提取時(shí)間方面，預(yù)試驗(yàn)考察了30、60、90、120 min 4 個(gè)時(shí)間，在提取次數(shù)方面，預(yù)試驗(yàn)考察了1、2、3、4共4 個(gè)次數(shù)；結(jié)果顯示在90 min 和提取3 次時(shí)提取率開始下降，所以提取的最佳料液比為1∶20，提取時(shí)間為60 min，提取次數(shù)為2 次。

3.3 色譜條件的選擇

波長(zhǎng)的選擇上，預(yù)試驗(yàn)在DAD 信號(hào)檢測(cè)器下分別對(duì)葒草苷和異葒草苷進(jìn)行全波長(zhǎng)范圍掃描，結(jié)果顯示340 nm處為二者的最大吸收波長(zhǎng)，故選擇340 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)；柱溫的選擇上，考察了30、35、40 ℃對(duì)樣品檢測(cè)的影響，發(fā)現(xiàn)柱溫40 ℃時(shí)，分離度較好且峰面積較大，故柱溫選擇40 ℃；流動(dòng)相的選擇上，預(yù)試驗(yàn)考察了甲醇-純水、乙腈-純水、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.2%甲酸等流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%甲酸與乙腈-0.2%甲酸等度洗脫效果較佳、分離度較好，但后者的峰面積較大，綜合考慮選擇乙腈-0.2%甲酸作為流動(dòng)相；體積流量的選擇上，預(yù)試驗(yàn)考察了0.8、1.0、1.2 mL/min 3種流速，發(fā)現(xiàn)流速為1.0 mL/min時(shí)，分離度與峰型較好且峰面積較大，因此選擇1.0 mL/min 作為洗脫流速；進(jìn)樣量的選擇上，考察了10、15、20 μL 3 種進(jìn)樣量，結(jié)果顯示隨著進(jìn)樣量增大峰面積增大，但進(jìn)樣量為20 μL 時(shí)色譜峰出現(xiàn)了明顯的前沿峰，而15 μL 的進(jìn)樣量時(shí)峰型更好，以此選擇15 μL 進(jìn)樣量。

4 小結(jié)

本研究通過對(duì)色譜條件和草龍藥材提取方式的考察，確定了最佳色譜條件：波長(zhǎng)340 nm、流速1.0 mL/min、進(jìn)樣量15 μL、柱溫40 ℃、流動(dòng)相為乙腈-0.2%甲酸；最佳提取方式：70%乙醇，超聲波提取2 次，料液比1∶20，每次超聲波1 h。試驗(yàn)還進(jìn)行了方法學(xué)考察，發(fā)現(xiàn)其精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性RSD均小于3.0%，符合方法學(xué)試驗(yàn)要求，加樣回收試驗(yàn)結(jié)果在80%～120%的允許限之間，符合定量分析的要求。經(jīng)檢測(cè)，不同產(chǎn)地的草龍中異葒草苷和葒草苷的含量差異較大，其中南寧市邕寧區(qū)園博園樣品中的異葒草苷和葒草苷含量最大，靈山縣的2 種成分含量最小。這可能與草龍的生長(zhǎng)環(huán)境、采收時(shí)間不同有關(guān)，且樣品中葒草苷和異葒草苷含量呈正相關(guān)。本研究建立的含量測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定可靠，可用于中藥材草龍的質(zhì)量控制。