何 婭，錢 林，鄧位喜，王 娜，周 林，楊玉能，鮑 娟，孫寶盛，代佳娣，經(jīng)有林

（1.貴州省正安縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州遵義 563499；2.遵義職業(yè)技術(shù)學院，貴州遵義 563000）

禽流行性感冒（Avian influenza，AI）俗稱禽流感，病原為正黏病毒科的禽流感病毒，其毒力因子除HA 和NA 外，還包括NP基因及聚合酶基因等表達產(chǎn)物的綜合作用［1］。未裂解的HA 無感染性，只有在靶器官呼吸道及腸道組織相應的蛋白酶作用下，HA 裂解為HA1 和HA2，暴露融合肽段，通過融合進人宿主細胞。已知高致病力毒株與低致病力毒株的H 裂解位點的氨基酸序列有差異，前者為－XX－精氨酸－X－精氨酸/賴氨酸－精氨酸－（X 為非堿性氨基酸），而低致病力毒株僅有單個精氨酸，切割率極低，不易裂解。能否裂解和融合不僅取決于毒株和組織，也與宿主種類有關。

分離的H5 亞型高致病性毒株對家養(yǎng)鴨、鵝及野生雁和天鵝等也具有強致病性［2］。除HA 富含堿性氨基酸之外，NA 莖部26 個氨基酸缺失變短及PB2 蛋白第627 位氨基酸由谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼嵋部墒共《镜亩玖ψ儚姡?］。禽流感病毒的多數(shù)強毒株感染雞或火雞可出現(xiàn)病毒血癥，導致胰腺炎、心肌炎、肌炎及腦炎等。在發(fā)病后3～7 d 可檢出中和抗體，在第2 周達到高峰，可持續(xù)18 個月以上。大量病毒可通過糞便排出，在環(huán)境中長期存活，尤其是在低溫水中。病毒通過野禽傳播，尤其是野鴨。尚不清楚病毒如何在野禽群體中長年存在，有可能以低的水平維持，即使在遷徙及越冬時也是如此。加拿大20%野鴨在向南遷飛前已輕度感染病毒，中國多種野鴨也有較高的病毒檢出率［4］。

禽流感病毒可感染不同品種和日齡的禽類，且冬、春季節(jié)多發(fā)，四季可發(fā)。其中H5 和H7 亞型禽流感病毒引起高致病性禽流感被世界衛(wèi)生組織（OIE）確定為A 類烈性傳染病，中國也將其列為一類疫?。?］。其主要特征為突然發(fā)病，傳播速度快，病死率高達100%，且禽流感病毒能感染人，某些毒株甚至可不經(jīng)過混合重配再傳染的過程直接感染人并致死。為了掌握貴州省正安縣各種飼養(yǎng)模式下禽流感免疫情況，2020—2022 年對雞進行抗體監(jiān)測，以期為進一步提高正安縣雞疫病防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 雞血清來源

正安縣雞養(yǎng)殖主要為生態(tài)養(yǎng)殖，養(yǎng)殖形式為零星散養(yǎng)戶、養(yǎng)殖場、合作社等形式。2020—2022 年科技特派員下鄉(xiāng)時隨機抽取各種養(yǎng)殖模式的雞只血液制備血清進行H5、H7、H9免疫抗體檢測（表1）。

表1 雞血清樣本來源

1.2 主要試劑與儀器

一次性96 孔V 型微量反應板、禽流感H5 亞型血凝抑制試驗抗原、禽流感H7 亞型血凝抑制試驗抗原、禽流感H9 亞型血凝抑制試驗抗原、陽性血清、陰性血清均購自哈爾濱國生生物科技股份有限公司。單道及多道微量移液槍、移液槍吸頭、加樣槽、吸管、燒杯、振蕩器、恒溫箱、1%雞紅細胞懸液等由正安縣動物疫病控制中心獸醫(yī)實驗室提供。

1.3 檢測方法

根據(jù)國家《高致病性禽流感診斷技術(shù)》（GB/T 18936—2020）采用血凝抑制試驗（HI）對所采集的660 份雞血清進行禽流感病毒H5、H7 亞型抗體效價檢測，并采用同樣方法對禽流感病毒H9 亞型進行抗體效價檢測。采集SPF 公雞血液制備1%紅細胞懸液。

1.3.1 血凝（HA）試驗 按照倍比稀釋法在96 孔微量反應板的每孔中加入25 μL PBS液，在第1 孔加25 μL 抗原，反復抽打5次混勻后由第1 孔吸取25 μL 抗原加入第2 孔，混勻后吸取25 μL 加入第3孔，如此進行對倍稀釋至第11 孔，從第11 孔吸取25 μL 棄去，每孔均加入25 μL 1%雞紅細胞懸液與25 μL PBS 液，將反應板置于振蕩器振蕩2 min，于25 ℃恒溫箱中靜置30 min，在對照孔紅細胞呈明顯紐扣狀沉于孔底時觀察結(jié)果。

1.3.2 血凝抑制（HI）試驗 根據(jù)HA 試驗測定的效價，配制4 單位（4HAU）抗原。在96 孔微量反應板的第1 孔至第11 孔加入25 mL PBS，第12 孔加入50 μL 的PBS。第1 孔加入25 μL 血清，充分混勻后吸25 μL 于第2 孔，依次對倍稀釋至第10 孔，從第10孔中吸取25 μL 棄去。第1 孔至第11 孔均加入25 μL 的4HAU 抗原，于25 ℃恒溫箱中靜置30 min，每孔加入25 μL 1%雞紅細胞懸液，振蕩混勻，再于25 ℃恒溫箱中靜置30 min，在對照孔紅細胞呈明顯紐扣狀時判定結(jié)果。

1.4 結(jié)果判定

禽流感H5、H7、H9 亞型以完全抑制4HAU 抗原的最高血清稀釋倍數(shù)判為該血清的HI 效價。在陽性對照血清的HI 效價與已知效價誤差不超過1 個滴度，陰性對照血清效價不高于2log2 時，試驗成立。被檢血清HI 效價≤3log2 判為陰性；等于4log2 判為可疑；≥5log2 判為陽性。

2 結(jié)果與分析

經(jīng)血凝-血凝抑制試驗檢測，2020—2022 年隨機抽檢的660 份血清H5、H7、H9 亞型禽流感總體抗體效價陽性率分別為78.90%、77.88%、79.69%，均達到國家規(guī)定≥70%的要求；2020—2022 年正安縣禽流感H5 亞型抗體陽性率分別為81.00%、79.20%、76.30%，H7 亞型抗體陽性率分別為74.00%、77.90%、82.00%，H9 亞型抗體陽性率分別為78.64%、70.00%、84.00%，H5 亞型抗體水平呈逐年下降的趨勢，H7 亞型抗體水平呈逐年升高的趨勢，H9 亞型抗體水平呈先降低后升高的趨勢，均達到國家規(guī)定≥70%的要求（表2）。

表2 2020—2022 年正安縣隨機抽檢血清禽流感抗體監(jiān)測結(jié)果

3 小結(jié)與討論

血凝抑制試驗檢測禽流感抗體是廣泛應用的一種方法，具有操作簡便、檢測量大、敏感性好等優(yōu)點［6］。試驗通過對貴州省正安縣禽流感病毒抗體檢測發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)禽流感病毒抗體檢測合格率符合國家標準，得益于貴州省正安縣積極的防疫檢疫工作。馬衛(wèi)紅等［5］檢測發(fā)現(xiàn)，2017 年惠水縣高致病性禽流感H5 亞型免疫抗體合格率為70.93%，H7 亞型免疫抗體合格率僅為29.33%，H7 免疫合格率較低。王兵等［6］2018 年對貴州省部分地區(qū)高致病性禽流感H5 和H7 亞型免疫抗體檢測發(fā)現(xiàn)，被檢測地區(qū)H5 亞型免疫抗體合格率為68.1%，H7 亞型免疫抗體合格率為65.75%，都沒有達到農(nóng)業(yè)農(nóng)村部的要求，與本試驗的貴州省正安縣禽流感免疫抗體檢測結(jié)果存在差異。比較發(fā)現(xiàn)，貴州省正安縣高致病性禽流感H5、H7、H9 亞型免疫抗體的合格率較高，H5、H7、H9 亞型禽流感總體抗體效價陽性率分別為78.90%、77.88%、79.69%，建議貴州省正安縣在維持免疫水平的基礎上，建立嚴格的衛(wèi)生管理制度。禁止雞和水禽混養(yǎng)，養(yǎng)雞場與水禽飼養(yǎng)場應間隔3 km以上，且不得共用同一水源［7］。養(yǎng)禽場要有防止禽鳥（包括水禽）進人飼養(yǎng)區(qū)的設施，防止一切帶毒動物特別是鳥類以及被污染物品接觸本地雞群，并有健全的滅鼠設施和措施。同時防止人員、來訪客、飼養(yǎng)用具等雜物的間接傳播，對外來欲接觸雞的人員及車輛進行嚴格消毒，嚴格執(zhí)行衛(wèi)生消毒管理制度，注重飼料來源安全，不從疫區(qū)購進種蛋和雞苗，新購進的雞、雞苗、孵育的小雞必須接種疫苗，并隔離觀察2 周以上［8］。

結(jié)合實際制定科學的免疫措施，并根據(jù)正安縣當?shù)匾卟×餍星闆r、飼養(yǎng)類型進行免疫接種，疫苗免疫接種應選擇相同亞型的禽流感疫苗按免疫程序?qū)仪葸M行預防接種，研制與使用的疫苗有禽流感滅活疫苗（H5N2 亞型、H5N1 亞型、H9 亞型）、禽流感（H5N2 +H9N2）二價滅活疫苗、重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1 亞型，Re-1 株）和禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗（rL-H5 株）、禽流感-雞痘重組二聯(lián)活疫苗（rFPV-H6 株）［9］。以上疫苗應按照一定的免疫程序接種，對產(chǎn)蛋雞，20～30 日齡進行首免，頸部皮下注射0.3～0.5 mL，開產(chǎn)前20 d 進行二免，胸肌注射0.5 mL；種雞及禽流感高發(fā)地區(qū)，在300 日齡進行三免，或在雛雞10～12 日齡用禽流感新城疫重組二聯(lián)活疫苗（rL-H5 株）滴鼻首免，以后可選擇活疫苗或滅活苗免疫。對商品肉仔雞，要根據(jù)需要確定是否接種［10］。

注意免疫監(jiān)測，當抗體滴度大于5log2 時雞群才能得到保護［11］。同時做好疫情流行的應急準備工作，一旦發(fā)生或疑似高致病性禽流感，應及時報告疫情，正確診斷，追蹤調(diào)查，采取隔離、限制移動等措施，劃定疫點、疫區(qū)和受威脅區(qū)，嚴格封鎖［12］。疫區(qū)內(nèi)所有禽只以不放血方式撲殺，并對所有病死禽、被撲殺禽、禽類產(chǎn)品、排泄物、被污染飼料、墊料、污水等按國家規(guī)定進行無害化處理，對被污染的物品、交通工具、用具、禽舍、場地進行嚴格徹底消毒，對受威脅區(qū)內(nèi)所有易感禽類采用國家批準使用的疫苗進行緊急強制免疫接種，建立完整的免疫檔案［13］。發(fā)生低致病性禽流感時，可在嚴密隔離的條件下，進行必要的藥物治療，以減少損失［14］。配合應用清熱解毒、止咳平喘的中藥如板藍根、大青葉、連翹和清瘟散等，效果更好［15］。由于該病常并發(fā)或繼發(fā)大腸桿菌或支原體感染，因此適當應用抗菌藥物，如氟苯尼考、強力霉素、環(huán)丙沙星、利高霉素等，以減少死亡。要有計劃、有組織地收集檢測信息，按照要求進行監(jiān)測，建立和完善禽流感監(jiān)測系統(tǒng)［16］。