岳青陽(yáng)，張耀文，徐萬(wàn)魁*（1.遼寧省檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心，沈陽(yáng) 110036；2.遼寧省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院/國(guó)家藥品監(jiān)督管理局化學(xué)藥品質(zhì)量研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110036）

基因毒性雜質(zhì)是指能夠直接或間接損傷細(xì)胞DNA，產(chǎn)生基因突變或體內(nèi)誘變，具有致癌可能或者傾向的一類(lèi)物質(zhì)，對(duì)DNA的損害包括染色體斷裂、DNA重組及復(fù)制過(guò)程中共價(jià)鍵的插入和修飾，也包括在細(xì)胞水平產(chǎn)生基因毒性物質(zhì)而產(chǎn)生的突變[1-2]，如磺酸酯類(lèi)、N-亞硝胺類(lèi)、鹵代烷烴類(lèi)和肼類(lèi)等，其中N-亞硝胺類(lèi)基因毒性雜質(zhì)是公認(rèn)的強(qiáng)毒性的化合物之一。N-亞硝基二甲胺（NDMA）及N-亞硝基二乙胺（NDEA）均為常見(jiàn)的N-亞硝胺類(lèi)化合物，不僅屬于2A類(lèi)致癌物質(zhì)，而且屬于三大“關(guān)注隊(duì)列”的基因毒性雜質(zhì)，在 ICH M7 指南中明確該類(lèi)化合物具有較高致癌性[3-5]。

目前，我國(guó)高血糖發(fā)病率持續(xù)增長(zhǎng)，其中2型糖尿病占糖尿病人群的近90%，二甲雙胍產(chǎn)品作為治療2型糖尿病的一線藥物，有著穩(wěn)定的市場(chǎng)需求[6]。糖尿病患者需要終身服藥，且服用的劑量大、時(shí)間長(zhǎng)，因此需要更加嚴(yán)格地控制雜質(zhì)水平。2019年12月，F(xiàn)DA宣布從降糖藥物鹽酸二甲雙胍制劑中檢出雜質(zhì)NDMA，隨后我國(guó)藥品監(jiān)督管理部門(mén)也陸續(xù)開(kāi)展了二甲雙胍制劑中NDMA的監(jiān)測(cè)工作[7-9]。復(fù)方二甲雙胍格列吡嗪膠囊為鹽酸二甲雙胍與格列吡嗪的復(fù)方制劑，臨床上用于改善2型糖尿病患者的血糖控制，由臨床數(shù)據(jù)顯示，使用該復(fù)方制劑比單獨(dú)使用二甲雙胍效果更佳，且患者依從性、耐受性好，因此該制劑在臨床上使用較為廣泛[10-11]。目前復(fù)方二甲雙胍格列吡嗪膠囊在國(guó)內(nèi)尚屬獨(dú)家品種，并未對(duì)其中的亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)進(jìn)行控制，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)復(fù)方二甲雙胍格列吡嗪膠囊中NDMA和NDEA檢測(cè)的有關(guān)文獻(xiàn)。本文采用GC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定鹽酸二甲雙胍格列吡嗪膠囊中的NDMA和NDEA，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC2030氣相色譜儀，TQ8050NX質(zhì)譜檢測(cè)器，日本島津公司）。XP205電子天平（美國(guó)METTLER TOLEDO公司，精度0.000 01 g）。

1.2 試藥

NDMA對(duì)照品（純度為99.5%，批號(hào)：510166-202104）、NDEA對(duì)照品（純度為100.0%，批號(hào)：510168-202103）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）。二氯甲烷（色譜純，批號(hào)：22085094，美國(guó)Fisher公司）；鹽酸（分析純，批號(hào)：20210220，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氦氣（純度＞99.99%）。8批復(fù)方二甲雙胍格列吡嗪膠囊均為遼寧修和藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent VF-WAXms毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.50 μm）。柱溫為程序升溫：初始溫度為40℃，維持0.5 min后，以20℃·min-1的速率升至200℃，再以60℃·min-1的速率升至240℃，維持5 min；進(jìn)樣口溫度為250℃；進(jìn)樣量：1 μL；載氣為氦氣，流速1.2 mL·min-1；電離方式：電子轟擊源（EI）；離子源溫度：230℃；采集模式：MRM；離子源電壓0.99 kV。NDMA的定量離子對(duì)74/44，碰撞能量為6 V，定性離子對(duì)為74/42，碰撞能量為21 V；NDEA的定量離子對(duì)為102/85，碰撞能量為6 V，定性離子對(duì)為102/55，碰撞能量為21 V。

2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備

分別取NDMA與NDEA對(duì)照品各約10 mg，精密稱(chēng)定，置100 mL量瓶中，用二氯甲烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱(chēng)取本品內(nèi)容物適量（約相當(dāng)于鹽酸二甲雙胍500 mg），置50 mL離心管中，加1 mol·mL-1鹽酸溶液10 mL，渦旋1 min，再以350 次·min-1的頻率振搖10 min，精密加入二氯甲烷10 mL，以1000 r·min-1渦旋1 min，繼續(xù)振搖10 min，然后以4000 r·min-1離心10 min，小心抽取下層二氯甲烷層過(guò)濾，以0.45 μm濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用二氯甲烷稀釋至質(zhì)量濃度為40 ng·mL-1的溶液作為系統(tǒng)適用性溶液，以二氯甲烷作為空白溶液，取系統(tǒng)適用性溶液和空白溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，溶劑不干擾NDMA和NDEA的測(cè)定。

圖1 二甲雙胍格列吡嗪膠囊代表性色譜圖Fig 1 Representative chromatogram of compound metformin hydrochloride and glipizide capsules

2.5 線性關(guān)系考察

精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用二氯甲烷逐步稀釋至0.2、0.5、1、2、5、10、20、40 ng·mL-1，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。各組分在0.1966～39.32 ng·mL-1及0.1870～37.41 ng·mL-1內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

表1 NDMA和NDEA線性關(guān)系、檢測(cè)限及定量限Tab 1 Linearity，detection limit，and quantitation limit of NDMA and NDEA

2.6 檢測(cè)限和定量限

精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液，用二氯甲烷逐步稀釋?zhuān)础?.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，以信噪比（S/N）≈3時(shí)的濃度，為其檢測(cè)限（LOD），S/N≈10時(shí)的濃度，為其定量限（LOQ），結(jié)果見(jiàn)表1。

2.7 精密度

取0.5 ng·mL-1對(duì)照品線性溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，NDMA的RSD為1.8%（n＝6），NDEA的RSD為3.2%（n＝6），表明儀器的精密度良好。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

取同一批樣品內(nèi)容物9份，分別精密加入20、25、30 ng·mL-1對(duì)照品溶液1 mL，各3份，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理后進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各濃度的回收率。結(jié)果NDMA和NDEA加樣回收率在82.3%～85.4%，RSD在2.6%～3.9%，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確可靠。

2.9 重復(fù)性

取樣品4粒內(nèi)容物，精密加入25 ng·mL-1對(duì)照品溶液1 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理后進(jìn)樣測(cè)定，同法配制6份，記錄色譜圖。結(jié)果NDMA和NDEA峰面積的RSD分別為2.6%和4.1%，表明重復(fù)性良好（n＝6）。

2.10 穩(wěn)定性

取重復(fù)性樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、8、12 h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，以二氯甲烷為溶劑，NDMA和NDEA在12 h內(nèi)穩(wěn)定，峰面積的RSD分別為2.4%和4.9%。

2.11 測(cè)定結(jié)果

取本品適量，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣測(cè)定，將測(cè)定結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算NDMA和NDEA含量。結(jié)果表明，8批復(fù)方二甲雙胍格列吡嗪膠囊中均未檢出NDMA和NDEA。

3 討論

3.1 檢測(cè)方法的選擇

目前，N-亞硝胺雜質(zhì)的定量分析方法主要有GC-MS法、GC-MS/MS法、LC-MS/MS法、LCHRMS法等[12-15]，本文采用GC-MS/MS方法，檢測(cè)專(zhuān)屬性強(qiáng)，靈敏度高，操作簡(jiǎn)便。

3.2 質(zhì)譜條件的選擇

制備10 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，使用全掃描模式對(duì)混合對(duì)照品溶液進(jìn)行m/z40～200內(nèi)的掃描，使用譜庫(kù)比對(duì)確定NDMA和NDEA的色譜峰，根據(jù)相對(duì)強(qiáng)度選擇前體離子，NDMA和NDEA均選擇分子離子作為前體離子。再通過(guò)產(chǎn)物離子掃描對(duì)碰撞能量及二級(jí)碎片離子進(jìn)行優(yōu)化，選擇響應(yīng)最高的產(chǎn)物離子，作為定性離子和定量離子。

3.3 供試品提取方法的選擇

中國(guó)食品藥品檢定研究院頒布的鹽酸二甲雙胍中N-亞硝基二甲胺推薦檢測(cè)方法中鹽酸二甲雙胍不同制劑采用了不同提取溶劑，本研究分別考察了二氯甲烷及鹽酸加二氯甲烷兩種提取方式，并考察了渦旋時(shí)間及振搖時(shí)間等因素。通過(guò)NDMA及NDEA的回收率對(duì)比試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)采用二氯甲烷提取，基質(zhì)效應(yīng)較大，輔料干擾測(cè)定，而采用1 mol·mL-1鹽酸加二氯甲烷作為提取溶劑時(shí)，輔料不干擾測(cè)定，且提取時(shí)渦旋1 min，振搖10 min，提取效果最佳。

3.4 假陽(yáng)性結(jié)果的處理

在樣品測(cè)定中發(fā)現(xiàn)在與NDMA對(duì)照品相同保留時(shí)間處出現(xiàn)色譜峰，且該色譜峰的定量與定性離子對(duì)均與對(duì)照品相同，但離子強(qiáng)度比與對(duì)照品相差較大，出現(xiàn)了假陽(yáng)性現(xiàn)象。經(jīng)優(yōu)化質(zhì)譜條件，將分辨率由“high”優(yōu)化為“unit”后，假陽(yáng)性現(xiàn)象消失。

根據(jù)美國(guó)致癌性數(shù)據(jù)庫(kù)（CPDB）中化合物的TD50值，NDMA和NDEA按每日注射最大日暴露量（PDE）96 ng·d-1和26.5 ng·d-1計(jì)，按照二甲雙胍每日最大劑量2000 mg，NDMA和NDEA對(duì)應(yīng)的分析評(píng)價(jià)閾值（AET）為48 ng·g-1和13.25 ng·g-1。通過(guò)對(duì)8批復(fù)方二甲雙胍格列吡嗪膠囊中的NDMA和NDEA雜質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示兩種雜質(zhì)含量均小于其AET。