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        UHPLC-Q-Exactive-MS/MS結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析瀉肺利水湯的化學(xué)成分及治療心力衰竭的作用機(jī)制

        2023-11-03 04:21:40周德勇龔韜佟彤婁妍楊薇胡銀燕劉紅旭首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院北京100010北京市中醫(yī)藥研究所北京100010
        中南藥學(xué) 2023年10期
        關(guān)鍵詞:防己利水激酶

        周德勇,龔韜*,佟彤,婁妍,楊薇,胡銀燕,劉紅旭(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院,北京 100010;.北京市中醫(yī)藥研究所,北京 100010)

        心力衰竭是各種心臟疾病嚴(yán)重或晚期的表現(xiàn),是由多種原因?qū)е碌男呐K或(及)心室結(jié)構(gòu)、功能的異常改變或(及)障礙,從而引起主要表現(xiàn)為呼吸困難、疲乏和體液潴留等的復(fù)雜臨床綜合征[1]。好發(fā)于中老年人,且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[2]。中醫(yī)藥在穩(wěn)定病情、改善功能和提高患者生活質(zhì)量方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[3]。瀉肺利水湯是國家名老中醫(yī)許心如教授根據(jù)《金匱要略》中葶藶大棗瀉肺湯和防己黃芪湯主方加減而來的臨床經(jīng)驗(yàn)方[4-6],通過調(diào)節(jié)全身氣機(jī)、推動(dòng)調(diào)節(jié)血液的運(yùn)行,通調(diào)水道,治理調(diào)節(jié)津液的代謝。瀉肺利水湯由黃芪、葶藶子、防己、桑白皮、香加皮組成,方中黃芪補(bǔ)益元?dú)?,扶正固本,該藥補(bǔ)而不滯,兼有行濕之功;桑白皮、葶藶子、香加皮瀉肺氣行水,除胸中痰飲,化痰平喘利水;防己益氣利水;諸藥合用既能益氣養(yǎng)陰,又能瀉肺利水,化痰平喘。臨床研究表明,瀉肺利水湯能有效改善心力衰竭患者的臨床癥狀、心功能和生活質(zhì)量,但其治療心力衰竭的活性成分及作用機(jī)制尚不清楚,故本研究采用UHPLC-Q-Exactive-MS/MS分析瀉肺利水湯的化學(xué)成分,借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建“藥物-疾病-靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò),初步探究其治療心力衰竭的主要活性成分及作用機(jī)制,為今后的臨床研究和藥物制劑開發(fā)提供參考。

        1 材料

        1.1 儀器

        賽默飛Q-Exactive Orbitrap 四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜儀(美國Thermo Scientific 公司);Xcalibur 4.2化學(xué)工作站,XP105DR十萬分之一天平(瑞士Mettler Toledo公司)。

        1.2 試藥

        甲醇、乙腈為色譜純(賽默飛世爾科技有限公司);磷酸(色譜純,天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司);水為超純水。4-甲氧基水楊醛(批號(hào):DSTDJ015801)、杠柳毒苷(批號(hào):DSTDG00401)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-龍膽二糖苷(批號(hào):DSTDH008301)、防己諾林堿(批號(hào):DST210829-005)、桑皮苷A(批號(hào):DSTDS006801)(成都德思特生物技術(shù)有限公司,純度均大于98%),黃芪甲苷(批號(hào):0781-9706,純度≥98%,中國食品藥品檢定研究院)。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 混合對(duì)照品溶液的制備

        精密稱取4-甲氧基水楊醛、山柰酚、杠柳毒苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-龍膽二糖苷、防己諾林堿、桑皮苷A、黃芪甲苷等對(duì)照品適量,加入甲醇分別制成質(zhì)量濃度為20.03、21.47、25.15、26.09、25.17、23.14、21.96 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

        2.2 供試品溶液的制備

        按照瀉肺利水湯處方組成稱取黃芪12 g、南葶藶子12 g、桑白皮6 g、防己6 g、香加皮12 g于1000 mL圓底燒瓶中,加入10倍量水,提取2次,每次1 h,取續(xù)濾液,合并,減壓濃縮干燥,即得。精密稱定上述干燥粉末50 mg于10 mL量瓶中,加入適量甲醇,超聲處理(功率250 W,頻率30 kHz)30 min,放冷,加甲醇至刻度線,搖勻,0.22 μm微孔濾膜過濾,即得瀉肺利水湯供試品溶液。

        2.3 UHPLC-Q-Exactive-MS/MS 分析條件

        2.3.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18 液相色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫(0~20 min,3%→30%A;20~30 min,30%→40%A;30~45 min,40%→60%A;45~50 min,60%A;50~80 min,60%→90%A;80~85 min,90%A;85~86 min,90%→3%A;86~100 min,3% A),流速0.4 mL·min-1,柱溫30℃,進(jìn)樣量10 μL。

        2.3.2 質(zhì)譜條件 熱噴霧離子源(HESI);離子源溫度450℃,噴霧電壓3.5 kV,S-LensRF 電壓50 V,毛細(xì)管溫度350℃,鞘氣和輔助氣均為高純氮?dú)猓兌却笥?9.99%),鞘氣流速:30 arb,輔助氣流速:12 arb。質(zhì)譜采集范圍為m/z100~1500,采集時(shí)間0~90 min,與數(shù)據(jù)依賴性二級(jí)質(zhì)譜掃描ddMS2;分辨率:70 000(Full Scan),17 500(MS/MS);碰撞模式:高能量碰撞解離(HCD),碰撞能量:NCE 30,Stepped NCE 50%。

        2.4 瀉肺利水湯水提液化學(xué)成分分析與鑒定

        采用UHPLC-Q-Exactive-MS,對(duì)瀉肺利水湯水提物樣品進(jìn)行正負(fù)離子全掃描,獲得正負(fù)離子模式下的TIC圖(見圖1),通過與對(duì)照品的相對(duì)保留時(shí)間、準(zhǔn)分子離子峰、MS/MS碎片離子信息等信息對(duì)比確認(rèn),結(jié)合參考文獻(xiàn)[7-15],共鑒定化合物82個(gè),包括黃酮類37個(gè),酚酸類10個(gè),香豆素類7個(gè),生物堿類5個(gè),皂苷類5個(gè),其他類18個(gè)。正負(fù)離子模式下均鑒定出的成分,表中僅列出負(fù)離子模式下化合物的離子碎片信息,具體結(jié)果見表1。

        圖1 瀉肺利水湯水提物正(上圖)、負(fù)(下圖)離子模式下的TIC圖Fig 1 TIC diagram of Xiefei Lishui decoction in positive ion(up)and negative ion(down)mode

        續(xù)表1

        2.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

        2.5.1 藥物活性成分及靶點(diǎn)收集 以胃腸道吸收(GI absorption)得分為“high”,類藥性(druglikeness)至少得到2個(gè)“Yes”為依據(jù),借助Swiss ADME平臺(tái)對(duì)篩選出的化學(xué)成分進(jìn)行篩選;將篩選出的化合物導(dǎo)入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)各化學(xué)成分的作用靶點(diǎn),以Probability大于0.1為篩選條件,共篩選得到活性成分37個(gè),靶點(diǎn)1603個(gè),刪除重復(fù)靶點(diǎn)后共有470個(gè)。

        2.5.2 疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè)篩選 以“heart failure”為關(guān)鍵詞,在GeneCard、OMIM、DrugBank、TTD 4個(gè)數(shù)據(jù)庫中檢索,獲取心力衰竭相關(guān)靶點(diǎn),分別得到靶點(diǎn)5237、130、54、30個(gè),在Genecard數(shù)據(jù)庫中篩選得到的靶點(diǎn)過多,以大于2倍中位數(shù)的得分?jǐn)?shù)為條件進(jìn)行篩選后得到靶點(diǎn)1312個(gè),將4個(gè)數(shù)據(jù)庫的目標(biāo)靶點(diǎn)合并,刪除重復(fù)值。使用R語言將藥物靶點(diǎn)與獲得的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行整合,刪除重復(fù)值后合并得到共同靶點(diǎn)1412個(gè),取交集得135個(gè)。

        2.5.3 藥物-活性成分-疾病-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò) 將獲得的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0軟件,構(gòu)建“藥物-活性成分-疾病-靶點(diǎn)”的調(diào)控圖,共得到節(jié)點(diǎn)177個(gè)和關(guān)系603條,結(jié)果見圖2,經(jīng)計(jì)算degree值較高的化學(xué)成分分別是山柰素、甘草素、7-羥基香豆素、防己菲堿、黃芪紫檀烷苷。

        圖2 瀉肺利水湯“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 “Active ingredient-target” network diagram of Xiefei Lishui decoction

        2.5.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和核心基因預(yù)測(cè) 應(yīng)用STRING網(wǎng)絡(luò)平臺(tái),構(gòu)建交集基因的PPI網(wǎng)絡(luò)圖,將其進(jìn)一步利用Cytoscape 3.9.0構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)分析圖,并篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)(見圖3),圖中共有節(jié)點(diǎn)140個(gè),邊1437條,根據(jù)degree值排序,處于核心位置的靶點(diǎn)為TNF、AKT1、EGFR、VEGFA、ESR1,提示這些靶點(diǎn)在瀉肺利水湯治療心力衰竭中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

        圖3 瀉肺利水湯治療心衰相關(guān)靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig 3 PPI network of the relevant targets of Xiefei Lishui decoction in the treatment of heart failure

        2.5.5 GO功能富集和KEGG通路富集 通過Cytoscape 3.9.0軟件計(jì)算活性成分-核心靶點(diǎn)及運(yùn)行相關(guān)腳本后,進(jìn)行基因功能注釋(GO)富集分析和京都基因組百科全書(KEGG)通路富集分析,GO中包括3個(gè)模塊:生物過程(BP)、細(xì)胞成分(CC)和分子功能(MF),篩選條件為P<0.05;同樣,Q<0.05時(shí)獲得的KEGG通路被認(rèn)為是最重要的信號(hào)通路。通過GO富集分析共獲得2329個(gè)富集結(jié)果,包括2084個(gè)BP,主要涉及激酶活性的正向調(diào)節(jié)、對(duì)MAPK 級(jí)聯(lián)的正向調(diào)節(jié)、對(duì)外源性刺激物的反應(yīng)、上皮細(xì)胞增殖等;共91個(gè)CC,主要涉及膜筏、膜微區(qū)、神經(jīng)元細(xì)胞體、囊泡腔、分泌顆粒腔等;有154個(gè)MF,主要涉及內(nèi)肽酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、絲氨酸水解酶活性、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性等(見圖4)。KEGG富集分析后,得到154條通路富集結(jié)果,主要涉及PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、癌癥中的蛋白聚糖、Rap1信號(hào)通路等。提示瀉肺利水湯可能通過上述信號(hào)通路對(duì)心力衰竭起到治療作用(見圖5)。

        圖4 GO富集分析Fig 4 GO enrichment analysis

        圖5 KEGG富集分析Fig 5 KEGG enrichment analysis

        2.5.6 潛在核心活性成分-核心靶點(diǎn)分子對(duì)接預(yù)測(cè) 根據(jù)“藥物-活性成分-疾病-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)中的degree值排序,結(jié)合文獻(xiàn),選取化合物中degree>20的山柰素、甘草素、7-羥基香豆素、防己菲堿、黃芪紫檀烷苷等5個(gè)主要成分,分別與5個(gè)核心基因進(jìn)行分子對(duì)接。一般認(rèn)為結(jié)合能小于-5.0 kJ·mol-1,就表明分子與靶點(diǎn)之間有良好的結(jié)合活性,若小于-7.0 kJ·mol-1,則說明結(jié)合活性很強(qiáng)[16],結(jié)果表明5個(gè)成分與核心基因均有良好的結(jié)合力,具體見表2。

        表2 分子對(duì)接Tab 2 Molecular docking

        3 討論

        心力衰竭是各種心臟病發(fā)病末期或嚴(yán)重臨床階段,主要表現(xiàn)為呼吸困難、心悸、疲乏、體液潴留等癥狀,充分緩解水鈉潴留有效減輕患者癥狀、降低患者再住院率、提高生活質(zhì)量的重要措施[1]。中醫(yī)認(rèn)為,其主要病機(jī)多為心肺氣虛,氣化不利,導(dǎo)痰濕內(nèi)阻,治療多以益氣利水為法[17]。在此基礎(chǔ)上,北京中醫(yī)醫(yī)院許心如教授提出“瀉肺利水”法治療心力衰竭的學(xué)術(shù)觀點(diǎn),并取得了良好的臨床療效[18]。為了進(jìn)一步闡明瀉肺利水對(duì)心力衰竭的治療作用,本研究采用UHPLCQ-Exactive-MS/MS方法結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,鑒定出瀉肺利水湯水提物的化學(xué)成分82個(gè),其中山柰素、甘草素、7-羥基香豆素、防己菲堿、黃芪紫檀烷苷等活性成分具有較多的作用靶點(diǎn),是瀉肺利水合劑治療心力衰竭的主要活性成分,具有抗炎、抗氧化、抗病毒等藥理作用;現(xiàn)代研究表明,下調(diào)炎癥因子的表達(dá)、減少氧化應(yīng)激反應(yīng)、調(diào)控細(xì)胞凋亡在心力衰竭的治療中具有重要意義[19]。

        通過PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲱A(yù)測(cè)到AKT1、IL1B、TP53、TNF、VEGFA等5個(gè)核心基因。GO分析顯示,瀉肺利水治療心力衰竭的生物過程集中在激酶活性的正向調(diào)節(jié)、對(duì)MAPK 級(jí)聯(lián)的正向調(diào)節(jié),其中還涉及對(duì)外源性刺激物的反應(yīng)、對(duì)上皮細(xì)胞增殖的反應(yīng)的調(diào)節(jié)等。KEGG 通路分析表明,內(nèi)肽酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、絲氨酸水解酶活性、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性,可能是治療機(jī)制中的重要通路。另外TNF信號(hào)通路是重要的炎癥通路[17]。TNF-α廣泛存在于心力衰竭患者活檢組織中,被認(rèn)為是心力衰竭疾病發(fā)生發(fā)展過程中的重要因子[20]。實(shí)驗(yàn)證明,抑制TNF-α信號(hào)通路表達(dá)能夠改善心力衰竭大鼠的心功能,對(duì)心力衰竭的防治具有重要意義[21]。

        綜上所述,本研究充分考慮藥物煎煮過程中可能發(fā)生的化學(xué)成分變化,采用UHPLC-Q-Exactive-MS/MS技術(shù)對(duì)瀉肺利水湯化學(xué)成分進(jìn)行了鑒定,并通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討了其治療心力衰竭的主要活性成分及作用機(jī)制。研究結(jié)果表明瀉肺利水湯可能是通過山柰素、甘草素、7-羥基香豆素、防己菲堿、黃芪紫檀烷苷等成分作用于AKT1、IL1B、TP53、TNF、VEGFA等靶點(diǎn),進(jìn)一步通過調(diào)控內(nèi)肽酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、絲氨酸水解酶活性、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性等信號(hào)通路發(fā)揮多成分、多靶點(diǎn)治療心力衰竭的作用。

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