周德勇，龔韜＊，佟彤，婁妍，楊薇，胡銀燕，劉紅旭（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010；.北京市中醫(yī)藥研究所，北京 100010）

心力衰竭是各種心臟疾病嚴(yán)重或晚期的表現(xiàn)，是由多種原因?qū)е碌男呐K或（及）心室結(jié)構(gòu)、功能的異常改變或（及）障礙，從而引起主要表現(xiàn)為呼吸困難、疲乏和體液潴留等的復(fù)雜臨床綜合征[1]。好發(fā)于中老年人，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[2]。中醫(yī)藥在穩(wěn)定病情、改善功能和提高患者生活質(zhì)量方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[3]。瀉肺利水湯是國(guó)家名老中醫(yī)許心如教授根據(jù)《金匱要略》中葶藶大棗瀉肺湯和防己黃芪湯主方加減而來(lái)的臨床經(jīng)驗(yàn)方[4-6]，通過(guò)調(diào)節(jié)全身氣機(jī)、推動(dòng)調(diào)節(jié)血液的運(yùn)行，通調(diào)水道，治理調(diào)節(jié)津液的代謝。瀉肺利水湯由黃芪、葶藶子、防己、桑白皮、香加皮組成，方中黃芪補(bǔ)益元?dú)猓稣瘫?，該藥補(bǔ)而不滯，兼有行濕之功；桑白皮、葶藶子、香加皮瀉肺氣行水，除胸中痰飲，化痰平喘利水；防己益氣利水；諸藥合用既能益氣養(yǎng)陰，又能瀉肺利水，化痰平喘。臨床研究表明，瀉肺利水湯能有效改善心力衰竭患者的臨床癥狀、心功能和生活質(zhì)量，但其治療心力衰竭的活性成分及作用機(jī)制尚不清楚，故本研究采用UHPLC-Q-Exactive-MS/MS分析瀉肺利水湯的化學(xué)成分，借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建“藥物-疾病-靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)，初步探究其治療心力衰竭的主要活性成分及作用機(jī)制，為今后的臨床研究和藥物制劑開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

賽默飛Q-Exactive Orbitrap 四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Scientific 公司）；Xcalibur 4.2化學(xué)工作站，XP105DR十萬(wàn)分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 試藥

甲醇、乙腈為色譜純（賽默飛世爾科技有限公司）；磷酸（色譜純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）；水為超純水。4-甲氧基水楊醛（批號(hào)：DSTDJ015801）、杠柳毒苷（批號(hào)：DSTDG00401）、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-龍膽二糖苷（批號(hào)：DSTDH008301）、防己諾林堿（批號(hào)：DST210829-005）、桑皮苷A（批號(hào)：DSTDS006801）（成都德思特生物技術(shù)有限公司，純度均大于98%），黃芪甲苷（批號(hào)：0781-9706，純度≥98%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取4-甲氧基水楊醛、山柰酚、杠柳毒苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-龍膽二糖苷、防己諾林堿、桑皮苷A、黃芪甲苷等對(duì)照品適量，加入甲醇分別制成質(zhì)量濃度為20.03、21.47、25.15、26.09、25.17、23.14、21.96 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

按照瀉肺利水湯處方組成稱(chēng)取黃芪12 g、南葶藶子12 g、桑白皮6 g、防己6 g、香加皮12 g于1000 mL圓底燒瓶中，加入10倍量水，提取2次，每次1 h，取續(xù)濾液，合并，減壓濃縮干燥，即得。精密稱(chēng)定上述干燥粉末50 mg于10 mL量瓶中，加入適量甲醇，超聲處理（功率250 W，頻率30 kHz）30 min，放冷，加甲醇至刻度線(xiàn)，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得瀉肺利水湯供試品溶液。

2.3 UHPLC-Q-Exactive-MS/MS 分析條件

2.3.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18 液相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～20 min，3%→30%A；20～30 min，30%→40%A；30～45 min，40%→60%A；45～50 min，60%A；50～80 min，60%→90%A；80～85 min，90%A；85～86 min，90%→3%A；86～100 min，3% A），流速0.4 mL·min-1，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 熱噴霧離子源（HESI）；離子源溫度450℃，噴霧電壓3.5 kV，S-LensRF 電壓50 V，毛細(xì)管溫度350℃，鞘氣和輔助氣均為高純氮?dú)猓兌却笥?9.99%），鞘氣流速：30 arb，輔助氣流速：12 arb。質(zhì)譜采集范圍為m/z100～1500，采集時(shí)間0～90 min，與數(shù)據(jù)依賴(lài)性二級(jí)質(zhì)譜掃描ddMS2；分辨率：70 000（Full Scan），17 500（MS/MS）；碰撞模式：高能量碰撞解離（HCD），碰撞能量：NCE 30，Stepped NCE 50%。

2.4 瀉肺利水湯水提液化學(xué)成分分析與鑒定

采用UHPLC-Q-Exactive-MS，對(duì)瀉肺利水湯水提物樣品進(jìn)行正負(fù)離子全掃描，獲得正負(fù)離子模式下的TIC圖（見(jiàn)圖1），通過(guò)與對(duì)照品的相對(duì)保留時(shí)間、準(zhǔn)分子離子峰、MS/MS碎片離子信息等信息對(duì)比確認(rèn)，結(jié)合參考文獻(xiàn)[7-15]，共鑒定化合物82個(gè)，包括黃酮類(lèi)37個(gè)，酚酸類(lèi)10個(gè)，香豆素類(lèi)7個(gè)，生物堿類(lèi)5個(gè)，皂苷類(lèi)5個(gè)，其他類(lèi)18個(gè)。正負(fù)離子模式下均鑒定出的成分，表中僅列出負(fù)離子模式下化合物的離子碎片信息，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 瀉肺利水湯水提物正（上圖）、負(fù)（下圖）離子模式下的TIC圖Fig 1 TIC diagram of Xiefei Lishui decoction in positive ion（up）and negative ion（down）mode

續(xù)表1

2.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.5.1 藥物活性成分及靶點(diǎn)收集 以胃腸道吸收（GI absorption）得分為“high”，類(lèi)藥性（druglikeness）至少得到2個(gè)“Yes”為依據(jù)，借助Swiss ADME平臺(tái)對(duì)篩選出的化學(xué)成分進(jìn)行篩選；將篩選出的化合物導(dǎo)入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)各化學(xué)成分的作用靶點(diǎn)，以Probability大于0.1為篩選條件，共篩選得到活性成分37個(gè)，靶點(diǎn)1603個(gè)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)后共有470個(gè)。

2.5.2 疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè)篩選 以“heart failure”為關(guān)鍵詞，在GeneCard、OMIM、DrugBank、TTD 4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，獲取心力衰竭相關(guān)靶點(diǎn)，分別得到靶點(diǎn)5237、130、54、30個(gè)，在Genecard數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選得到的靶點(diǎn)過(guò)多，以大于2倍中位數(shù)的得分?jǐn)?shù)為條件進(jìn)行篩選后得到靶點(diǎn)1312個(gè)，將4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的目標(biāo)靶點(diǎn)合并，刪除重復(fù)值。使用R語(yǔ)言將藥物靶點(diǎn)與獲得的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行整合，刪除重復(fù)值后合并得到共同靶點(diǎn)1412個(gè)，取交集得135個(gè)。

2.5.3 藥物-活性成分-疾病-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò) 將獲得的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0軟件，構(gòu)建“藥物-活性成分-疾病-靶點(diǎn)”的調(diào)控圖，共得到節(jié)點(diǎn)177個(gè)和關(guān)系603條，結(jié)果見(jiàn)圖2，經(jīng)計(jì)算degree值較高的化學(xué)成分分別是山柰素、甘草素、7-羥基香豆素、防己菲堿、黃芪紫檀烷苷。

圖2 瀉肺利水湯“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 “Active ingredient-target” network diagram of Xiefei Lishui decoction

2.5.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和核心基因預(yù)測(cè) 應(yīng)用STRING網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)，構(gòu)建交集基因的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，將其進(jìn)一步利用Cytoscape 3.9.0構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)分析圖，并篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)（見(jiàn)圖3），圖中共有節(jié)點(diǎn)140個(gè)，邊1437條，根據(jù)degree值排序，處于核心位置的靶點(diǎn)為T(mén)NF、AKT1、EGFR、VEGFA、ESR1，提示這些靶點(diǎn)在瀉肺利水湯治療心力衰竭中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

圖3 瀉肺利水湯治療心衰相關(guān)靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig 3 PPI network of the relevant targets of Xiefei Lishui decoction in the treatment of heart failure

2.5.5 GO功能富集和KEGG通路富集 通過(guò)Cytoscape 3.9.0軟件計(jì)算活性成分-核心靶點(diǎn)及運(yùn)行相關(guān)腳本后，進(jìn)行基因功能注釋?zhuān)℅O）富集分析和京都基因組百科全書(shū)（KEGG）通路富集分析，GO中包括3個(gè)模塊：生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞成分（CC）和分子功能（MF），篩選條件為P＜0.05；同樣，Q＜0.05時(shí)獲得的KEGG通路被認(rèn)為是最重要的信號(hào)通路。通過(guò)GO富集分析共獲得2329個(gè)富集結(jié)果，包括2084個(gè)BP，主要涉及激酶活性的正向調(diào)節(jié)、對(duì)MAPK 級(jí)聯(lián)的正向調(diào)節(jié)、對(duì)外源性刺激物的反應(yīng)、上皮細(xì)胞增殖等；共91個(gè)CC，主要涉及膜筏、膜微區(qū)、神經(jīng)元細(xì)胞體、囊泡腔、分泌顆粒腔等；有154個(gè)MF，主要涉及內(nèi)肽酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、絲氨酸水解酶活性、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性等（見(jiàn)圖4）。KEGG富集分析后，得到154條通路富集結(jié)果，主要涉及PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、癌癥中的蛋白聚糖、Rap1信號(hào)通路等。提示瀉肺利水湯可能通過(guò)上述信號(hào)通路對(duì)心力衰竭起到治療作用（見(jiàn)圖5）。

圖4 GO富集分析Fig 4 GO enrichment analysis

圖5 KEGG富集分析Fig 5 KEGG enrichment analysis

2.5.6 潛在核心活性成分-核心靶點(diǎn)分子對(duì)接預(yù)測(cè) 根據(jù)“藥物-活性成分-疾病-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)中的degree值排序，結(jié)合文獻(xiàn)，選取化合物中degree＞20的山柰素、甘草素、7-羥基香豆素、防己菲堿、黃芪紫檀烷苷等5個(gè)主要成分，分別與5個(gè)核心基因進(jìn)行分子對(duì)接。一般認(rèn)為結(jié)合能小于-5.0 kJ·mol-1，就表明分子與靶點(diǎn)之間有良好的結(jié)合活性，若小于-7.0 kJ·mol-1，則說(shuō)明結(jié)合活性很強(qiáng)[16]，結(jié)果表明5個(gè)成分與核心基因均有良好的結(jié)合力，具體見(jiàn)表2。

表2 分子對(duì)接Tab 2 Molecular docking

3 討論

心力衰竭是各種心臟病發(fā)病末期或嚴(yán)重臨床階段，主要表現(xiàn)為呼吸困難、心悸、疲乏、體液潴留等癥狀，充分緩解水鈉潴留有效減輕患者癥狀、降低患者再住院率、提高生活質(zhì)量的重要措施[1]。中醫(yī)認(rèn)為，其主要病機(jī)多為心肺氣虛，氣化不利，導(dǎo)痰濕內(nèi)阻，治療多以益氣利水為法[17]。在此基礎(chǔ)上，北京中醫(yī)醫(yī)院許心如教授提出“瀉肺利水”法治療心力衰竭的學(xué)術(shù)觀(guān)點(diǎn)，并取得了良好的臨床療效[18]。為了進(jìn)一步闡明瀉肺利水對(duì)心力衰竭的治療作用，本研究采用UHPLCQ-Exactive-MS/MS方法結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，鑒定出瀉肺利水湯水提物的化學(xué)成分82個(gè)，其中山柰素、甘草素、7-羥基香豆素、防己菲堿、黃芪紫檀烷苷等活性成分具有較多的作用靶點(diǎn)，是瀉肺利水合劑治療心力衰竭的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗病毒等藥理作用；現(xiàn)代研究表明，下調(diào)炎癥因子的表達(dá)、減少氧化應(yīng)激反應(yīng)、調(diào)控細(xì)胞凋亡在心力衰竭的治療中具有重要意義[19]。

通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲱A(yù)測(cè)到AKT1、IL1B、TP53、TNF、VEGFA等5個(gè)核心基因。GO分析顯示，瀉肺利水治療心力衰竭的生物過(guò)程集中在激酶活性的正向調(diào)節(jié)、對(duì)MAPK 級(jí)聯(lián)的正向調(diào)節(jié)，其中還涉及對(duì)外源性刺激物的反應(yīng)、對(duì)上皮細(xì)胞增殖的反應(yīng)的調(diào)節(jié)等。KEGG 通路分析表明，內(nèi)肽酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、絲氨酸水解酶活性、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性，可能是治療機(jī)制中的重要通路。另外TNF信號(hào)通路是重要的炎癥通路[17]。TNF-α廣泛存在于心力衰竭患者活檢組織中，被認(rèn)為是心力衰竭疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要因子[20]。實(shí)驗(yàn)證明，抑制TNF-α信號(hào)通路表達(dá)能夠改善心力衰竭大鼠的心功能，對(duì)心力衰竭的防治具有重要意義[21]。

綜上所述，本研究充分考慮藥物煎煮過(guò)程中可能發(fā)生的化學(xué)成分變化，采用UHPLC-Q-Exactive-MS/MS技術(shù)對(duì)瀉肺利水湯化學(xué)成分進(jìn)行了鑒定，并通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討了其治療心力衰竭的主要活性成分及作用機(jī)制。研究結(jié)果表明瀉肺利水湯可能是通過(guò)山柰素、甘草素、7-羥基香豆素、防己菲堿、黃芪紫檀烷苷等成分作用于AKT1、IL1B、TP53、TNF、VEGFA等靶點(diǎn)，進(jìn)一步通過(guò)調(diào)控內(nèi)肽酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、絲氨酸水解酶活性、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性等信號(hào)通路發(fā)揮多成分、多靶點(diǎn)治療心力衰竭的作用。