王雪，荊紫琪，李妍怡，李楚，閆天月，黃曉濱，張玉杰，馬鵬凱（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488）

二氫丹參酮Ⅰ（dihydrotanshinone Ⅰ，DHT）是從中國傳統(tǒng)植物丹參的根莖中提取出的一種脂溶性菲醌類成分，具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈和改善心肌缺血等作用[1]。研究表明，DHT對(duì)卵巢癌、肝癌、胃癌等多種惡性腫瘤均具有良好的治療作用[2-5]。盡管DHT具有極高的藥用價(jià)值，但存在水溶性差、靶向性差、副作用大等問題，極大限制了其臨床應(yīng)用和新藥開發(fā)。

聚合物納米粒是以適當(dāng)?shù)妮d體材料與藥物結(jié)合形成的具有納米尺度的藥物制劑[6-7]。納米粒作用優(yōu)勢在于藥物可包封于納米粒中以提高溶解度，通過其納米尺度特有的腫瘤增強(qiáng)的滲透和滯留效應(yīng)（EPR效應(yīng)）選擇性在腫瘤部位聚集，實(shí)現(xiàn)被動(dòng)靶向功能[8]。并且可通過各類功能分子對(duì)聚合物材料進(jìn)行修飾實(shí)現(xiàn)特定功能，如針對(duì)腫瘤細(xì)胞過表達(dá)的受體或抗原，通過氨基酸、糖類、多肽和抗體等對(duì)納米粒進(jìn)行修飾，利用配體-受體或抗原-抗體的特異性相互作用，進(jìn)一步提高納米粒對(duì)腫瘤細(xì)胞的主動(dòng)靶向能力，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞攝取，增加胞內(nèi)藥物濃度以提高藥效[9-10]。

近年來，以免疫檢查點(diǎn)阻斷（immune checkpoint blockade，ICB）為代表的免疫療法逐漸成為腫瘤治療主流[11-13]。目前以程序性死亡受體-1（programmed death 1，PD-1）及其配體1（programmed death 1 ligand 1，PD-L1）[14]為靶點(diǎn)的免疫檢查點(diǎn)阻斷療法最為成熟[15]。阿替利珠單抗（atezolizumab，ATEZO）是針對(duì)PD-L1的人源化免疫球蛋白G1單克隆抗體，通過作用于腫瘤細(xì)胞過表達(dá)的PD-L1，阻止PD-1和PD-L1相互結(jié)合，激活免疫細(xì)胞殺傷腫瘤[16-19]。有研究發(fā)現(xiàn)，通過抗PD-L1單抗或多肽修飾納米載體[20]，可以提高藥物對(duì)腫瘤組織靶向性，與化療藥物產(chǎn)生協(xié)同治療作用，更好地治療腫瘤。

基于此，本研究以聚乳酸-羥基乙酸-聚乙二醇-馬來酰亞胺（PLGA-PEG-Mal）為載體材料，制備載DHT納米粒，提高DHT生物利用度及腫瘤組織靶向性，并在納米粒表面修飾ATEZO，制備主動(dòng)靶向PD-L1的ATEZO DHT NP，進(jìn)一步提高腫瘤細(xì)胞靶向性和胞內(nèi)藥物濃度，提高抗腫瘤藥效。

1 材料

1.1 動(dòng)物

7周齡BALB/c雄性裸鼠36只，體重（20±2）g[北京維通利華生物技術(shù)有限公司，合格許可證號(hào)：SCXK（京）2021-0006]。飼養(yǎng)期間自由進(jìn)水進(jìn)食，實(shí)驗(yàn)流程符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和保護(hù)的相關(guān)規(guī)定。

1.2 試藥

二氫丹參酮Ⅰ（純度：98%，成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：210409）；甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸（mPEG-PLGA，批號(hào)：RM0212213）、PLGA-PEG-Mal（批號(hào)：RA0220627）（西安瑞禧生物科技有限公司）；阿替利珠單抗注射液（上海羅氏制藥公司，批號(hào)：H0228801）；Sephadex G-50 medium（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20210930）；2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷鹽酸鹽（Traut’s試劑，純度：98%，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：J28GS156194）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：090321220106）；人胃癌細(xì)胞HGC-27（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司）；IR808（純度：99%，上海凱瑜琳醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：IR808-202001）；Annexin-V-FITC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（北京百瑞極生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：273D0101）；注射用紫杉醇脂質(zhì)體（南京綠葉制藥有限公司，批號(hào)：221120921）。

1.3 儀器

RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；LGJ-10真空冷凍干燥機(jī)（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）；ZEN3600 Nano微射流均質(zhì)機(jī)（上海諾澤流體科技有限公司）；T10 basic S025高速分散機(jī)（德國IKA）；1290 Infinity Ⅱ超高效液相色譜儀[安捷倫科技（中國）有限公司]；Malvern Zetasizer Nano-ZS動(dòng)態(tài)光散射粒度儀（英國Malvern Instruments）；TCS-SP8激光共聚焦顯微鏡（德國Leica）；SRSPECTROstar Nano多功能酶標(biāo)儀（德國BMG）；A00-1-1102流式細(xì)胞儀[貝克曼庫爾特商貿(mào)（中國）有限公司]。

2 方法與結(jié)果

2.1 DHT NP的制備

采用乳化溶劑擴(kuò)散法制備DHT NP。稱取處方量mPEG-PLGA和DHT溶解在丙酮中，作為有機(jī)相，乳化劑溶于去離子水中作為水相，將有機(jī)相逐滴滴入水相后在高速分散機(jī)作用下分散30 min，形成粗乳液，粗乳液經(jīng)微射流均質(zhì)機(jī)整粒形成細(xì)乳液，將細(xì)乳液滴入5倍體積的4℃冷水中，固化形成納米?；鞈乙骸ＰD(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除丙酮后，納米粒溶液經(jīng)50 kDa超濾離心管4℃離心3次（3000 g，15 min），去除游離藥物，收集超濾離心管上部溶液，凍干，得到DHT NP。

2.2 載藥量和包封率的測定

采用超高效液相色譜法對(duì)DHT進(jìn)行含量測定。色譜條件：流動(dòng)相為甲醇和水（80∶20），色譜柱為Akzo Nobel Kromasil C18（4.6 mm×150 mm，5μm），檢測波長為280 nm，流速為0.8 mL·min-1，柱溫為25℃。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證符合藥典要求。

將DHT NP完全溶解在甲醇中，定容后測定DHT含量，計(jì)為W總；取等量DHT NP溶液超濾離心去除游離藥物，純化后的DHT NP溶液溶解在甲醇中，測定DHT NP中封裝的DHT含量，計(jì)為WD；將等量純化后的DHT NP溶液凍干得到DHT NP，稱重計(jì)為WNP，載藥量和包封率計(jì)算如下：包封率（%）＝WD/W總×100%；載藥量（%）＝WD/WNP×100%。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化DHT NP制備工藝

以有機(jī)相濃度（A）、藥物與載體質(zhì)量比（B）、有機(jī)相與水相體積比（C）為影響因素（見表1），以包封率為指標(biāo)，利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見表2和3，方差分析結(jié)果表明，整體模型未達(dá)到顯著水平（P＜0.05），可通過直觀分析進(jìn)行判斷。由直觀分析可知，3個(gè)因素對(duì)DHT NP的影響程度依次為A＞C＞B，最優(yōu)工藝條件確定為A2B1C2，即有機(jī)相濃度為1.5%，藥物與載體質(zhì)量比1∶2，有機(jī)相與水相體積比為1∶1.8。在此條件下，DHT NP 的二氫丹參酮Ⅰ載藥量和包封率分別為11.73% 和 54.49%。

表1 因素水平Tab 1 Factor and level

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Orthogonal experimental

表3 誤差分析Tab 3 Error analysis

DHT NP的制備工藝如下：精密稱取DHT 5 mg、mPEG-PLGA 10 mg于反應(yīng)瓶中，加入1 mL丙酮，超聲溶解形成有機(jī)相；精密稱取膽酸鈉36 mg溶于1.8 mL去離子水中形成水相；高速分散作用下形成粗乳液，經(jīng)微射流均質(zhì)機(jī)整粒，均質(zhì)強(qiáng)度10 000 psi，均質(zhì)15 min形成細(xì)乳液；將細(xì)乳液滴入5倍體積的4℃去離子水中固化形成納米?；鞈乙?。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方法去除納米?；鞈乙褐械挠袡C(jī)溶劑，超濾離心管離心除去未包封的藥物。上述制備條件下，預(yù)凍后冷凍干燥48 h，即得DHT NP。在此條件下進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，3次試驗(yàn)得到DHT NP包封率的平均值為54%，與理論值接近，說明模型可靠。

2.4 ATEZO DHT NP 的制備

取1 mL 阿替利珠單抗注射液（60 mg·mL-1）置10 kDa超濾離心管中，加4 mL pH 8.0 PBS，4℃超濾離心（3000 g，15 min）至液體量剩余1/2，再補(bǔ)加等體積PBS，重復(fù)5次后，得到ATEZO磷酸鹽緩沖溶液。通過Traut’s試劑對(duì)抗體進(jìn)行巰基化修飾，BCA法和DTNB法分別測定蛋白和巰基含量，計(jì)算每個(gè)抗體修飾巰基個(gè)數(shù)。ATEZO溶液與Traut’s試劑反應(yīng)比例為1∶20時(shí)，單位抗體修飾的巰基為7.7個(gè)，為最佳反應(yīng)比例，ATEZO溶液與Traut’s試劑反應(yīng)時(shí)間為1 h時(shí)，溶液渾濁，所以ATEZO溶液巰基化的反應(yīng)時(shí)間不宜過長。將巰基化ATEZO與馬來酰亞胺基封端的DHT NP混合，在黑暗中攪拌12 h，反應(yīng)后的混合物在12 000 r·min-1、4℃下離心40 min，收集含有游離巰基化ATEZO的上清液，采用BCA法測定上清液中游離的單抗含量。同時(shí)收集離心后沉淀進(jìn)行凍干，獲得ATEZO DHT NP，ATEZO偶聯(lián)率和載藥量計(jì)算公式如下，ATEZO DHT NP的ATEZO偶聯(lián)率為56.93%，載藥量為14.43%。偶聯(lián)率（%）＝（ATEZO投入量-上清中ATEZO的量）/ATEZO投入量×100%；載藥量（%）＝（ATEZO投入量-上清液中ATEZO的量）/ATEZO DHT NP的質(zhì)量×100%。

2.5 納米粒的表征

將凍干的納米粒分別分散于超純水和含10%FBS的PBS（10 mol·L-1，pH 7.4）溶液中，并且分別取靜置2、4、8、12、24、48、72 h后的納米粒溶液，用馬爾文粒度儀進(jìn)行粒徑的測定，觀察粒徑變化，同時(shí)測量納米粒電位。如圖1所示，DHT NP粒徑為184.9 nm，Zeta電位為-18.55 mV；ATEZO DHT NP粒徑為246.9 nm，Zeta電位為-19.57 mV，72 h內(nèi)兩種納米粒在水溶液和含10% FBS的PBS溶液中粒徑變化不大，表明其具有良好的穩(wěn)定性。將DHT NP和ATEZO DHT NP分散于超純水中，選擇合適的濃度，吸取500 μL樣品，多次滴加于電鏡專用銅網(wǎng)表面，待自然干燥后，通過透射電子顯微鏡拍攝到DHT NP和ATEZO DHT NP都近似球形，分布均勻，結(jié)果見圖2。

圖2 DHT NP和ATEZO DHT NP的透射電鏡圖（×30 000）Fig 2 Morphology image of DHT NP and ATEZO DHT NP（×30 000）

2.6 納米粒體外釋藥特性

采用透析法對(duì)體外釋藥特性進(jìn)行考察。精密稱取納米粒分散于PBS溶液中，得1 mg·mL-1的含藥溶液（以DHT計(jì)）。精密移取1.0 mL納米粒溶液于透析袋中（MWCO：7 kDa），置于50 mL的釋放介質(zhì)中（含0.2%吐溫80的PBS溶液），在溫度為37℃、轉(zhuǎn)速為100 r·min-1的恒溫振蕩水浴培養(yǎng)箱搖床中振蕩。分別于0、1、2、4、8、12、24、48、72 h后取1.0 mL釋放介質(zhì)，測定DHT濃度Cd，與此同時(shí)補(bǔ)加1.0 mL新鮮的釋放介質(zhì)至原釋放介質(zhì)中。按下式計(jì)算校正濃度Cc，其中Wt為納米粒中DHT的含量，每組設(shè)3個(gè)平行樣品，計(jì)算累積釋放率（F，%）：F＝（Cc×50）/Wt×100%。

結(jié)果如圖3所示，DHT NP和ATEZO DHT NP在前10 h的累積釋放不超過60%，然后在接下來的62 h內(nèi)觀察到藥物釋放緩慢，表明納米顆粒具有持續(xù)釋藥的特性。

2.7 激光共聚焦顯微鏡評(píng)價(jià)藥物體外細(xì)胞攝取情況

將HGC-27細(xì)胞以1×106個(gè)/孔接種于玻璃底激光共聚焦細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，加入熒光標(biāo)記的納米顆粒IR808 NP和ATEZO IR808 NP（以IR808計(jì)，終濃度為4 μmol·L-1），與細(xì)胞共孵育3 h后，除去含藥培養(yǎng)基，細(xì)胞核用Hoechst 33342染色15 min后，用激光共聚焦激光掃描顯微鏡觀察細(xì)胞。為了進(jìn)一步證實(shí)PD-L1受體介導(dǎo)的特異性細(xì)胞攝取，HGC-27細(xì)胞用ATEZO預(yù)處理30 min后，加入ATEZO IR808 NP，觀察熒光強(qiáng)度變化。如圖4所示，游離的IR808、IR808 NP和ATEZO IR808 NP都能被腫瘤細(xì)胞有效攝取，經(jīng)ATEZO修飾后，細(xì)胞對(duì)ATEZO IR808 NP的攝取進(jìn)一步增強(qiáng)。此外，當(dāng)ATEZO預(yù)處理30 min時(shí)，由于ATEZO的阻斷作用，ATEZO IR808 NP的熒光強(qiáng)度下降。

圖4 HGC-27細(xì)胞對(duì)不同載藥納米粒的攝取Fig 4 Uptake of different drug-loaded nanoparticles by HGC-27 cells

2.8 體外藥效學(xué)評(píng)價(jià)

采用MTT法評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性。HGC-27細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板中。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長期時(shí)，用100 μL的藥物與細(xì)胞共孵育，濃度梯度分別為0.5、1、2、4、8、16、32和64 μmol·L-1（以DHT計(jì)），48 h后小心移去含藥培養(yǎng)基，每孔加入100 μL的MTT（0.5 mg·mL-1）溶液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，去除各孔內(nèi)溶液，加入150 μL DMSO，振蕩后，用酶標(biāo)儀測定570 nm處各孔吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率，結(jié)果如圖5所示。

圖5 DHT和DHT+ATEZO，DHT NP 和 ATEZO DHT NP的細(xì)胞毒性（n＝6）Fig 5 Cell viability of DHT，DHT+ATEZO，DHT NP and ATEZO DHT NP（n＝6）

采用流式細(xì)胞儀和Annexin-V-FITC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡情況。HGC-27細(xì)胞以1×106個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，各給藥組處理細(xì)胞（以DHT計(jì)，濃度為8 μmol·L-1）。孵育48 h后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，以1800 r·min-1離心5 min，然后分散在100 μL預(yù)冷的PBS中。在黑暗中分別加入5 μL的Annexin-V-FITC/7和PI染色液，孵育15 min。用400 μL PBS稀釋細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡水平，以未加藥液處理孔為對(duì)照組，對(duì)照組與各給藥組均設(shè)有3個(gè)復(fù)孔。結(jié)果如圖6所示，游離DHT、游離DHT+ATEZO、DHT NP和ATEZO DHT NP組的細(xì)胞凋亡率分別為（12.6±0.213）%、（13.2±0.145）%、（39.6±0.243）%、（44.2±0.318）%，與其他各組相比，ATEZO DHT NP的細(xì)胞凋亡率最高，與細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，表明ATEZO DHT NP可以增強(qiáng)DHT誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。

圖6 對(duì)照組及各給藥組的細(xì)胞凋亡情況Fig 6 Cells apoptosis of the control group and different administration groups

2.9 體內(nèi)藥效學(xué)評(píng)價(jià)

HGC-27腫瘤移植BALB/c裸鼠模型的建立。用4℃的PBS將HGC-27細(xì)胞稀釋為2×108個(gè)·mL-1的細(xì)胞懸液，取0.1 mL細(xì)胞懸液，裸鼠用戊巴比妥鈉（50 mg·kg-1）麻醉后，在裸鼠右腋窩皮下注射接種進(jìn)行造模，腫瘤體積達(dá)到100 mm3時(shí)進(jìn)行給藥。將36只荷瘤裸鼠隨機(jī)分為6組：生理鹽水組，游離DHT組，游離DHT+ATEZO組，DHT NP組，ATEZO DHT NP組，紫杉醇脂質(zhì)體（Lps-P）陽性對(duì)照組，每組6只。給藥方案為：DHT 15 mg/（kg·d），ATEZO 10 mg/（kg·d），Lps-P 10 mg/（kg·d），2 d給藥一次，給藥周期14 d。在給藥期間，2 d記錄一次裸鼠體重，并使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤體積，結(jié)果如圖7所示。給藥結(jié)束后第2日，所有裸鼠脫頸椎處死，剝離腫瘤組織稱重，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率＝（生理鹽水組腫瘤重量-給藥組腫瘤重量）/生理鹽水組腫瘤重量×100%。

圖7 不同給藥組荷瘤裸鼠腫瘤體積的變化曲線（n＝6）Fig 7 Tumor volume of nude mice in different administration groups（n＝6）

結(jié)果如圖8所示，與生理鹽水組相比，所有給藥組均可抑制HGC-27腫瘤裸鼠的腫瘤生長，ATEZO DHT NP組腫瘤抑制率是原藥DHT組1.90倍，約為DHT NP組的1.75倍。切取部分腫瘤組織用4%多聚甲醛固定，腫瘤組織切片用HE染色和TUNEL染色評(píng)估藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用，如圖9所示，相比于DHT NP組，ATEZO DHT NP組腫瘤組織大片壞死，腫瘤細(xì)胞凋亡增強(qiáng)，證實(shí)了修飾ATEZO以后可增強(qiáng)DHT NP的抗腫瘤療效。

圖9 腫瘤組織HE染色（×30）（A）和TUNEL染色（×30，×300）（B）Fig 9 HE staining（×30）（A）and TUNEL staining（×30，×300）of tumor tissue sections（B）

2.10 體內(nèi)藥物安全性評(píng)價(jià)

在整個(gè)給藥期間，各組荷瘤裸鼠體重基本保持不變，表明ATEZO DHT NP沒有明顯的全身毒性。給藥結(jié)束后第2日，所有裸鼠脫頸椎處死，取血及心、肝、脾、肺、腎臟組織。血液于4℃、3500 r·min-1離心15 min，收集血漿，并通過生理生化測定試劑盒[丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 ALT 測定試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶AST測定試劑盒、尿素氮 BUN 測定試劑盒、肌酐 CRE 測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）]分析谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、肌酐（CRE）和尿素氮（BUN）生化指標(biāo)，ATEZO DHT NP給藥組ALT的含量為（119.73±2.989）U·L-1，AST的含量為（146.21±8.423）U·L-1，CRE的含量為（26.064±2.756）μmol·L-1，BUN的含量為（7.813±0.139）mg·dL-1，均在正常范圍內(nèi)，表明ATEZO DHT NP無肝腎毒性。心、肝、脾、肺、腎臟組織用4%多聚甲醛固定，組織切片后用HE染色評(píng)估組織的形態(tài)學(xué)變化，結(jié)果如圖10所示，顯示各治療組組織形態(tài)沒有明顯變化，進(jìn)一步確證納米粒具有良好的安全性。

圖10 裸鼠心、肝、脾、肺、腎臟各臟器的HE染色結(jié)果（×100）Fig 10 HE stained micrographs of heart、liver、spleen、lung、kidney organ sections（×100）

2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析（ANOVA）來比較兩組或兩組以上之間的數(shù)據(jù)差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

DHT是中藥丹參的活性成分，具有抗腫瘤作用，作為極具開發(fā)潛力的藥物分子，如何提高DHT生物利用度和腫瘤靶向性是其臨床轉(zhuǎn)化面臨的關(guān)鍵問題。納米藥物遞送系統(tǒng)可以改善藥物理化性質(zhì)，增強(qiáng)藥物腫瘤靶向能力和降低藥物毒性。免疫治療聯(lián)合化療是目前癌癥治療的研究熱點(diǎn)，本研究選擇ATEZO作為靶頭，對(duì)DHT NP進(jìn)行表面修飾，不僅可以通過納米粒的被動(dòng)靶向作用提高藥物在腫瘤部位的分布，而且可以借助ATEZO對(duì)腫瘤細(xì)胞表面過表達(dá)PD-L1的靶向作用提高藥物的胞內(nèi)濃度，增強(qiáng)藥物抗腫瘤作用。

本研究通過乳化溶劑擴(kuò)散法制備DHT NP，正交試驗(yàn)考察有機(jī)相濃度、藥物與載體質(zhì)量比和有機(jī)相與水相體積比對(duì)包封率的影響，優(yōu)化得到最佳制備工藝，制得的DHT NP的載藥量為11.73%，包封率為54.49%。將巰基化的阿替利珠單抗修飾在DHT NP表面，通過BCA法測定蛋白偶聯(lián)率和載藥量分別為56.93%和14.43%。粒度儀測量DHT NP粒徑為184.9 nm，粒徑合適；修飾ATEZO后ATEZO DHT NP的粒徑有所增加，電位降低；72 h內(nèi)ATEZO DHT NP在水溶液和含10% FBS的PBS溶液中粒徑變化不明顯，表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性；透射電鏡觀測到DHT NP和ATEZO DHT NP形貌為球形；納米粒體外釋藥情況良好。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ATEZO DHT NP可顯著抑制HGC-27細(xì)胞的增殖；促進(jìn)HGC-27細(xì)胞的凋亡。體內(nèi)抗腫瘤藥效評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，ATEZO DHT NP在動(dòng)物模型上具有良好的抑制腫瘤生長的能力，腫瘤壞死情況明顯。在整個(gè)給藥周期內(nèi)，ATEZO DHT NP組動(dòng)物體重?zé)o明顯變化，血漿ALT、AST、CRE和BUN水平均在正常范圍內(nèi)，未見明顯毒性作用；HE染色結(jié)果顯示各主要臟器未見明顯異常，說明ATEZO DHT NP具有較好的生物安全性。ATEZO DHT NP在提高抗腫瘤效果方面具有巨大的潛力，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以進(jìn)一步驗(yàn)證藥物具有激活體內(nèi)T淋巴細(xì)胞免疫從而殺傷腫瘤的作用，為深入開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。