張 淼,高興紅,胡 源

(1.武漢大學(xué)中南醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,湖北 武漢 430071;2.遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,貴州 遵義 563006;3.武漢大學(xué)中南醫(yī)院 神經(jīng)心理科,湖北 武漢 430071)

慢性腦低灌注狀態(tài)是血管性認(rèn)知障礙及阿爾茨海默病共同的病理生理機制［1］。腦低灌注狀態(tài)引起腦組織缺血缺氧,由此產(chǎn)生一系列病理生理過程,包括過量氧自由基的產(chǎn)生、繼發(fā)性的神經(jīng)炎癥反應(yīng)以及血腦屏障破壞,最終引起認(rèn)知功能損害［2］。研究慢性腦低灌注有助于為相關(guān)癡呆的臨床防治提供新對策。

間斷禁食(intermittent fasting, IF)即間斷性在一段較長時間(一般為16或24 h)內(nèi)不攝入或攝入極少能量,已被證明在包括阿爾茨海默病、缺血性腦卒中和帕金森病等多種神經(jīng)疾病動物模型中具有神經(jīng)保護效果［3］。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn),腦缺血后間斷禁食可以改善慢性腦低灌注大鼠認(rèn)知損害,減輕海馬神經(jīng)損傷和降低炎癥因子水平［4］。但間斷禁食能否以及如何調(diào)節(jié)慢性腦缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng),目前并不清楚。小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)中起主要作用［5-6］,Liddelow等［7］研究發(fā)現(xiàn),LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)中,A1極化的星形膠質(zhì)細(xì)胞而非小膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基對于神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞具有直接殺傷作用。此后的研究發(fā)現(xiàn),星形膠質(zhì)細(xì)胞A1極化現(xiàn)象廣泛存在于衰老、帕金森以及阿爾茨海默等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中,改善星形膠質(zhì)細(xì)胞極化可改善上述疾病動物模型的神經(jīng)損傷［8］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),慢性腦低灌注可誘導(dǎo)海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞A1極化［9］。間斷禁食對CCH誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞A1極化是否具有調(diào)節(jié)作用,目前尚不清楚。本研究擬探究間斷禁食對CCH動物海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞極化的影響,并構(gòu)建離體慢性腦缺血模型,誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞極化,探討其具體機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 Ponesimod(Selleck,S8241);氯化鈷(CoCl2,Sigma, C8661);小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞系BV2及小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22細(xì)胞購于普諾賽生命科技有限公司(Procell Life Science& Technology Co.,Ltd.);超濾管購買自Sigma(UFC-9010);Trizol試劑 (Invitrogen, CA, US No.155960 26);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Vazyme Biotech Co, Nanjing, China No. Q311-02);DAPI(上海碧云天生物技術(shù)研究所);S1P1一抗購買自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,C3d抗體購買自R&D公司,其余Western Blot一、二抗及熒光二抗均購買自Abcam公司;CCK8試劑盒購買自Abbkine公司,乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性試劑盒購買自南京建成公司。

1.1.2 實驗動物和分組 6周SPF級雄性SD大鼠,體重(200±20)g,購買于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司,于武漢大學(xué)中南醫(yī)院動物實驗中心進行飼養(yǎng)。新購進的SD大鼠首先進行3 d適應(yīng)性飼養(yǎng)(12 h/12 h晝夜循環(huán))后再進行下一步實驗操作。所有大鼠都給予充足的食物與潔凈的飲用水。實驗前將30只大鼠分為假手術(shù)組、慢性腦低灌注組及慢性腦低灌注+間斷禁食3組。其中間斷禁食組在手術(shù)后1周開始隔日間斷禁食,即第1日撤除所有飼料,次日不限制飲食,以此類推,直至術(shù)后第8周取材停止。所有實驗過程均經(jīng)過武漢大學(xué)中南醫(yī)院動物倫理委員會審批(NO：WP2020-08067),操作過程中盡可能減輕動物痛苦。

1.2 方法

1.2.1 雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎手術(shù) 先將大鼠置于誘導(dǎo)盒中用4%異氟烷誘導(dǎo)約3 min,再將大鼠呈仰臥位置于保溫墊上給予2%異氟烷持續(xù)吸入維持麻醉。沿頸部正中線依次剪開皮膚和肌肉,鈍性分離筋膜,尋找胸鎖乳突肌與頸正中肌夾角內(nèi)側(cè)的頸動脈鞘,彎鑷小心分離出搏動的頸動脈并避免損傷迷走神經(jīng),4號不可吸收手術(shù)縫線先結(jié)扎近心端,再結(jié)扎遠(yuǎn)心端。一側(cè)結(jié)扎結(jié)束后結(jié)扎另一側(cè)。手術(shù)完畢后,將大鼠呈側(cè)臥位放置回籠內(nèi)并給于充足的食物與飲水。假手術(shù)組僅分離出頸動脈而不進行結(jié)扎。

1.2.2 Western blot 術(shù)后8周,大鼠經(jīng)4%異氟烷過量麻醉致死后斷頭取腦。新鮮組織快速剝除顱骨,去除腦膜后置于冰上,取雙側(cè)海馬放入液氮中速凍后存放于-80 ℃冰箱; Western blot檢測時,取大鼠海馬組織或離心后細(xì)胞,置于冰上,加入RIPA裂解液,充分裂解后檢測蛋白濃度,加入上樣緩沖液后混勻,金屬浴煮沸變性后上樣。根據(jù)蛋白濃度于SDS-PAGE凝膠進行上樣,每孔20 μg蛋白,設(shè)置電泳條件為75 V,30 min + 120 V,60 min,待溴酚藍(lán)近玻璃底邊時停止電泳,裁剪合適大小的PVDF膜,200 mA恒流轉(zhuǎn)膜,根據(jù)目的蛋白分子量大小選擇合適轉(zhuǎn)膜時間。轉(zhuǎn)膜后4 ℃冰箱內(nèi)一抗孵育過夜,次日漂洗后加入相應(yīng)HRP二抗,室溫孵育1 h后ECL顯色。

1.2.3 免疫熒光 對大鼠進行麻醉,用4%多聚甲醛經(jīng)心肌灌注腦組織,30%蔗糖脫水后用OCT包埋切片。PBS潤洗腦片,用稀釋的一抗在4 ℃孵育過夜,次日PBS清洗5次,然后與相應(yīng)熒光二抗常溫孵育1 h后DAPI染色。在Olympus bx53熒光顯微鏡下拍攝海馬CA1區(qū)圖像(至少3個視野)。用ImageJ統(tǒng)計每個視野中的GFAP陽性細(xì)胞及GFAP/C3d雙陽性細(xì)胞,二者比值為A1細(xì)胞比率。

1.2.4 原代星型膠質(zhì)細(xì)胞的提取 取出生1 d內(nèi)的SD大鼠乳鼠,麻醉后75%酒精噴灑消毒皮膚,將頭顱剪下后置于培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)皿預(yù)先加入分離液：HBSS+1%胎牛血清+1%青霉素(鏈霉素)溶液。剪開顱骨,分離兩側(cè)皮質(zhì),去除腦干及小腦,剝離腦膜。0.05%胰酶消化皮質(zhì)5 min后加入完全培養(yǎng)基中和,隨后將液體分離成單細(xì)胞混懸液,離心去除上清后加入2 mL完全培養(yǎng)基重懸,接種至T75培養(yǎng)瓶中。約1周后將T75培養(yǎng)瓶置于軌道搖床,37 ℃ 220 r/min 6 h去除小膠質(zhì)細(xì)胞即獲得純化后的原代星型膠質(zhì)細(xì)胞。

1.2.5 細(xì)胞分組及處理 根據(jù)文獻(xiàn)報道,我們采用梯度濃度S1P1抑制劑ponesimod預(yù)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞,然后加入相應(yīng)MCM處理［10］。即慢性缺氧模型濃度摸索實驗,氯化鈷以不同濃度(0、50、75、100 μmol/L)加入培養(yǎng)基中誘導(dǎo)缺氧48 h后收取條件培養(yǎng)基。將小膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基(microglia conditioned medium, MCM)加入原代星形膠質(zhì)細(xì)胞并進行后續(xù)極化標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄水平及星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基(microglia conditioned medium, ACM)毒性檢測。對于藥物實驗,不同濃度Ponesimod預(yù)處理原代星形膠質(zhì)細(xì)胞4 h后,換液并加入各組MCM處理24 h后檢測極化標(biāo)志物及毒性。條件培養(yǎng)基進行超濾處理的方式相同。收集細(xì)胞上清后1 000 r/min 10 min離心去除細(xì)胞碎片;隨后將液體轉(zhuǎn)移至超濾管中,4 000 g, 20 min 4 ℃離心后小心吸取濃縮后的上清即為條件培養(yǎng)基。

1.2.6 RT-PCR 吸去細(xì)胞培養(yǎng)液上清后,DPBS洗滌細(xì)胞3遍,隨后加入Trizol。加入氯仿12 000 r/min 15 min 4 ℃離心后小心吸取中間水相層,加入等體積異丙醇混勻后靜置10 min。 預(yù)先以DEPC水配置75%乙醇,在12 000 r/min 10 min 4 ℃條件下離心后棄去上清后加入75%乙醇,再次7 500 r/min 15 min 4 ℃離心。棄去上清并小心吸去殘留乙醇,加入適量DEPC水后55 ℃ 10 min促溶解,nanodrop測定濃度。逆轉(zhuǎn)錄條件：42 ℃ 2 min去除基因組DNA, 50 ℃ 15 min ,85 ℃ 5 s,4 ℃維持后完成逆轉(zhuǎn)錄。SYBR Green 熒光染料試劑盒構(gòu)建qPCR體系,設(shè)立3個復(fù)孔。qPCR條件：預(yù)變性 95 ℃ 30 s,循環(huán)反應(yīng) 95 ℃ 5 s至60 ℃(根據(jù)不同引物的 Tm 值進行調(diào)整) 30 s,循環(huán)反應(yīng) 40 次,溶解曲線 95 ℃ 30 s～60 ℃ 60 s～95 ℃ 15 s。引物序列見表1。

表1 各指標(biāo)PCR引物序列

1.2.7 CCK8檢測細(xì)胞增殖活性 在無菌96孔板上以每孔1 500～2 000個細(xì)胞的密度接種細(xì)胞,待次日貼壁后藥物干預(yù)。使用各組星型膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基對HT22細(xì)胞作用48 h。作用時間結(jié)束后,吸盡孔內(nèi)液體,配制含有10%CCK8試劑的完全培養(yǎng)基加入每孔中并設(shè)置空白對照,37 ℃孵育2 h后在450 nm波長的酶標(biāo)儀中測定吸光度(OD值)。

1.2.8 乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性檢測 在無菌96孔板上接種HT22細(xì)胞,待次日貼壁后,使用相應(yīng)組別ACM加入細(xì)胞處理48 h后將上清吸出。按試劑盒說明書,將緩沖液及輔酶加入上清液中混勻,37 ℃孵育15 min。隨后在混合液中加入2,4-二硝基苯肼混勻,37 ℃孵育15 min后加入NaOH溶液室溫放置3 min,酶標(biāo)儀檢測450 nm波長檢測吸光度,按說明書計算各組細(xì)胞上清LDH活性。

2 結(jié)果

2.1 間斷禁食對慢性腦低灌注大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞極化的影響 與對照組相比,慢性腦缺血組大鼠海馬C3d(A1極化標(biāo)志物)/GFAP雙標(biāo)星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯增多(P<0.05,圖1A,1B),間斷禁食可降低慢性腦低灌注大鼠海馬C3d/GFAP雙重標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量,提示間斷禁食可抑制慢性腦低灌注誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞A1極化。

A：各組大鼠海馬CA1區(qū)C3d/GFAP雙重?zé)晒鈽?biāo)記,Scale Bar = 50 μm;B：各組C3d/GFAP陽性細(xì)胞占GFAP總細(xì)胞百分比;Con：對照組;CCH：慢性腦低灌注組;IF：慢性腦低灌注+間斷禁食組;*：與Con相比,P<0.05;#：與CCH組比較,P<0.05;n=4。圖1 間斷禁食對慢性腦低灌注大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞極化的影響

2.2 間斷禁食對慢性腦低灌注大鼠海馬神經(jīng)損傷的影響 與對照組相比,慢性腦缺血組NeuN及PSD95(分別為神經(jīng)元及突觸標(biāo)志物)蛋白表達(dá)下調(diào),間斷禁食可恢復(fù)慢性腦低灌注引起的NeuN和PSD95蛋白水平下降(P<0.05,圖2A、B)。此外,間斷禁食可抑制慢性腦低灌注誘導(dǎo)的S1P1蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05,圖2A、B)。以上結(jié)果提示間斷禁食下調(diào)S1P1蛋白水平的同時可減輕慢性腦低灌注大鼠海馬的神經(jīng)損傷。

A：各組大鼠海馬組織S1P1、NeuN和PSD95蛋白條帶;B：條帶分析統(tǒng)計結(jié)果;Con：對照組;CCH：慢性腦低灌注組;IF：慢性腦低灌注+間斷禁食組;*：與Con相比,P<0.05;#與CCH組比較,P<0.05;n=4。圖2 間斷禁食對慢性腦低灌注大鼠海馬神經(jīng)損傷的影響

2.3 體外慢性缺氧誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞極化模型的構(gòu)建 采用氯化鈷處理小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)慢性缺氧,將其條件培養(yǎng)基(MCM)加入星形膠質(zhì)細(xì)胞,取后者條件培養(yǎng)基(ACM)加入神經(jīng)元細(xì)胞系HT22細(xì)胞(圖3A)。與對照組相比,各組濃度氯化鈷(50、75、100 μmol/L)誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞ACM均可引起HT22細(xì)胞活性下降(P<0.05,圖3B),LDH釋放增加(P<0.05,圖3C)。提示不同濃度氯化鈷慢性處理均可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞毒性極化。檢測各組星形膠質(zhì)細(xì)胞A1極化標(biāo)志物,雖然各組A1標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄均顯著高于對照組(P<0.05,圖3D),但100 μmol/L氯化鈷組A1標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄水平更高,因此取該濃度進行后續(xù)實驗。

A：體外實驗流程;B：不同濃度氯化鈷慢性處理后星形膠質(zhì)細(xì)胞ACM對HT22細(xì)胞活性的影響;C：各組HT22細(xì)胞上清LDH活性;D：不同濃度氯化鈷慢性處理后星形膠質(zhì)細(xì)胞A1標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄水平; CoCl2 ：氯化鈷;*：與0 μmol/L比較,P<0.05;n=3。圖3 慢性缺氧誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞極化體外模型的構(gòu)建

2.4 S1P1抑制劑Ponesimod能夠模擬間斷禁食抑制體外缺氧誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞A1極化及神經(jīng)毒性 采用梯度濃度S1P1抑制劑Ponesimod預(yù)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞,然后加入相應(yīng)MCM處理。結(jié)果顯示,高濃度(10 μmol/L)Ponesimod可降低慢性缺氧誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞S1P1蛋白表達(dá)和A1極化標(biāo)志物C3轉(zhuǎn)錄增加(P<0.05,圖4A、D),減輕慢性缺氧條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞ACM對HT22細(xì)胞活性的抑制(P<0.05,圖4B),同時減少慢性缺氧ACM誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞LDH釋放(P<0.05,圖4C)。

A：各組星形膠質(zhì)細(xì)胞S1P1蛋白表達(dá)及分析;B：各組ACM對HT22細(xì)胞活性的影響;C：各組HT22細(xì)胞上清LDH活性;D：RT-PCR法檢測各組星形膠質(zhì)細(xì)胞A1極化標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄水平;Con：對照組,CoCl2 ：氯化鈷,PNS：Ponesimod;*：與Con組比較,P<0.05;#：與CoCl2組比較,P<0.05;n=3。圖4 Ponesimod模擬間斷禁食抑制體外缺氧條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞A1極化及神經(jīng)毒性

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)間斷禁食在降低慢性腦低灌注大鼠海馬鞘氨醇-1-磷酸受體1(sphingosine 1-phosphate receptor 1,S1P1)表達(dá)的同時,抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞A1極化及神經(jīng)損傷;進一步構(gòu)建離體模型,發(fā)現(xiàn)使用S1P1抑制劑能夠模擬間斷禁食抑制慢性缺氧誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞A1極化及其神經(jīng)損傷作用,因此星形膠質(zhì)細(xì)胞S1P1可能是間斷禁食抑制慢性腦缺血神經(jīng)炎癥作用的重要靶點。

Liddelow等［7］發(fā)現(xiàn),使用脂多糖誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞,將其條件培養(yǎng)基(MCM)加入星形膠質(zhì)細(xì)胞,可刺激后者產(chǎn)生毒性極化(A1極化)作用,具體表現(xiàn)為形態(tài)及轉(zhuǎn)錄組的改變,如大量表達(dá)C3、H2D1、Serping1等基因。同時A1細(xì)胞可通過非細(xì)胞接觸的方式,分泌毒性物質(zhì),其條件培養(yǎng)基(ACM)具有神經(jīng)毒性,可誘導(dǎo)神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞死亡;而脂多糖直接刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞則無此現(xiàn)象。此外,該研究還發(fā)現(xiàn),小膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基對神經(jīng)細(xì)胞亦無殺傷作用,提示星形膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)炎癥中具有直接神經(jīng)損傷作用的環(huán)節(jié)［7］。 此后的研究發(fā)現(xiàn),星形膠質(zhì)細(xì)胞A1極化現(xiàn)象廣泛存在于肌萎縮側(cè)索硬化、帕金森病以及阿爾茨海默病等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中,藥物或分子手段抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞極化可改善上述疾病動物模型的神經(jīng)損傷［11］。間斷禁食為單位時間內(nèi)(如1 d或16 h)不攝入或攝入極低能量的一種飲食方式,在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域,間斷禁食被證明對阿爾茨海默病、帕金森病及急性缺血性卒中等多種疾病的動物模型具有神經(jīng)保護作用［12］。本題組前期研究也發(fā)現(xiàn),間斷禁食能夠降低慢性腦低灌注大鼠海馬炎癥因子表達(dá),改善其認(rèn)知損害［4］,但間斷禁食抗神經(jīng)炎癥的機制以及具體作用的細(xì)胞亞型及分子靶點并不清楚。本題組及其他課題組既往研究表明,慢性腦低灌注能夠引起星形膠質(zhì)細(xì)胞極化［9, 13］,本研究發(fā)現(xiàn)間斷禁食能夠降低慢性腦低灌注大鼠海馬GFAP/C3d共標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞(A1極化細(xì)胞)數(shù)量,揭示了間斷禁食在慢性腦缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥中的作用靶細(xì)胞。

S1P1是神經(jīng)酰胺代謝產(chǎn)物鞘氨醇-1-磷酸的受體之一。Gaire等［14］發(fā)現(xiàn)在小鼠腦缺血再灌注模型中,腦S1P1表達(dá)顯著增加,而敲除該模型小鼠腦中的S1P1表達(dá)則能夠降低小鼠腦梗死體積、降低神經(jīng)炎癥因子的表達(dá),該結(jié)果表明S1P1的活化在腦缺血中是神經(jīng)炎癥反應(yīng)的上游事件。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,S1P1主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞;本研究中間斷禁食抑制慢性腦低灌注大鼠海馬S1P1表達(dá)上調(diào)和星形膠質(zhì)細(xì)胞A1極化,離體實驗使用S1P1抑制劑能夠模擬間斷禁食,抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞A1極化,發(fā)揮神經(jīng)保護作用,提示抑制S1P1介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞A1極化可能是間斷禁食發(fā)揮抗炎作用的重要機制。間斷禁食如何下調(diào)S1P1目前機制不明,值得進一步研究。

相對于傳統(tǒng)S1P1抑制劑如fingolimod、Ponesimod對于S1P1特異性明顯增強,且可通過抑制S1P1改善雙環(huán)己酮草酰二腙(銅螯合劑)誘導(dǎo)的扣帶回脫髓鞘病變［10］。本研究在離體缺氧模型中也發(fā)現(xiàn)Ponesimod可模擬間斷禁食對星形膠質(zhì)細(xì)胞A1極化的抑制作用,下調(diào)A1極化標(biāo)志物并降低ACM毒性。但也注意到,Ponesimod下調(diào)A1極化標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄水平的作用較微弱,提示極化標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄水平與ACM神經(jīng)毒性之間不完全對應(yīng)。已有文獻(xiàn)提示,突觸核蛋白、致病性朊蛋白等均可引起星形膠質(zhì)細(xì)胞毒性極化［15-16］,但其極化后毒性成分與傳統(tǒng)方式,即脂多糖誘導(dǎo)的毒性極化可能存在差異。此后的研究將著重于細(xì)化星形膠質(zhì)細(xì)胞激活后的分類并研究其在不同病理條件下的毒性成分［17］。

綜上所述,S1P1可能介導(dǎo)間斷禁食對慢性腦低灌注大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞毒性極化的抑制作用,本文為慢性腦低灌注相關(guān)癡呆疾病的防治提供藥物靶點,并為間斷禁食這一非藥物干預(yù)手段提供臨床轉(zhuǎn)化依據(jù)。