楊 群, 凌琪涵, 魏 勇, 寧 強, 孔發(fā)明, 周藝凡, 張海琳, 王 潔*

1. 西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院, 重慶 400715

2. 西南大學(xué)長江經(jīng)濟帶農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展研究中心, 重慶 400715

引 言

氮素(N)是柑橘生長發(fā)育所必需的大量營養(yǎng)元素, 在其新陳代謝、 生理生化和產(chǎn)量形成等方面有重要作用。 適時適量施氮能提高柑橘產(chǎn)量、 改善柑橘品質(zhì)。 因此, 需要一套快捷準確的柑橘氮素營養(yǎng)診斷方法用于指導(dǎo)施氮。 植株體內(nèi)的氮素可以分為營養(yǎng)性氮(assimilable nitrogen, AN)、 結(jié)構(gòu)性氮(structural nitrogen, SN)和功能性氮(functional nitrogen, FN)三大類[1], 三類形態(tài)氮素處于動態(tài)變化中, 各組分在葉片中的含量與分布對植物葉片生理生化反應(yīng)有一定的指示作用。 前人對油菜的研究表明: 儲存氮中的FN是油菜葉片擴張和維持光合作用的主要氮源[2]。 本研究前期結(jié)果表明, 相比于AN和SN, 柑橘葉片中FN含量最高(約為全氮含量的60%), 柑橘果實膨大期和果實轉(zhuǎn)色期時的葉片F(xiàn)N含量與當年果實產(chǎn)量和品質(zhì)的相關(guān)性最高。 因此, 監(jiān)測柑橘果實膨大期和果實轉(zhuǎn)色期的葉片F(xiàn)N含量, 理論上能更好地表征柑橘氮素營養(yǎng)狀況并指導(dǎo)施肥。

隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展, 越來越多的新技術(shù)應(yīng)用于作物氮素營養(yǎng)診斷。 可見-近紅外光譜技術(shù)作為實時、 無損、 精確的作物營養(yǎng)監(jiān)測技術(shù)已應(yīng)用于植物葉片或冠層全氮含量的監(jiān)測, 并取得了良好的結(jié)果[3-5]。 報道有運用蘿崗橙葉片反射光譜和支持向量回歸建立蘿崗橙葉片氮含量的預(yù)測模型, 測試集R2為0.97[6]。 可見-近紅外光譜通常由數(shù)千個光譜變量組成, 其中包含許多非信息量或共線變量。 全波段建模不僅會增加模型的復(fù)雜度和計算時間, 還會影響模型的預(yù)測能力[7], 故從全波段中選擇特征波長以減小可見-近紅外光譜數(shù)據(jù)的維數(shù)。 有研究采用相關(guān)系數(shù)法、 主成分分析等算法選取光譜的特征波長, 建立了基于支持向量機的柑橘葉片氮含量預(yù)測模型, 驗證集R2高達0.95。 近年來, 可見-近紅外光譜技術(shù)不斷快速發(fā)展與完善, 利用可見-近紅外光譜擬合作物生化組分含量也開始興起[8]。

采集柑橘果實膨大期和果實轉(zhuǎn)色期的葉片可見-近紅外光譜; 分析了各生育期不同施氮處理下柑橘葉片光譜特征, 通過相關(guān)系數(shù)法篩選出與葉片功能性氮含量相關(guān)性較高的敏感波段; 運用3種雙波段植被指數(shù)、 偏最小二乘回歸和3種機器學(xué)習(xí)方法構(gòu)建基于全波段和敏感波段的柑橘葉片功能性氮含量無損監(jiān)測模型, 并分析了光譜變換和預(yù)處理對于構(gòu)建的柑橘葉片功能性氮含量無損監(jiān)測模型精度的影響, 以期實現(xiàn)對柑橘葉片功能性氮含量的實時無損監(jiān)測。

1 實驗部分

1.1 試驗設(shè)計

試驗地位于重慶市長壽區(qū)龍河鎮(zhèn)八卦村, 供試柑橘品種為“春見”橘橙[Citrus reticulate ×(C.reticulata × C.sinenesis)], 設(shè)置4個不同施氮處理, 分別為N0(0 kg N·ha-1)、 N1(83.3 kg N·ha-1)、 N2(166.7 kg N·ha-1, 當?shù)赝扑]施氮)和N3(333.3 kg N·ha-1, 農(nóng)戶習(xí)慣施氮量), 每個處理三組重復(fù), 每組重復(fù)4棵樹。 氮磷鉀分別用尿素(46% N)、 過磷酸鈣(12% P2O5)、 硫酸鉀(51% K2O)提供。 肥料運籌: 分三次施用, 萌芽肥(3月下旬)、 果實膨大肥(7月下旬)和果實轉(zhuǎn)色肥(10月下旬)。 其中, 萌芽肥施氮50%, 施磷20%, 施鉀25%; 果實膨大肥施氮20%, 施磷20%, 施鉀50%; 果實轉(zhuǎn)色肥施氮30%, 施磷60%, 施鉀25%。 施肥方式穴施, 肥料混勻后覆土。

1.2 不同施氮處理柑橘葉片可見-近紅外光譜與不同形態(tài)氮含量測定

分別于柑橘果實膨大期和果實轉(zhuǎn)色期采集營養(yǎng)性春梢葉片, 利用美國ASDFieldSpec 4便攜式地物光譜儀測定其反射光譜, 該儀器波段值為350～2 500 nm, 其中350～1 000 nm光譜采樣間隔為1.4 nm, 光譜分辨率為3 nm; 1 000～2 500 nm光譜采樣間隔為2 nm, 光譜分辨率為6.5～8.5 nm。 測定完光譜后, 將葉片迅速裝入保鮮袋封口, 放入冰盒帶回實驗室。 將葉片用純水洗凈, 吸水紙吸干表面水分, 剪碎混勻, 保存于-80 ℃冰箱中備用。

營養(yǎng)性氮(AN)含量測定: 硝態(tài)氮使用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的植物硝態(tài)氮測試盒測定, 其原理是: 在濃酸條件下, 硝酸根與水楊酸反應(yīng), 生成硝基水楊酸, 硝基水楊酸在堿性條件下(pH>12)呈黃色, 在一定范圍內(nèi), 其顏色深淺與含量成正比, 可在410 nm波長下測定吸光度, 通過以下公式計算硝態(tài)氮含量。

標準曲線:y=0.007 8x+0.007 3,R2=0.999 7

式中,V樣總為加入提取液體積, 1 mL;W為樣本質(zhì)量, g。

銨態(tài)氮、 氨基酸和酰胺態(tài)氮的測定采用改良的茚三酮溶液比色法: α-氨基酸與水合茚三酮溶液一起加熱, 經(jīng)氧化脫氨變成相應(yīng)的α-酮酸, 酮酸進一步脫羧變成醛, 水合茚三酮則被還原, 在弱酸環(huán)境中, 還原型茚三酮、 氨和另一分子水合茚三酮反應(yīng), 縮合生成藍紫色物質(zhì)。 根據(jù)藍紫色的深淺, 在570 nm波長下測定吸光值。 本實驗中在茚三酮試劑中添加乙二醇并補加正丁醇和丙醇, 可以克服茚三酮的不穩(wěn)定性。 以亮氨酸的氮含量做標準曲線[9]。

結(jié)構(gòu)性氮(SN)含量測定: 稱量約0.4 g葉片在液氮下磨碎, 加1 mL磷酸鈉緩沖液(Buffer)研磨, 并轉(zhuǎn)移到離心管中, 重復(fù)2次。 通過在4 ℃下15 000 g離心15 min, 棄上清液。 將1 mL含3%SDS的磷酸鹽緩沖液添加到沉淀中, 然后在90 ℃的水中加熱5 min。 將混合物以4 500 g離心10 min。 重復(fù)3次, 棄上清液(圖1)。 將沉淀用乙醇沖洗幾遍, 定量濾紙過濾, 將沉淀和濾紙在50 ℃下烘干, 凱氏法定氮[2]。

圖1 結(jié)構(gòu)性氮提取流程

全氮(TN)含量測定: 稱取烘干磨碎后的葉片干樣約0.3 g, 使用凱氏定氮法測定氮含量, 每份樣品測定2次, 取其平均值。

功能性氮(FN)含量(g·kg-1)=TN含量(g·kg-1)-AN含量(g·kg-1)-SN含量(g·kg-1)。

1.3 柑橘葉片功能性氮含量無損監(jiān)測模型構(gòu)建

建模樣品的選擇與劃分: 利用K-fold方法將整個樣本數(shù)據(jù)隨機劃分為建模集和驗證集兩部分, 建模集和驗證集分別占總數(shù)據(jù)集的70%和30%。

光譜數(shù)據(jù)的預(yù)處理與變式: 運用移動平均平滑(窗口寬度為3)、 卷積平滑(平滑點數(shù)為3)、 基線校正、 歸一化、 多元散射校正、 標準正態(tài)化變換等較為常用的幾種光譜預(yù)處理方法對原始光譜進行預(yù)處理, 光譜變換為倒數(shù)對數(shù)、 一階微分(導(dǎo)數(shù)間隙為5)和二階微分(導(dǎo)數(shù)間隙為5)三種。 對比分析其對建模精度的影響。

敏感波段的篩選: 運用相關(guān)系數(shù)法和主成分分析法篩選敏感波段。

不同建模方法的選擇: 運用植被指數(shù)法、 光譜化學(xué)計量法和機器學(xué)習(xí)法。 結(jié)合前人設(shè)計的減量精細采樣法思路, 基于降維思想采用降采樣法構(gòu)建三類植被指數(shù), 即在350～2 500 nm范圍內(nèi)每隔10個波段讀取葉片可見-近紅外光譜值(波段數(shù)據(jù)間隔為10 nm), 采用矩陣的形式, 兩兩組合所有可能波段構(gòu)建光譜指數(shù), 并與柑橘葉片F(xiàn)N含量進行直線擬合, 計算相應(yīng)的決定系數(shù)R2, 并確定R2最大的波長。 光譜化學(xué)計量法選用偏最小二乘回歸(partial least squares regression, PLSR)。 運用反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(back-propagation neural networks, BPNN)、 隨機森林(random forest, RF)和支持向量機(support vector machine, SVM)三種機器學(xué)習(xí)方法, 分別探討其建模精度。

模型評價參數(shù): 決定系數(shù)(coefficient of determination,R2)和均方根誤差(root mean squared error, RMSE)。 具體計算公式見式(1)和式(2)

(1)

(2)

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用ViewSpec Pro Version 6.0處理柑橘葉片光譜數(shù)據(jù)及對光譜進行變換, 葉片不同形態(tài)氮含量數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 16和IBM SPSS Statistics 23進行分析處理, 光譜預(yù)處理和分析建模在The Unscrambler X 10.4和Python完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同施氮處理的柑橘葉片可見-近紅外光譜特征

柑橘果實膨大期和轉(zhuǎn)色期不同施氮處理葉片的反射光譜如圖2所示。 不同施氮處理下, 柑橘果實膨大期和轉(zhuǎn)色期的葉片反射光譜曲線相似, 在可見光350～700 nm波段區(qū)域內(nèi), 反射率隨著施氮量的增加而降低, 而在近紅外700～1 300 nm波段范圍內(nèi), 反射率則隨著施氮量的增加而增加。 在柑橘果實膨大期, 不同施氮處理葉片光譜反射率在550 nm處差異最大, N0、 N1、 N2和N3處理的反射率分別為0.169、 0.166、 0.154和0.128。 在可見光區(qū)域, 葉片光譜主要受葉片中色素的影響, 而在近紅外區(qū)域, 葉片光譜主要受葉片內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)的影響。

2.2 柑橘葉片可見-近紅外光譜敏感波段篩選

對柑橘果實膨大期和轉(zhuǎn)色期葉片F(xiàn)N含量與葉片一階微分光譜(FDS)和原始光譜(OS)反射率進行相關(guān)性分析, 其相關(guān)系數(shù)見圖3。 在柑橘果實膨大期, 葉片F(xiàn)N含量與葉片一階微分光譜和原始光譜的相關(guān)性均較高, 最大相關(guān)系數(shù)高于0.8; 而在果實轉(zhuǎn)色期, 葉片F(xiàn)N含量與葉片一階微分光譜最大相關(guān)系數(shù)低于0.8, 與原始光譜最大相關(guān)系數(shù)僅為0.5。 柑橘不同生育期葉片F(xiàn)N含量與葉片一階微分光譜和原始光譜的相關(guān)性大小不同, 這與前人研究結(jié)果相似, 如報道有小麥抽穗期時的葉片碳氮比與冠層光譜反射率的相關(guān)性明顯高于小麥拔節(jié)期時葉片碳氮比與冠層反射率的相關(guān)性。 不同施氮處理下, 梨樹花后50 d(膨大Ⅰ期)的葉片氮含量與葉片光譜反射率的相關(guān)性高于花后80 d(膨大Ⅱ期)的葉片含氮量與葉片光譜反射率的相關(guān)性。 如圖3中箭頭所示, 篩選出與柑橘葉片F(xiàn)N含量相關(guān)系數(shù)絕對值大于0.6的波段作為敏感波段, 用于后續(xù)分析建模。 果實膨大期的敏感波段分別為450、 510、 530、 580、 620、 630、 680、 690、 740、 1 670、 1 740、 2 150、 2 280和2 320 nm; 果實轉(zhuǎn)色期的敏感波段分別為520、 530、 580、 590、 750、 1 670、 1 680、 1 775、 1 795和1 930 nm。

圖3 柑橘果實膨大期(a)和轉(zhuǎn)色期(b)時葉片功能性氮含量與一階微分光譜、 原始光譜相關(guān)性

2.3 不同建模方法對柑橘葉片功能性氮含量無損監(jiān)測模型精度的影響

分別將柑橘果實膨大期和轉(zhuǎn)色期的葉片樣本數(shù)據(jù)隨機劃分為建模集和驗證集。 果實膨大期的樣本總數(shù)為231, 其中建模集樣本數(shù)為161, 驗證集為70; 果實轉(zhuǎn)色期樣本總數(shù)為179, 建模集樣本數(shù)為125, 驗證集為54。 柑橘果實膨大期和轉(zhuǎn)色期建模集和驗證集具體統(tǒng)計數(shù)據(jù)分別如表1所示。

表1 柑橘果實膨大期和轉(zhuǎn)色期建模集和驗證集葉片樣本功能性氮含量

表2 柑橘果實膨大期時基于全波段和敏感波段的不同建模方法結(jié)果

表3 柑橘果實轉(zhuǎn)色期時基于全波段和敏感波段的不同建模方法結(jié)果

表4 果實膨大期和轉(zhuǎn)色期不同光譜處理的模型結(jié)果

圖5 果實膨大期敏感波段原始光譜RF建模(a)及驗證(b)結(jié)果

圖6 果實轉(zhuǎn)色期SNV預(yù)處理后BPNN建模及驗證結(jié)果

在柑橘果實膨大期和轉(zhuǎn)色期, 對葉片原始光譜進行SNV預(yù)處理, 可使結(jié)合BPNN構(gòu)建的柑橘葉片F(xiàn)N含量無損監(jiān)測模型預(yù)測精度提高。 這與前人在紫薯花青素含量上的研究結(jié)果相似, 利用SNV預(yù)處理全波段原始光譜, 在一定程度上提高了紫薯花青素含量定量預(yù)測模型的精度[12]。 綜上所述, 果實膨大期時利用柑橘葉片敏感波段原始光譜或?qū)θǘ卧脊庾V進行SNV預(yù)處理構(gòu)建的葉片F(xiàn)N含量無損監(jiān)測模型具有較好的精度, 而果實轉(zhuǎn)色期建議對葉片原始光譜進行SNV預(yù)處理構(gòu)建的葉片F(xiàn)N含量的無損模型精度更好。 此外, 前人研究結(jié)果表明, 結(jié)合不同預(yù)處理方法能在一定程度上提高建模精度, 后期應(yīng)當嘗試利用正交設(shè)計探討不同預(yù)處理方法相結(jié)合對于柑橘葉片功能性氮含量無損監(jiān)測模型精度的影響[13]。

3 結(jié) 論

(1)不同施氮處理下, 柑橘葉片光譜反射率在350～700 nm可見光區(qū)域隨著施氮量的增加而降低, 在700～1 350 nm近紅外區(qū)域則隨著施氮量的增加而升高。