章文,艾樂樂,譚偉龍,馮茜,錢宇清,薛松△（.江蘇省第二中醫(yī)院,江蘇 南京 0000;.東部戰(zhàn)區(qū)疾病預(yù)防控制中心,江蘇 南京 0000）

冠狀病毒（coronavirus，CoVs）是一種有包膜、非節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，屬于巢病毒目冠狀病毒科正冠狀病毒亞科。該亞科由α冠狀病毒屬、β冠狀病毒屬、γ冠狀病毒屬和δ冠狀病毒屬共四個(gè)屬組成[1]。目前主要采用qPCR方法對(duì)病毒核酸進(jìn)行檢測和定量，該方法具有高度的靈敏度和特異性[2]。自COVID-19暴發(fā)以來，許多實(shí)時(shí)qPCR（RT-qPCR）檢測試劑被開發(fā)出來，并且用于SARS-CoV-2的實(shí)驗(yàn)室檢測[3]。但qPCR的檢測需要專業(yè)的人員和較精密的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，且檢測時(shí)間至少需要1.5小時(shí)[4-6]。由于SARS-CoV-2疫情在全球范圍內(nèi)流行，出現(xiàn)了大量患者、無癥狀感染者和密切接觸者，如何更加快速、準(zhǔn)確檢測SARSCoV-2對(duì)疫情防控至關(guān)重要。本研究建立單管逆轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增（Reverse transcription recombinase aided amplification，RTRAA）方法，檢測SARS-CoV-2核衣殼（N）基因。運(yùn)用商用RTqPCR試劑和RT-RAA方法對(duì)127人份臨床咽拭子樣本進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果一致性達(dá)100%。本研究建立的RT-RAA法檢測SARSCoV-2，具有快速、靈敏、操作簡單及設(shè)備要求低等特點(diǎn)，對(duì)于當(dāng)前疫情下快速檢測SARS-CoV-2具有重要作用。

1 材料與方法

1.1 引物和探針設(shè)計(jì) 在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載20條SARS-CoV-2核酸序列，使用DNAMAN7.0軟件對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)。在目標(biāo)ORF1ab基因中發(fā)現(xiàn)一個(gè)保守區(qū)（GenBank：MT559038.1，position 3111-3406），根據(jù)這個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)RT-RAA引物和探針，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 RT-RAA方法建立 使用RT-RAA核酸擴(kuò)增試劑盒（熒光法）（江蘇奇天基因生物科技有限公司，中國）進(jìn)行建立檢測方法。反應(yīng)體系共50μL，其中，純化水，13μL；緩沖液Ⅵ，25μL；正向引物（10μM），2μL；反向引物（10μM），2μL；探針，0.5μL；DNA模板，5μL；乙酸鎂，2.5μL。按照上述反應(yīng)體系（除模板DNA和乙酸鎂外）配置混合液，將混合液手彈混勻短暫離心，加入42.5μL混合液至熒光基礎(chǔ)反應(yīng)單元中，輕柔手彈，使凍干粉充分重溶均勻，短暫離心將液體收集至管底，然后于每個(gè)反應(yīng)單元管蓋上加入2.5μL乙酸鎂溶液，之后向各反應(yīng)單元中加入模板DNA或陰性質(zhì)控品，充分混勻并離心。而后再將反應(yīng)單元轉(zhuǎn)移到QT-RAA-F1620儀器（江蘇奇天基因生物科技有限公司，中國）中，擴(kuò)增條件設(shè)定在39℃，反應(yīng)時(shí)間30分鐘。

1.3 RNA提取 使用病毒核酸提取試劑盒（TAKARA，大連，中國）提取106名疑似COVID-19患者的咽拭子樣本中的病毒核酸。取200ul咽拭子病毒液，經(jīng)過病毒裂解，核酸提取，用40ul RNase free dH2O洗脫后，放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 靈敏度實(shí)驗(yàn) 委托上海生工合成序列CTGCTCTTCAACCTGAA GAAGAGCAAGAAGAAGATTGGTTAGATGATGATAGTCAACAAA CTGTTGGTCAACAAGACGGCAGTGAGGACAATCAGACAACTAC TATTCAAACAATTGTTGAGGTTCAACCTCAATTAGAGATGGAAC TTACACCAGTTGTTCAGACTATTGAAGTGAATAGTTTTAGTGGTT ATTTAAAACTTACTGACAATGTATACATTAAA AATGCAGACATTGTGGAAGAAGCTAAAAAGG TAAAACCAACAGTGGTTGTTAATGCAGCCAA TGTTTACCTT構(gòu)建含新型冠狀病毒基因序列質(zhì)粒，載體：PUC57；載體大?。?710bp；克隆位點(diǎn)：SmaI；宿主菌：DH5α；抗性：氨芐?？截悢?shù)（拷貝/μL）=｛[6.02×1023]×[質(zhì)粒濃度（ng/μL）×10-9]｝/[DNA長度×660]）。將質(zhì)粒梯度稀釋為106、105、104、103、102、101、100拷貝/μl 7個(gè)濃度，依次對(duì)上述定量樣品利用RT-RAA反應(yīng)擴(kuò)增體系進(jìn)行測定，評(píng)價(jià)檢測方法的靈敏度。將ORF1ab基因的一段保守序列（GenBank: MT559038.1，position 3111-3406）構(gòu)建到質(zhì)粒上，載體：PUC57；載體大?。?710bp；克隆位點(diǎn)：SmaI；宿主菌：DH5α；抗性：氨芐。

1.5 特異性實(shí)驗(yàn) 選用5種呼吸道病毒對(duì)本實(shí)驗(yàn)的特異性進(jìn)行驗(yàn)證。用腺病毒3型、7型、55型，甲型流感病毒（2009H1N1，H3N2）和陽性樣本核酸作為模板，評(píng)價(jià)RT-RAA方法的特異性。5種呼吸道病毒核酸在本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.6 兩種方法對(duì)臨床樣本檢測 收集了106名新型冠狀病毒患者和疑似人員的咽拭子，所有樣本均由專業(yè)人員在P2實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行核酸的提取和檢測，提取的核酸樣本用RT-RAA和商用RT-qPCR兩種方法進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 靈敏度檢測 以梯度稀釋106-100copies/μl的7個(gè)RNA樣本為模板，驗(yàn)證RT-RAA方法的檢測靈敏度。結(jié)果顯示該方法在模板濃度為106-101copies/μl時(shí)，均表現(xiàn)出良好的擴(kuò)增曲線，100copy/μl時(shí)無擴(kuò)增曲線。該檢測方法的最低檢測濃度為10copies/μl。當(dāng)模板濃度大于103copies/μl時(shí)，反應(yīng)在第10分鐘時(shí)就表現(xiàn)出良好的擴(kuò)增曲線。見圖1。

圖1 RT-RAA檢測方法靈敏度檢測

2.2 特異性檢測 特異性檢測結(jié)果顯示，陽性對(duì)照和陽性樣本均表現(xiàn)出良好的擴(kuò)增曲線，腺病毒3型、7型、55型，甲型流感病毒（2009H1N1，H3N2）和陰性對(duì)照均無擴(kuò)增曲線。由此可知該檢測方法表現(xiàn)出良好的特異性。見圖2。

圖2 RT-RAA檢測方法特異性檢測

2.3 臨床樣本的檢測 使用商用RT-qPCR和RT-RAA檢測方法對(duì)106名COVID-19患者和疑似感染者的臨床咽拭子樣本進(jìn)行檢測，32個(gè)陽性和74個(gè)陰性樣本用這兩種檢測方法結(jié)果一致，說明該RT-RAA檢測方法具有良好的穩(wěn)定性，適合推廣應(yīng)用。

3 討論

據(jù)報(bào)道，SARS-CoV-2主要通過飛沫傳播，人感染SARSCoV-2并出現(xiàn)癥狀后，鼻咽部的病毒載量更高[7]。早期發(fā)現(xiàn)、早期隔離和治療對(duì)防止病毒傳播和臨床治療具有重要意義。目前對(duì)COVID-19的診斷主要依靠RT-qPCR的方法，中國衛(wèi)生機(jī)構(gòu)通過大量的RT-qPCR檢測，精準(zhǔn)定位傳染源，采取有效的隔離措施，最終國內(nèi)COVID-19已得到遏制，但其在全球其他國家仍在迅速傳播。由于RT-qPCR方法需要精密的儀器設(shè)備、專業(yè)的操作人員和較長的檢測時(shí)間，許多不發(fā)達(dá)國家很難進(jìn)行大規(guī)模檢測。RT-RAA方法具有操作簡單、檢測用時(shí)短和高靈敏度等特點(diǎn)，這對(duì)SARS-CoV-2感染的早期診斷和及時(shí)采取衛(wèi)生措施具有重要意義[8]。

本實(shí)驗(yàn)建立的SARS-CoV-2的RT-RAA方法，采用重組酶介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增法檢測SARS-CoV-2核酸。該方法利用重組酶能夠在常溫下實(shí)現(xiàn)DNA解鏈并快速進(jìn)行擴(kuò)增，不依賴精密設(shè)備、反應(yīng)快速。該方法所使用的RAA熒光檢測儀體積較小，便于攜帶，只需提供39℃等溫環(huán)境，電量消耗小，使用鋰電池即可運(yùn)行，適用于現(xiàn)場快速檢測。當(dāng)檢測核酸濃度大于103copies/ul時(shí)，可在10分鐘內(nèi)檢測出陽性樣本。該方法的靈敏度可達(dá)到10copies/ul，與RT-qPCR的檢測靈敏度接近。運(yùn)用該方法檢測5種呼吸道病毒和SARS-CoV-2陽性樣本，只有陽性樣本出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，其他5種呼吸道病毒均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，表現(xiàn)出良好的特異性。使用RTRAA和商用RT-qPCR方法對(duì)106名COVID-19患者和疑似感染者咽拭子樣本進(jìn)行檢測，兩種方法的一致性為100%，表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，該種方法的檢測結(jié)果值得信賴。

本研究建立的RT-RAA檢測方法較現(xiàn)有的RT-qPCR方法具有操作簡單、檢測時(shí)間短、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，為COVID-19疫情的快速診斷提供了準(zhǔn)確可靠的檢測技術(shù)，為此次疫情提供了更加低成本的檢測方法。