彭躍嬌,祝壹青,黃麗云（南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院,江西 南昌 330000）

多發(fā)性骨髓瘤（MM）是一種好發(fā)于老年人，且僅次于淋巴瘤的第二大血液系統(tǒng)的惡性腫瘤，是漿細(xì)胞在骨髓中惡性克隆增殖性疾病，可致復(fù)雜多樣的臨床表現(xiàn)，缺乏特異性，容易導(dǎo)致漏診、誤診，至今尚不能治愈[1]。MM臨床漏診、誤診的原因大多與患者首次就診科室并非血液科和醫(yī)生缺乏對(duì)MM的認(rèn)識(shí)有關(guān)[2]。研究顯示MM患者的血液標(biāo)本存在血液異常分離現(xiàn)象，同時(shí)血液異常分離結(jié)果對(duì)MM的檢出具有重要的篩查價(jià)值[3]。目前，MM的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明晰，可能與免疫功能異常及基因突變有關(guān)，其中造血微環(huán)境與骨髓瘤細(xì)胞的相互作用是其發(fā)病的重要原因[4-5]。細(xì)胞因子在MM的增殖及破骨細(xì)胞的激活等方面具有重要作用[6]。研究顯示，IL-17和IL-35兩個(gè)因子之間的免疫平衡對(duì)循壞、消化、腫瘤及免疫系統(tǒng)等疾病的發(fā)病及病情的控制有重要意義[7]。本研究通過(guò)分析不同分離結(jié)果的MM患者的臨床資料，治療前后血液分離結(jié)果的轉(zhuǎn)變情況及血清IL-17、IL-35、β2-MG水平差異，從IL-17和IL-35間免疫平衡的角度闡釋血液不同分離結(jié)果對(duì)MM患者病情及療效評(píng)估的可能的生物學(xué)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 入組患者 選取我院2016年10月-2022年3月收治的初診143例MM患者為研究對(duì)象，其中男性82例，女性61例；年齡34-82歲，平均（62.80±12.43）歲；ISS分期：Ⅰ期22例，Ⅱ期37例，Ⅲ期84例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①M(fèi)M的診斷、分期符合《中國(guó)多發(fā)性骨髓瘤診治指南（2020年修訂）》[8]的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②臨床病歷資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并自身免疫性疾病及各種結(jié)締組織病者；②透析管采集血液者；③應(yīng)用造影劑者；④合并其他惡性腫瘤者。本研究均獲得患者知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)后進(jìn)行。

1.2 試劑與儀器 IL-17 ELISA試劑盒（批號(hào)：20210325）、IL-35 ELISA試劑盒（批號(hào)：20210410）購(gòu)自南京建成生物工程有限公司；β2-MG試劑盒購(gòu)自西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品（上海）有限公司配套試劑；ST-360酶標(biāo)儀，西門子全自動(dòng)蛋白分析儀（BN*系統(tǒng)：BN*II System）。

1.3 檢測(cè)指標(biāo) 采集初診患者分離膠真空采血管血液標(biāo)本，離心分離血清，離心轉(zhuǎn)速為3500r/min，離心半徑為12cm，離心時(shí)長(zhǎng)為10min，觀察離心后血液分離結(jié)果，對(duì)不能獲得足量血清的患者用肝素鋰抗凝血漿進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。根據(jù)血液標(biāo)本離心后的分離結(jié)果將其分為對(duì)照組和異常組，收集初診患者的一般檢驗(yàn)指標(biāo)，觀察并比較治療前后血液分離結(jié)果和IL-17、IL-35及β2-MG水平的變化情況，進(jìn)一步分析β2-MG和IL-17、IL-35水平的相關(guān)性。

1.4 療效評(píng)估 經(jīng)3個(gè)以上完整療程治療后，參照國(guó)際骨髓瘤工作組（international myeloma working group，IMWG）標(biāo)準(zhǔn)[9]對(duì)MM患者進(jìn)行療效評(píng)價(jià)，包括完全緩解（CR）、非常好地部分緩解（VGRP）、部分緩解（PR）、PR以下。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗(yàn)；正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)量資料兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)治療前后比較采用LSD-t檢驗(yàn)；連續(xù)變量間的相關(guān)性采用Pearson檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MM患者標(biāo)本離心后的血液分離結(jié)果 根據(jù)血液分離結(jié)果，將143例初診MM患者分為對(duì)照組（121例）和異常組（22例），異常分離率為15.38%。對(duì)照組分離膠真空采血管離心后分3層，依次為：血清、分離膠、紅細(xì)胞，其中血清和紅細(xì)胞的分離效果良好且比例適當(dāng)（見(jiàn)圖1）；異常組分離膠采血管血液標(biāo)本離心后分4層，依次為：血清、紅細(xì)胞和血清的混合層、分離膠、紅細(xì)胞，血清含量極少，其下紅細(xì)胞和血清分離不良，底層有少量紅細(xì)胞（見(jiàn)圖2）。

圖1 血液正常分離結(jié)果

圖2 血液異常分離結(jié)果

2.2 MM患者一般臨床資料的比較 基線特征比較顯示，兩組患者的性別分布、血CA、LDH、Cre的比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩組患者的免疫分型、ISS分期比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。異常組患者TP、Ig水平顯著高于對(duì)照組，Hb、Hct顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組患者一般臨床資料比較

2.3 MM患者血清IL-17、IL-35和β2-MG水平比較 異常組患者血清IL-17和β2-MG水平高于對(duì)照組，IL-35水平低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 MM患者血清IL-17、IL-35和β2-MG水平比較

2.4 MM患者治療前后血液分離結(jié)果的變化情況 對(duì)照組121例患者治療后有101例獲得CR、VGPR以及PR，其血液分離結(jié)果未發(fā)生變化；而20例獲得PR療效以下的患者中有6例血液分離結(jié)果轉(zhuǎn)為異常。異常組22例患者治療后有10例獲得CR、VGPR療效，其血液分離結(jié)果轉(zhuǎn)為正常；8例患者獲得PR療效，其中6例血液分離結(jié)果轉(zhuǎn)為正常；PR療效以下患者有4例，其血液分離結(jié)果未發(fā)生改變。見(jiàn)表3。

表3 治療前后兩組患者血液分離結(jié)果的變化情況

2.5 MM患者治療前后血清IL-17、IL-35、β2-MG水平分析 治療后，對(duì)照組血液分離結(jié)果未發(fā)生變化的患者IL-17、β2-MG水平低于治療前，IL-35水平高于治療前；血液轉(zhuǎn)為異常的患者IL-17、β2-MG水平高于治療前，IL-35水平低于治療前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。治療后，異常組血液分離結(jié)果轉(zhuǎn)為正常的患者IL-17、β2-MG水平低于治療前，IL-35水平高于治療前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；血液分離結(jié)果未發(fā)生變化的患者IL-17、IL-35、β2-MG水平與治療前相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4。

表4 治療前后不同血液分離結(jié)果的MM患者血清IL-17、IL-35、β2-MG水平分析

2.6 MM患者血清β2-MG水平與IL-17及IL-35相關(guān)性的分析 患者血清β2-MG水平與IL-17水平呈正相關(guān)（r=0.702，P＜0.05），與IL-35水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.713，P＜0.05）。

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤（MM）病情進(jìn)展大體分為三個(gè)階段，由意義未明的單克隆免疫球蛋白血癥（MGUS）緩慢進(jìn)展為無(wú)癥狀型MM（SMM），進(jìn)而進(jìn)一步發(fā)展為活動(dòng)型MM（AMM），此過(guò)程經(jīng)歷約10-20年或更長(zhǎng)的疾病演變[10]。初診醫(yī)師容易將發(fā)病初期MM患者表現(xiàn)的出血、貧血、骨痛、感染、腎功能不全等非特異性的臨床癥狀誤診為失血性貧血、營(yíng)養(yǎng)不良性貧血、肺炎、慢性腎炎等疾病，是造成誤診、漏診率較高的重要原因[11]。

近年來(lái)本科室在工作中發(fā)現(xiàn)離心后出現(xiàn)分層異?；虬橛蟹蛛x膠漂浮的血液標(biāo)本，追蹤病例后發(fā)現(xiàn)大多患者被確診為MM，提示MM患者血液標(biāo)本存在異常分離現(xiàn)象。日常工作中發(fā)現(xiàn)血液異常分離標(biāo)本，通過(guò)及時(shí)與臨床醫(yī)師聯(lián)系，建議完善相關(guān)檢查，顯著降低了本院對(duì)MM的誤診、漏診率[12]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于MM患者分離膠采血管存在異常分離現(xiàn)象大多為個(gè)案報(bào)道[13]。研究[14]發(fā)現(xiàn)血清密度和黏度可能是影響分離膠位置及血液分離不良的主要原因，推測(cè)任何影響血清密度和黏度的因素都有可能導(dǎo)致血液分離異常。本研究通過(guò)觀察143例初診MM患者血液離心結(jié)果，發(fā)現(xiàn)異常分離率為15.38%，提示血液異常分離現(xiàn)象對(duì)多發(fā)性骨髓瘤具有一定的初篩價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn)異常組存在更高比例的Ⅲ期患者，TP、Ig水平顯著升高，Hb、Hct顯著降低，提示異常組患者存在更高的腫瘤負(fù)荷，與張靖宇[15]等人的研究結(jié)果一致。異常組免疫分型主要以IgG型和IgA型為主，對(duì)照組除這兩種分型外，還有IgD型和輕鏈型，可能是由于IgD和輕鏈在體內(nèi)含量較少，升高的TP、Ig不足以引起血液分離異常，提示血液異常分離現(xiàn)象可能更易發(fā)生在分期較晚的IgG和IgA型MM患者中，因此血液異常分離結(jié)果對(duì)MM患者的免疫分型可能有一定的提示意義。

β2-MG主要由淋巴細(xì)胞合成，正常生理狀態(tài)下其生成、釋放及清除處于動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程[16]。MM患者β2-MG升高可能與瘤細(xì)胞異常增殖過(guò)度合成、瘤細(xì)胞壞死釋放、淋巴細(xì)胞代償性活化等因素有關(guān)，因此β2-MG可反映機(jī)體腫瘤負(fù)荷[17]。IL-17主要可誘導(dǎo)IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子的分泌，可廣泛存在于各種實(shí)體瘤和正常組織中，通過(guò)促進(jìn)腫瘤內(nèi)部血管生成和抗腫瘤細(xì)胞凋亡促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[18]。IL-35在人體中僅由活化的Treg細(xì)胞分泌，是一種通過(guò)抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的增殖和Th17 細(xì)胞極化，進(jìn)而抑制IL-17的分泌和免疫反應(yīng)的新型免疫抑制因子[19]。MM患者Treg/Th17平衡被破壞，Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL-17及其他相關(guān)因子，導(dǎo)致瘤細(xì)胞惡性增殖，IL-35水平降低，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致機(jī)體免疫反應(yīng)被破壞[20]。杜朝陽(yáng)[21]等人的研究發(fā)現(xiàn)IL-17水平異常增高與MM的發(fā)病密切相關(guān)，可作為評(píng)估ISS分期和判斷治療效果的重要依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)不同血液分離結(jié)果的MM患者免疫平衡狀態(tài)存在顯著差異，異常組IL-17水平顯著高于對(duì)照組，IL-35水平顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明異常組患者可能存在更嚴(yán)重的免疫失衡，提示異常組患者可能存在更高的瘤細(xì)胞增殖率和腫瘤負(fù)荷。療效評(píng)價(jià)顯示，隨著臨床治療改善，血液分離結(jié)果轉(zhuǎn)為正常的患者血清IL-17與IL-35的免疫平衡狀態(tài)逐漸轉(zhuǎn)為正常，且相關(guān)分析顯示血清β2-MG水平與IL-17水平呈正相關(guān)，與IL-35水平呈負(fù)相關(guān)，提示IL-17及IL-35可作為MM患者療效評(píng)價(jià)、病情變化的重要參考指標(biāo)。

綜上所述，MM患者血液標(biāo)本離心后可能存在血液異常分離現(xiàn)象，不同血液分離結(jié)果的MM患者血清IL-17、IL-35、β2-MG水平存在差異；血液分離結(jié)果的轉(zhuǎn)變和IL-17及IL-35免疫平衡狀態(tài)的改變可提示治療效果，為不同血液分離結(jié)果對(duì)患者病情狀態(tài)評(píng)估提供了部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。