劉牧謠，張文芊，馬海妮，許勇宜，王思宏，于世超*

（1.東北林業(yè)大學生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.延邊大學分析測試中心，吉林 延吉 133002）

糖尿病是一種葡萄糖積累于血液循環(huán)中的慢性疾病，并伴有多種并發(fā)癥，其中包括心腦血管病、腎病、眼病及足壞死[1]。其發(fā)病原因與長期胰島素的利用或分泌缺陷有關(guān)[2]。胰島素能夠增加肌肉和脂肪對葡萄糖的吸收，并促進肝糖原的產(chǎn)生[3]。靶器官對胰島素的敏感性降低，機體無法完全利用血液中的葡萄糖是胰島素抵抗的主要標志，并且胰島素抵抗是2 型糖尿病發(fā)病原因之一[2，4]。研究表明，PI3K/Akt 信號途徑與胰島素抵抗密切相關(guān)[5]。目前西藥的降糖效果最為明顯但伴有一定副作用，而中藥的活性成分，例如多糖類和多酚類在治療糖尿病的同時對身體的毒害作用較小，因此在糖尿病的臨床治療中有待深入探索[6-7]。

鈍葉瓦松Orostachys malacophyllus是景天科瓦松屬植物，兩年生肉質(zhì)草本，主要產(chǎn)于河北、內(nèi)蒙古、遼寧和黑龍江等省區(qū)。鈍葉瓦松可全草入藥，具有清熱解毒、消腫、止血、止痢和斂瘡的功效，其主要生物活性成分為草酸、黃酮類、甾醇類、酚酸類、三萜類以及強心苷等[8-9]。目前關(guān)于鈍葉瓦松藥用價值的研究尚不充分，對胰島素代謝途徑的影響仍不清楚。

黑腹果蠅Drosophila melanogaster作為典型的模式生物，具有繁殖快、易培養(yǎng)和信號途徑保守等優(yōu)點，適合中藥的篩選。此外，果蠅可作為模型研究胰島素信號的調(diào)控機制[10]。研究表明，胰島素介導(dǎo)果蠅中大部分營養(yǎng)依賴性的信號傳導(dǎo)[11]。胰島素等生長因子激活胰島素受體并與之結(jié)合，誘導(dǎo)PI3K/Akt 活化[7]。PI3K/Akt 是控制細胞生長與代謝的重要途徑[12-13]。PI3K 接收來自酪氨酸激酶或G 蛋白偶聯(lián)受體的信號后，促進磷脂酰肌醇4，5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3），PIP3 與磷脂酰肌醇依賴激酶Ⅰ（phosohoinostide-de‐pendent kinase 1）結(jié)合，誘導(dǎo)Akt 至細胞膜，調(diào)節(jié)糖原合成、糖異生和葡萄糖攝取[12-13]。Akt 又稱蛋白激酶B（protein kinase B），是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，而S6 激酶（S6 kinase，S6K）是Akt 的主要底物之一，因此Akt 及S6k 的突變能夠?qū)е乱葝u素代謝紊亂，從而影響果蠅的生長及脂肪代謝。

本研究探究鈍葉瓦松水提取物對果蠅胰島素代謝途徑的影響，以蛹殼體積、成蟲大小、翅膀面積和脂肪代謝為指標，可為治療胰島素代謝紊亂藥物的開發(fā)提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料、試劑與儀器設(shè)備

1.1 試材與試劑

試材鈍葉瓦松采于延吉市煙集鄉(xiāng)，并經(jīng)過延邊大學藥學院呂惠子教授鑒定。Hoechst、氟硼二吡咯（Boron-dipyrromethe，BODIPY）和鬼筆環(huán)肽（Phal‐loidin）購自Life Technologies 公司。其他試劑均為分析純。

1.2 試驗動物

野生型果蠅w1118購自美國布魯明頓果蠅中心，Akt和S6kl-1/Tb 突變體果蠅由許田教授饋贈。果蠅培養(yǎng)條件為25℃、相對濕度60%～70%。

1.3 儀器設(shè)備

果蠅培養(yǎng)箱（PGY-570A-3HM，寧波萊?？萍加邢薰荆浑娮臃治鎏炱剑ˋLC-210.4，北京賽多利斯公司）；體式顯微鏡（SZ51，日本Olympus 公司）；正置熒光顯微鏡（AxioScope A1，德國Zeiss 公司）；渦旋振蕩器（Vortex-Genie 2，美國Scientific Industries公司）。

2 研究方法

2.1 鈍葉瓦松水提取物的制備

準確稱20 g 鈍葉瓦松，用200 mL 去離子水浸泡12 h，大火加熱煮沸后微火熬制3 h，經(jīng)紗布過濾后收集濾液。將濾渣再次加入200 mL 去離子水，以同樣方式熬制3 h，合并兩次濾液并加熱濃縮至100 mL，得到質(zhì)量濃度為0.2 g·mL-（120%）的鈍葉瓦松水提取液，室溫冷卻后置于-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 果蠅培養(yǎng)基的制備

玉米粉-酵母培養(yǎng)基（普通培養(yǎng)基）：培養(yǎng)基的配制參照李文佳等所用方法[14]。鈍葉瓦松水提取物培養(yǎng)基：將普通培養(yǎng)基中的去離子水換成等體積的鈍葉瓦松水提取液，鈍葉瓦松的質(zhì)量濃度為0.1 g·mL-1（10%）。

2.3 鈍葉瓦松水提取物對果蠅的影響

2.3.1 對野生型果蠅生長發(fā)育有無影響

為分析鈍葉瓦松水提取物是否影響野生型果蠅的生長發(fā)育，分別收集普通培養(yǎng)基和鈍葉瓦松水提取物培養(yǎng)基喂食的w1118果蠅蛹和成蟲，并分析蛹殼體積和成蟲面積。

2.3.2 對胰島素途徑突變體果蠅蛹殼體積的影響為分析鈍葉瓦松水提取物對胰島素途徑突變體果蠅生長發(fā)育的影響，收集普通培養(yǎng)基喂食的野生型、胰島素途徑突變體果蠅及鈍葉瓦松水提取物培養(yǎng)基喂食的突變體果蠅的蛹殼，顯微鏡觀察并計算體積。

2.3.3 對胰島素途徑突變體果蠅成蟲面積的影響

為研究鈍葉瓦松水提取物對胰島素途徑突變體果蠅個體大小的影響，收集各組羽化時間相同的雄果蠅，對體側(cè)面積進行比較。

2.3.4 對胰島素途徑突變體果蠅翅膀面積的影響

為量化胰島素途徑對生長的影響，測量各組果蠅的翅膀面積。

2.3.5 對胰島素途徑突變體果蠅脂肪代謝的影響

為進一步分析鈍葉瓦松水提取物對細胞大小和脂肪代謝水平的影響，測定各組果蠅的脂肪油滴面積、脂肪體細胞面積以及細胞核面積。

2.4 指標的測定

2.4.1 蛹殼體積的測定

收集各組蛹殼置于載玻片上，用毛刷蘸取甘油將蛹殼固定并擺放整齊。每組分別收集30 個蛹殼用于顯微鏡照相。使用ImageJ 軟件測量蛹殼長和寬，最后帶入公式4/3p（L/2）（1/2）2（L：長度，l：寬度）計算體積[15]。

2.4.2 成蟲大小和翅膀面積的測定

收集羽化時間相同的雄果蠅，二氧化碳麻醉后側(cè)放于載玻片上。各組隨機收集20 只雄性果蠅翅膀，用石蠟油固定后于載玻片上擺放整齊。在顯微鏡下拍攝，使用ImageJ 軟件測量成蟲及翅膀面積。

2.4.3 脂肪體細胞、脂肪油滴和細胞核面積的測定

各組取15～20 只三齡幼蟲在涼PBS 中提取脂肪體。4% 多聚甲醛固定30 min 后，用含有0.1%Tween20 的PBS（PBST）清洗脂肪體3 次，每次5 min。然后在Phalloidin（標記細胞膜）和BODIPY（標記脂滴）染料中各染色30 min，用PBST 清洗3次后，在Hoechst（標記細胞核）中染色10 min。最后用70% 甘油封片并在熒光顯微鏡下觀察拍照。利用ImageJ 軟件測量脂肪油滴、脂肪體細胞和細胞核的面積。

3 結(jié)果與分析

3.1 水提物對野生型果蠅生長發(fā)育的影響

由圖1 可見，與普通培養(yǎng)基相比，鈍葉瓦松水提取物培養(yǎng)基喂食果蠅的蛹殼體積和成蟲大小無顯著差異（圖1A～F），由此可排除鈍葉瓦松水提取物對野生型果蠅生長發(fā)育的影響。

圖1 水提取物對野生型果蠅蛹殼體積和成蟲面積的影響

3.2 水提物對胰島素途徑突變體蛹殼體積的影響

由圖2 可見，與野生型果蠅w1118相比，Akt 突變體蛹殼體積減小了4.2%，而喂食10% 鈍葉瓦松水提取物的Akt 突變體蛹殼體積與w1118幾乎沒有差別（圖2A～C，G）。由于S6k突變體果蠅攜帶平衡子Tb，為保證試驗嚴謹性，采用帶有該平衡子的w1118/Tb 果蠅作為對照。與w1118/Tb 果蠅相比，S6k/Tb 突變體蛹殼體積減小了14.0%，喂食鈍葉瓦松后，S6k/Tb 突變體蛹殼體積的減小得到明顯改善（圖2D～F，G）。以上結(jié)果表明，鈍葉瓦松水提取物對胰島素代謝途徑紊亂引起的蛹殼體積減小有顯著緩解作用。

圖2 水提取物對胰島素途徑突變體果蠅蛹殼體積的影響

3.3 水提物對胰島素途徑突變體成蟲面積的影響

由圖3 可見，與w1118相比，僅喂食普通培養(yǎng)基的Akt突變體減小了13.2%，喂食10% 鈍葉瓦松水提取物的Akt個體大小得到恢復(fù)（圖3A～C，G）。與w1118/Tb 相比，喂食普通培養(yǎng)基的S6k/Tb 突變體果蠅個體減小了10.7%，喂食鈍葉瓦松的S6k/Tb 與w1118/Tb 果蠅大小無明顯差異（圖3D～F，G）。由此可見，鈍葉瓦松水提取物對Akt及S6k/Tb 突變體果蠅成蟲個體減小均有明顯的緩解作用。

圖3 水提取物對胰島素途徑突變體果蠅成蟲面積的影響

3.4 對胰島素途徑突變體果蠅翅膀面積的影響

組織器官大小能夠反映果蠅的生長狀態(tài)。結(jié)果表明，與w1118及w1118/Tb 果蠅相比，Akt與S6k/Tb突變體果蠅翅膀面積分別減小了10.9%和9.7%，而喂食鈍葉瓦松水提取物后，翅膀面積的減少得到緩解（圖4A-G）。由此可見，鈍葉瓦松水提取物能夠緩解胰島素途徑突變體果蠅翅膀面積的減小。

圖4 水提取物對胰島素途徑突變體果蠅翅膀面積的影響

3.5 對胰島素途徑突變體果蠅脂肪代謝的影響

上述試驗表明，鈍葉瓦松水提取物能夠改善突變體果蠅生長發(fā)育的缺陷。為進一步分析鈍葉瓦松水提取物對細胞大小和脂肪代謝水平的影響，測定了各組果蠅的脂肪油滴面積、脂肪體細胞面積以及細胞核面積。如圖5 所示，與w1118相比，Akt突變體的脂肪油滴面積、脂肪體細胞面積以及細胞核大小均有所降低，分別減少了35.0%、21.2% 和9.4%。類似地，與w1118/Tb 相比，S6k/Tb 的脂肪油滴面積、脂肪體細胞面積以及細胞核大小分別減少了53.1%、11.7% 和8.4%（圖5）。而喂食鈍葉瓦松水提取物后，各項指標都得到了顯著恢復(fù)（圖5 和圖6）。以上結(jié)果表明，鈍葉瓦松水提取物可緩解胰島素途徑突變引起的脂肪代謝水平降低。

圖5 水提取物對Akt突變體果蠅脂肪代謝的影響

圖6 水提取物對S6k突變體果蠅脂肪代謝的影響

4 討 論

糖尿病被列為世界三大疑難病之一，預(yù)計到2030 年全球?qū)⒂?.66 億人患病[16]。大量研究表明，中草藥的多糖、黃酮、生物堿和皂苷等活性成分可以降低血糖濃度[17]。由此可見，在治療糖尿病藥物高需求的背景下，篩選中藥的有效活性成分并開發(fā)藥物已成為新的趨勢。瓦松屬植物具抗病毒、抗菌、抗癌、強心以及抗炎等作用，其中鈍葉瓦松的藥用功能開發(fā)較少，尚不清楚其對胰島素代謝紊亂的影響[18]。

胰島素代謝途徑PI3K/Akt控制細胞的正常生長，S6K 位于該途徑下游，能夠促進蛋白質(zhì)合成[19-20]。本研究以黑腹果蠅為模型，探究鈍葉瓦松水提取物對胰島素代謝紊亂的影響。與喂食普通培養(yǎng)基的Akt 和S6k/Tb 突變體果蠅相比，喂食鈍葉瓦松水提取物的突變體果蠅蛹殼體積、成蟲大小、翅膀面積和脂肪代謝均得到了明顯改善，表明鈍葉瓦松水提取物能夠緩解胰島素途徑突變體果蠅的代謝紊亂。該結(jié)果為治療糖尿病藥物的開發(fā)提供了新思路。由于本研究采用水提取法，水提取物包含多種生物活性成分，因此，鈍葉瓦松緩解胰島素代謝紊亂的具體活性成分仍有待深入研究。