許美玲,邢寶彤,李建萍

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 210023)

糖尿病是引發(fā)心血管疾病的重要風(fēng)險(xiǎn)因素[1],糖尿病患者發(fā)生心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)要比正常人高2～3倍[2-3]。一方面,糖尿病會(huì)加快高血壓和冠狀動(dòng)脈疾病的進(jìn)程,增加心肌梗死和心力衰竭的發(fā)生率和死亡率[4];另一方面,糖尿病本身對(duì)心臟也是有害的,在沒有高血壓或冠狀動(dòng)脈疾病的情況下,也會(huì)獨(dú)立地引發(fā)心臟疾病[5]。糖尿病是引發(fā)心衰的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素,而這種直接由糖尿病引起的心臟結(jié)構(gòu)和功能障礙就是糖尿病心肌病[6-7]。糖尿病心肌病當(dāng)前缺乏有效的特異性防治藥物[8]。由于糖尿病是推動(dòng)糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)因素和病理基礎(chǔ),采用降糖藥物改善糖尿病癥狀是糖尿病心肌病的基本防治方法[5]。但是,2型糖尿病患者在成功控制血糖后,微血管和大血管病變的殘留風(fēng)險(xiǎn)依舊非常高[9]。尤其在年老、有心血管疾病史或有其他心血管風(fēng)險(xiǎn)因素的2型糖尿病患者中,如果強(qiáng)化血糖控制,反而會(huì)加劇心衰的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[10]。因此,尋找針對(duì)糖尿病心肌病的特異性治療靶點(diǎn)和藥物仍有很大的前景和挑戰(zhàn)[5]。

在我國(guó)醫(yī)藥文化發(fā)展中,藥食兩用的中藥材逐漸成為人們保健養(yǎng)生的關(guān)注熱點(diǎn),促進(jìn)了藥食兩用中藥材的發(fā)掘與研究。丹參和紅花均為藥食兩用的中藥材,丹參為唇形科植物SalviamiltrorrhizaBge.的干燥根及根莖,具有活血祛瘀,調(diào)經(jīng)止痛,清心除煩的功效;紅花為菊科植物CarthamustinctoriusL.的干燥管狀花,具有活血通經(jīng),祛瘀止痛,疏肝通絡(luò)的功效。2020年發(fā)表的綜述在總結(jié)丹參-紅花配伍通過多成分、多靶點(diǎn)、多途徑改善肥胖、高血壓、糖尿病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的基礎(chǔ)上,提出丹參-紅花配伍對(duì)糖尿病及心血管并發(fā)癥的防治潛力,但是丹參-紅花配伍對(duì)糖尿病心肌病或者糖尿病并發(fā)心血管疾病的防治作用及機(jī)制仍需臨床試驗(yàn)的驗(yàn)證及基礎(chǔ)研究的探索[11]。課題組最近研究發(fā)現(xiàn),丹參-紅花配伍可以顯著改善糖尿病心肌病小鼠的心臟功能障礙[12]。但是,該研究中丹參-紅花配伍水提物的給藥方式為腹腔注射,在臨床應(yīng)用中具有局限性,本文設(shè)計(jì)了2種口服給藥的方式,評(píng)價(jià)丹參-紅花配伍口服給藥對(duì)糖尿病心肌病小鼠糖尿病癥狀、葡萄糖代謝能力及心臟功能的作用。同時(shí)以未折疊蛋白應(yīng)答信號(hào)通路異常這一糖尿病心肌病的關(guān)鍵病理機(jī)制為切入點(diǎn)[13],探討丹參-紅花配伍口服給藥對(duì)糖尿病心肌病小鼠的調(diào)控機(jī)制,以期為糖尿病心肌病的臨床防治提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物

丹紅注射液購(gòu)自步長(zhǎng)制藥股份有限公司(DH,批號(hào):22051003,丹參-紅花配伍水提物的生藥量為29 mg·mL-1,丹參和紅花以3∶1的比例配伍,采用水提醇沉法制得);恩格列凈(Empagliflozin,EMPA)購(gòu)自德國(guó)Boehringer Ingelheim公司(批號(hào):004345)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性C57BL/6J小鼠(20～25 g)購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2021-0006。小鼠飼養(yǎng)在南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,環(huán)境溫度為22 ℃,12 h黑暗和12 h光照循環(huán),小鼠維持充足的飼料和飲用水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)由南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn),批準(zhǔn)號(hào):201805A023,按照NIH實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南進(jìn)行。

1.3 試劑

高脂飼料(High fat diet,HFD,Research Diets D12492,60%的能量來自于脂肪,5.24 kcal·g-1,1 cal=4.19 J)購(gòu)自美國(guó)Research Diets公司(批號(hào):1902702HS2.5);普通標(biāo)準(zhǔn)飼料(Normal standard diet,ND,3.30 kcal·g-1)購(gòu)自江蘇協(xié)同生物工程有限公司;鏈脲霉素(Streptozotocin,STZ)(批號(hào):S0130)、檸檬酸鈉(批號(hào):S1804)、檸檬酸(批號(hào):C0759)和羥乙基纖維素(批號(hào):434973)均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司;葡萄糖購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司(批號(hào):G6172);小鼠胰島素(INS)ELISA試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所(批號(hào):H203-1-2);葡萄糖測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海榮盛生物科技有限公司(批號(hào):20180402137);胰島素購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(批號(hào):K1815025);純化的小鼠anti-GRP78抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司(批號(hào):610979,Western blot使用時(shí)抗體稀釋1 000倍);GRP94的兔單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司(批號(hào):20292,Western blot使用時(shí)抗體稀釋1 000倍)。

1.4 儀器

Vevo 3100超聲成像系統(tǒng)(VisualSonics Inc,加拿大);ENSPIRE多功能酶標(biāo)儀(PerkinElmer,美國(guó));Mini-PROTEAN電泳儀及其配件(BioRad,美國(guó));ChemiDoc成像系統(tǒng)(BioRad,美國(guó));ABI7500實(shí)時(shí)定量PCR(Applied Biosystems,美國(guó))。

1.5 方法

1.5.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照最新的天然產(chǎn)物藥理學(xué)研究最佳實(shí)踐指南進(jìn)行[14-15]。實(shí)驗(yàn)共使用46只C57BL/6J雄鼠,其中21只小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(CTL,n=10)和丹參-紅花配伍長(zhǎng)期預(yù)防給藥組(DCM-DHOL,n=11),剩余25只小鼠造模后再分組。10只空白對(duì)照組小鼠用標(biāo)準(zhǔn)普通飼料喂養(yǎng)10周,并在第5周的第1天腹腔注射檸檬酸鈉緩沖液(0.1 mol·L-1,pH=4.5),其余36只小鼠用高脂飲食喂養(yǎng)10周,并在第5周的第1天腹腔注射STZ檸檬酸鈉緩沖液(120 mg·kg-1)。在第8周的最后1天測(cè)定小鼠禁食2 h后的血糖水平,將未分組的25只小鼠中血糖值≥16.67 mmol·L-1的存活小鼠進(jìn)一步分為糖尿病心肌病組(DCM,n=7)、丹參-紅花配伍短期治療組(DCM-DHO,n=7)以及恩格列凈陽(yáng)性藥組(DCM-EMPA,n=7),分組時(shí)確保這3組的平均血糖值相同(圖1)。給藥方法為:丹參-紅花配伍短期治療組在第9～10周每天灌胃丹參-紅花水提液(4.16 mL·kg-1);丹參-紅花配伍長(zhǎng)期預(yù)防給藥組,在第1～10周每天灌胃丹參-紅花水提液(4.16 mL·kg-1);恩格列凈陽(yáng)性藥給藥組,在第9～10周每天灌胃恩格列凈-0.5%羥乙基纖維素溶液(10 mg·kg-1)。

注:ND.普通標(biāo)準(zhǔn)飼料;HFD.高脂飼料;STZ.STZ檸檬酸鈉緩沖液;DH.丹參-紅花水提液;EMPA.恩格列凈-0.5%羥乙基纖維素溶液

1.5.2 糖尿病指標(biāo)監(jiān)測(cè) 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)期間,在每周的最后1天監(jiān)測(cè)小鼠的體質(zhì)量、飲水量、能量攝入以及血糖水平(禁食2 h),連續(xù)監(jiān)測(cè)10周。最后1次給藥后測(cè)定小鼠血清胰島素水平,同時(shí)每組抽取3只小鼠進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(Oral glucose tolerance test,OGTT)和胰島素耐受試驗(yàn)(Insulin tolerance test,ITT)。實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[16],簡(jiǎn)述如下:小鼠禁食14 h后進(jìn)行OGTT試驗(yàn),根據(jù)小鼠體質(zhì)量灌胃20%葡萄糖溶液(1 g·kg-1),在不同的時(shí)間點(diǎn)(0、15、30、60、90 min)進(jìn)行尾尖取血,采用血糖儀檢測(cè)血糖水平。小鼠休息1周后進(jìn)行ITT試驗(yàn),禁食4 h,根據(jù)小鼠體質(zhì)量腹腔注射胰島素溶液(0.75 U·kg-1),隨后按照與OGTT試驗(yàn)一樣的方法進(jìn)行血糖檢測(cè)。

1.5.3 心臟功能檢測(cè) 在小鼠最后1次給藥后,采用Vevo 3100成像系統(tǒng)對(duì)小鼠進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查,評(píng)價(jià)其心臟功能。在小鼠清醒狀態(tài)下,獲得M模式下心臟的胸骨旁短軸視圖,并測(cè)量左心室縮短分?jǐn)?shù)(Left ventricular fractional shortening,FS),評(píng)估心臟收縮功能。麻醉狀態(tài)下,從心尖四室視圖獲取小鼠二尖瓣血流脈沖多普勒?qǐng)D,計(jì)算早期充盈速度與心房充盈速度之比(The ratio of peak early filling velocity to atrial filling velocity,MV E/A),評(píng)價(jià)心臟舒張功能。超聲心動(dòng)圖檢查由南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院的超聲心動(dòng)圖檢查專家進(jìn)行,其對(duì)小鼠的造模方法和給藥情況不知情。

1.5.4 未折疊蛋白應(yīng)答信號(hào)通路上關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子水平檢測(cè) 超聲心動(dòng)圖檢查后,處死所有小鼠,收集左心室并儲(chǔ)存于-80 ℃?zhèn)溆梅肿由飳W(xué)分析。采用qPCR對(duì)小鼠左心室未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded protein response,UPR)通路相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的mRNA水平進(jìn)行檢測(cè),包括肌醇依賴酶(Inositol requiring enzyme 1,IRE1)、剪切的X盒結(jié)合蛋白1(Spliced x-box binding protein 1,Xbp1s)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Glucose regulating protein 78,GRP78)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94(Glucose regulating protein 94,GRP94)、胰激酶R-樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(Pancreatic kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)、激活轉(zhuǎn)錄因子4(Activating transcription factor 4,ATF4)和激活轉(zhuǎn)錄因子6α(Activating transcription factor 6α,ATF6α),這些轉(zhuǎn)錄因子和內(nèi)參基因的引物序列如表1所示[17]。采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠左心室中GRP78和GRP94的蛋白表達(dá)量,其抗體濃度分別為0.25 μg·mL-1和0.20 μg·mL-1。

1.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 丹參-紅花配伍改善糖尿病心肌病小鼠的糖尿病癥狀

飲水量監(jiān)測(cè)結(jié)果表明,與空白組小鼠相比,糖尿病心肌病小鼠的飲水量顯著增加(P<0.000 1),在第10周增加了87.92%;丹參-紅花配伍短期治療給藥和長(zhǎng)期預(yù)防給藥后顯著降低了糖尿病心肌病小鼠的飲水量,在第10周分別降低了10.46%(P<0.05)和21.56%(P<0.000 1)。此外,丹參-紅花配伍對(duì)糖尿病心肌病小鼠的體質(zhì)量和能量攝入均無顯著影響。陽(yáng)性藥恩格列凈給藥后會(huì)導(dǎo)致糖尿病心肌病小鼠體質(zhì)量顯著降低(P<0.05),飲水量顯著增加(P<0.000 1),對(duì)能量攝入有增加的趨勢(shì)。詳見圖2。

注:與空白組比較,*P<0.05,***P<0.001,****P<0.000 1;與糖尿病心肌病組比較,

血糖水平、胰島素水平、OGTT和ITT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,糖尿病心肌病小鼠出現(xiàn)了持續(xù)的高血糖及糖代謝異常狀態(tài)。與空白小鼠相比,糖尿病心肌病小鼠的血糖水平在第10周增加了178.56%(P<0.000 1),血清胰島素水平下降了72.55%(P<0.000 1);OGTT和ITT試驗(yàn)的曲線下面積(AUC)分別增加236.75%和88.79%(P<0.000 1)。丹參-紅花配伍長(zhǎng)期預(yù)防給藥小鼠維持較低的血糖水平,與糖尿病心肌病小鼠相比,血糖水平在第5周和第10周分別降低了26.08%(P<0.01)和28.82%(P<0.000 1);胰島素水平結(jié)果提示,丹參-紅花配伍長(zhǎng)期預(yù)防給藥后,糖尿病心肌病小鼠的胰島素水平上升了43.63%(P<0.05)。OGTT試驗(yàn)和ITT試驗(yàn)中,對(duì)0～120 min血糖水平AUC進(jìn)行統(tǒng)計(jì),發(fā)現(xiàn)相較于糖尿病心肌病小鼠,丹參-紅花配伍長(zhǎng)期預(yù)防給藥后,OGTT和ITT的AUC分別下降了16.56%(P<0.05)和6.82%。丹參-紅花配伍短期治療給藥對(duì)糖尿病心肌病小鼠的血糖、胰島素水平以及葡萄糖代謝均具有一定的改善趨勢(shì),但無顯著性影響。陽(yáng)性藥恩格列凈給藥后可以顯著降低糖尿病心肌病小鼠的血糖水平,在第10周其血糖水平下降了46.06%(P<0.000 1),并對(duì)糖尿病心肌病小鼠的糖代謝異常具有顯著的改善作用。詳見圖3。

2.2 丹參-紅花配伍改善糖尿病心肌病小鼠的心臟功能障礙

超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)果表明,糖尿病心肌病小鼠表現(xiàn)出明顯的收縮功能障礙,主要表現(xiàn)為FS顯著降低(P<0.000 1);丹參-紅花配伍長(zhǎng)期預(yù)防給藥后對(duì)糖尿病心肌病小鼠的心臟收縮功能障礙具有顯著的改善作用,FS顯著增加32.86%(P<0.01)。糖尿病心肌病小鼠同時(shí)表現(xiàn)出心臟舒張功能障礙,具體表現(xiàn)為MV E/A顯著降低(P<0.001),丹參-紅花短期配伍治療給藥和長(zhǎng)期預(yù)防給藥后,MV E/A分別顯著增加17.87%(P<0.05)和24.3%(P<0.01)。陽(yáng)性藥恩格列凈可以顯著改善糖尿病心肌病小鼠的心臟收縮功能障礙(P<0.01),對(duì)心臟舒張功能障礙具有改善趨勢(shì)。詳見圖4。

2.3 丹參-紅花配伍調(diào)控糖尿病心肌病小鼠心臟未折疊蛋白應(yīng)答信號(hào)通路

未折疊蛋白應(yīng)答信號(hào)通路的分子生物學(xué)研究結(jié)果顯示,糖尿病心肌病小鼠左心室的IRE1、Xbp1smRNA以及分子伴侶蛋白GRP78和GRP94的mRNA表達(dá)和蛋白水平顯著下調(diào)(P<0.05,P<0.01),PERK、ATF4和ATF6αmRNA無顯著影響。丹參-紅花配伍長(zhǎng)期預(yù)防給藥可以顯著上調(diào)IRE1、ATF4和Xbp1smRNA,分子伴侶蛋白GRP78和GRP94 mRNA表達(dá)水平以及GRP78蛋白表達(dá)水平(P<0.05)。陽(yáng)性藥恩格列凈給藥后對(duì)IRE1 mRNA表達(dá)具有上調(diào)作用(P<0.05)。詳見圖5。

3 討論

心肌病是由糖尿病、肥胖、冠心病、高血壓、飲酒、家族遺傳史等引起的多種心肌疾病的總稱[18-19],其中,糖尿病心肌病特指由糖尿病單獨(dú)引起的一類心肌病[7]。盡管糖尿病心肌病早在40年前就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn),但迄今為止,糖尿病心肌病的病理機(jī)制仍不明確,仍缺少明確有效的防治藥物[8]。課題組前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn),丹參-紅花配伍腹腔注射給藥可以顯著改善糖尿病心肌病小鼠的糖尿病癥狀及心臟功能障礙,在此基礎(chǔ)上,本文進(jìn)一步證實(shí)丹參-紅花配伍口服給藥對(duì)糖尿病心肌病小鼠的糖尿病癥狀,包括高飲水量、高血糖、低胰島素、葡萄糖代謝能力受損,以及心臟功能障礙,包括收縮功能障礙和舒張功能障礙,均具有顯著的改善作用。本文的研究結(jié)果為丹參-紅花配伍防治糖尿病心肌病提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),但潛在的藥理機(jī)制及在真實(shí)世界的有效性仍需進(jìn)一步探索。

本文采用的陽(yáng)性藥是恩格列凈。恩格列凈是鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)體2(Sodium glucose cotransporter 2,SGLT2)的抑制劑,可以抑制腎近端小管對(duì)葡萄糖的重吸收,從而增加葡萄糖的尿液排泄,發(fā)揮降血糖的作用[20]。此外,心血管結(jié)局試驗(yàn)證實(shí),恩格列凈可以降低糖尿病患者主要心血管事件和心力衰竭的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[21]。《中國(guó)2型糖尿病防治指南(2020年版)》已將恩格列凈等SGLT2抑制劑納入并發(fā)心力衰竭或動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病或心血管風(fēng)險(xiǎn)高危的2型糖尿病患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方案中[22]。這些均提示恩格列凈對(duì)糖尿病心肌病具有改善的潛力,本文揭示了恩格列凈對(duì)糖尿病心肌病小鼠心臟功能障礙的保護(hù)作用,這與前期報(bào)道的實(shí)驗(yàn)結(jié)論相吻合[23]。此外,恩格列凈對(duì)糖尿病心肌病小鼠的高血糖癥以及葡萄糖代謝能力受損均具有顯著的改善作用,但恩格列凈在增加糖尿病心肌病小鼠能量攝取以及飲水量的同時(shí),會(huì)導(dǎo)致其體質(zhì)量顯著下降,該作用值得關(guān)注和探究。

未折疊蛋白應(yīng)答信號(hào)通路是維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的一種適應(yīng)性保護(hù)機(jī)制[24]。生理狀態(tài)下,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜上有PERK、ATF6和IRE1這3種跨膜受體,隨時(shí)監(jiān)測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白折疊情況,如果錯(cuò)誤折疊或者未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中不斷蓄積就會(huì)誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,原本與分子伴侶蛋白結(jié)合處于靜息狀態(tài)的PERK、ATF6和IRE1就會(huì)先后活化,分別觸發(fā)不同的信號(hào)通路來減少蛋白合成并增加蛋白折疊能力,最終緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,恢復(fù)細(xì)胞功能。分子伴侶蛋白在蛋白折疊反應(yīng)中具有關(guān)鍵性作用,目前已知的分子伴侶蛋白有GRP78和GRP94等,其主要功能是與新合成的多肽鏈形成復(fù)合物并協(xié)助多肽鏈正確折疊成具有生物構(gòu)象的功能蛋白質(zhì)(圖6)[25]。本文研究發(fā)現(xiàn),丹參-紅花配伍口服給藥對(duì)未折疊蛋白應(yīng)答信號(hào)通路上的IRE1途徑及伴侶蛋白具有顯著的調(diào)控作用。除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激外,糖尿病心肌病的病理進(jìn)程中還涉及其他病理機(jī)制,包括胰島素信號(hào)傳導(dǎo)異常、脂毒性、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、鈣平衡受損、免疫調(diào)節(jié)失衡、冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮功能障礙及外泌體調(diào)節(jié)失衡等[23],丹參-紅花配伍對(duì)這些信號(hào)通路是否具有調(diào)控作用還需深入研究。