楊淑惠,王雨萌,尹佳婷,李成曦,段金廒,郭建明

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210023;2.湖州市中心醫(yī)院藥學(xué)部,浙江 湖州 313002)

衰老是生物體發(fā)展的自然過(guò)程,也是近年來(lái)科學(xué)家熱衷于研究挖掘的焦點(diǎn)。由2015年聯(lián)合國(guó)關(guān)于世界人口老齡化的報(bào)道可知,預(yù)計(jì)到21世紀(jì)中葉,全球范圍內(nèi)60歲及以上的人口數(shù)將翻倍[1];2021年,第七次全國(guó)人口普查結(jié)果顯示[2],截至2020年,中國(guó)老齡人口比例為18.7%,超過(guò)2.6億,預(yù)計(jì)到2050年,中國(guó)老齡人口比例將達(dá)到27.9%,超過(guò)3.8億。人口老齡化將對(duì)我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展、社會(huì)建設(shè)、社會(huì)文化均產(chǎn)生深刻影響。

中醫(yī)關(guān)于抗衰老理論主要集中于“腎元?dú)馓撝滤フf(shuō)”“五臟虛損致衰說(shuō)”以及氣虛、血虛、血瘀致衰說(shuō)等[3]。中醫(yī)理論認(rèn)為,引起衰老的原因中,腎虛為首,其次脾虛會(huì)進(jìn)一步影響衰老進(jìn)程,再次是氣血兩虛,因此在中醫(yī)范疇內(nèi),補(bǔ)腎、健脾、益氣是延緩衰老的基本途徑。

“藥食同源”是我國(guó)勞動(dòng)人民在食物和藥物發(fā)現(xiàn)中總結(jié)的智慧結(jié)晶,體現(xiàn)了食物的藥用功能。黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根,味甘,性微溫,歸肺、脾經(jīng)?，F(xiàn)代研究證實(shí)[4],黃芪具有延緩衰老的作用,對(duì)衰老進(jìn)程中出現(xiàn)的代謝靈活性下降、免疫功能失調(diào)、神經(jīng)系統(tǒng)衰退等方面都具有一定的改善作用。

在衰老研究領(lǐng)域,秀麗隱桿線蟲是杰出模式生物之一。線蟲的生命周期短、生理結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,在基因組水平上與人類具有60%～80%的相似性[5],已成為國(guó)際衰老研究的常用模型。黑腹果蠅作為遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究的重要模式生物,已有100年的歷史。在果蠅中可以觀察到許多與衰老相關(guān)的功能喪失標(biāo)志物,其中包括新陳代謝如蛋白質(zhì)和脂肪合成減少,生殖能力降低,神經(jīng)元功能改變導(dǎo)致的學(xué)習(xí)和記憶受損,免疫能力下降等[6-7]。

低等生物如線蟲和果蠅等在某些衰老相關(guān)基因的研究中具有明顯的優(yōu)勢(shì),但哺乳動(dòng)物尤其是嚙齒類動(dòng)物(小鼠或大鼠)模式生物對(duì)于了解人類衰老是必不可少的?；诖?本研究探討黃芪對(duì)不同自然衰老模型的改善作用,初步探討黃芪抗腸道衰老的作用及機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)菌

野生型N2秀麗隱桿線蟲以及大腸埃希氏菌(Escherichia. coli OP50)由南京中醫(yī)藥大學(xué)阮秦麗老師惠贈(zèng),飼養(yǎng)于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中,溫度(20±1)℃。

野生型W1118黑腹果蠅由南京中醫(yī)藥大學(xué)錢進(jìn)軍老師惠贈(zèng),飼養(yǎng)于恒溫恒濕人工氣候培養(yǎng)箱中,溫度(25±1)℃,濕度65%～75%,光照為自然節(jié)律白天-黑夜12 h交替循環(huán)。

雄性SPF級(jí)的C57BL/6J小鼠,6～8周齡,8只,體質(zhì)量(20±2)g,購(gòu)自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(蘇)2018-0008。小鼠飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào):202211A007)。

雄性SPF級(jí)的C57BL/6J小鼠,28周齡,32只,體質(zhì)量(30±2)g,購(gòu)自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(蘇)2018-0008。小鼠飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào):202112A025)。

1.2 藥品、試劑與儀器

黃芪飲片購(gòu)自江蘇省中醫(yī)院,批號(hào):20220102-01。

羅氏血糖試紙(批號(hào):26060941)購(gòu)自羅氏血糖健康醫(yī)護(hù)公司;Carmine染料(批號(hào):C11707035)、RNA follow All保存液(批號(hào):N20211108)購(gòu)自蘇州新賽美生物科技有限公司;Carnoy保存液(批號(hào):20210803)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;Edu(批號(hào):B833761341604)購(gòu)自美國(guó)APExBIO公司;Tissue Total RNA Isolation Kit(批號(hào):ET121-01)、HiScriptⅡQ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)試劑盒(批號(hào):017E2282IA)、ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒(批號(hào):027E2262IA)購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

體視顯微鏡(德國(guó)Leica公司,型號(hào):EZ4);正置體視熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司,型號(hào):M205 FCA);生化培養(yǎng)箱(天津泰斯特儀器有限公司,型號(hào)SPX-150BX);超凈工作臺(tái)(美國(guó)Thermo Fisher公司,型號(hào):MSV Advantage 1.2);果蠅二氧化碳麻醉系統(tǒng)(武漢一泓科技有限公司,型號(hào):YHDACO2);智能人工氣候箱(寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器有限公司,型號(hào):PRX-150B)。

2 方法

2.1 藥物配制

黃芪水提物:根據(jù)課題組前期建立的制備方法[8],準(zhǔn)確稱取黃芪飲片加水(飲片∶水=1∶8)煎煮3次,每次2 h;合并水提液后進(jìn)行旋蒸濃縮,冷卻后緩慢加入95%乙醇,使混合物乙醇濃度為80%,靜置過(guò)夜后抽濾,得沉淀,揮去殘留乙醇,冷凍干燥。黃芪醇提物:取水提后剩余藥渣加60%乙醇(藥渣∶乙醇=1∶12)煎煮3次,每次2 h,合并醇提液并進(jìn)行旋蒸濃縮,冷凍干燥。黃芪總提物為黃芪醇提物和黃芪水提物的混合物,按照提取得率,混合比例約為黃芪醇提物∶黃芪水提物=5∶8。

2.2 分組及給藥

2.2.1 線蟲實(shí)驗(yàn)分組及給藥 待線蟲裂解得蟲卵培養(yǎng)48 h后,在顯微鏡下挑取生長(zhǎng)情況近似的L4期線蟲至新的培養(yǎng)基中,隨機(jī)分為4組,空白對(duì)照組(Aged),黃芪總提物低(0.5 mg·mL-1)、中(2.5 mg·mL-1)、高(5.0 mg·mL-1)劑量組,自Day0開始給藥,直至所有線蟲死亡。

2.2.2 果蠅實(shí)驗(yàn)分組及給藥 實(shí)驗(yàn)選用羽化后72 h內(nèi)的果蠅,各性別均隨機(jī)分為4組,即空白對(duì)照組(Aged),黃芪總提物低(0.625 mg·mL-1)、中(1.25 mg·mL-1)、高(2.5 mg·mL-1)劑量組,每組平行3個(gè)試管,每管30只,每組共計(jì)90只。

2.2.3 小鼠實(shí)驗(yàn)分組及給藥 小鼠購(gòu)入后常規(guī)飼養(yǎng),飼養(yǎng)過(guò)程中,28周齡雄性小鼠因打架死亡2只,剩余30只飼養(yǎng)至13月齡,隨機(jī)分為4組,分別為自然衰老組(Aged)7只、給藥組(AME)8只、臟籠飼養(yǎng)衰老組(Co-house-Aged,CH-Aged)7只以及臟籠飼養(yǎng)給藥組(Co-house-AME,CH-AME)8只。后期購(gòu)入8周齡左右野生型小鼠作為年輕對(duì)照組(Young)。

年輕對(duì)照組小鼠每天給予常規(guī)飲食飲水。各給藥組小鼠每天灌胃給予黃芪總提物,劑量為2 g·kg-1,10 mL·kg-1,每日1次,連續(xù)給藥5個(gè)月;各衰老組小鼠每天給予等量純凈水灌胃。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 線蟲壽命監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn) 以線蟲同期化48 h后計(jì)為起始點(diǎn)(Day0),觀察線蟲存活情況,直至線蟲生命終止。以挑蟲器觸碰線蟲身體30 s無(wú)反應(yīng)作為死亡標(biāo)準(zhǔn)。平均壽命為所有線蟲壽命的平均數(shù);最高壽命為最后10%線蟲壽命的平均數(shù);中位壽命為還有50%線蟲存活時(shí)的壽命平均數(shù)。

2.3.2 線蟲運(yùn)動(dòng)能力及咽泵速率監(jiān)測(cè)[9]在壽命實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,對(duì)線蟲運(yùn)動(dòng)能力及咽泵頻率進(jìn)行評(píng)估。運(yùn)動(dòng)頻率監(jiān)測(cè):在顯微鏡下觀察,以線蟲頭部左右來(lái)回?cái)[動(dòng)1次計(jì)為線蟲運(yùn)動(dòng)1次,分別于Day5、10、14、17記錄線蟲30 s內(nèi)頭部擺動(dòng)次數(shù)。咽泵速率監(jiān)測(cè):在顯微鏡下觀察,記錄規(guī)定時(shí)間內(nèi)線蟲咽部抽動(dòng)次數(shù),分別于Day5、10、14、18記錄線蟲30 s內(nèi)咽部抽動(dòng)次數(shù)。

2.3.3 線蟲脂褐素?zé)晒鈾z測(cè)方法[9]在藥物干預(yù)Day15時(shí),每組隨機(jī)選擇18條線蟲轉(zhuǎn)移至2%瓊脂糖載玻片上,通過(guò)體視熒光顯微鏡觀察拍攝其體內(nèi)脂褐素自發(fā)熒光圖像,Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行進(jìn)一步處理分析。

2.3.4 果蠅壽命監(jiān)測(cè)及紫外損傷實(shí)驗(yàn) 以果蠅羽化當(dāng)天計(jì)為Day1,將果蠅以基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)至Day15,各劑量組換成相應(yīng)劑量的含藥培養(yǎng)基,培養(yǎng)至Day35后換為基礎(chǔ)培養(yǎng)基;對(duì)照組全程以基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng);每2～3 d更換新鮮培養(yǎng)基,每天觀察并記錄果蠅死亡情況,繪制生存曲線。壽命計(jì)算方式同“2.3.1”。

第一批果蠅培養(yǎng)至Day38后,每隔2 d將所有果蠅進(jìn)行15～30 min紫外照射,照射后及時(shí)更換培養(yǎng)基,直至所有果蠅全部死亡,每天觀察并記錄果蠅死亡情況,繪制生存曲線。

2.3.5 果蠅逆重力爬行實(shí)驗(yàn)[10]飼養(yǎng)至一定天數(shù)后,在透明果蠅培養(yǎng)試管(直徑2.5 cm,高9.5 cm)中標(biāo)記好規(guī)定高度(小于2 cm,2～4 cm或大于4 cm),輕拍培養(yǎng)試管3次,將所有果蠅置于管子底部,通過(guò)視頻記錄果蠅在規(guī)定時(shí)間內(nèi)垂直爬升的最大距離,各組設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組,記錄分析能爬行到最高距離的果蠅只數(shù)。

2.3.6 小鼠腸道轉(zhuǎn)運(yùn)以及葡萄糖吸收功能測(cè)定 胭脂紅腸轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn):灌胃給予胭脂紅染料溶液(6%胭脂紅染料溶解于0.5%的甲基纖維素),記錄從灌胃開始直至第一顆帶有紅色染料的糞便排出的時(shí)間,以120 min為上限,若小鼠持續(xù)不出現(xiàn)排便情況,則記為上限時(shí)間。

葡萄糖吸收實(shí)驗(yàn):將小鼠提前禁食不禁水16 h,灌胃給予2 g·kg-1的葡萄糖溶液后,分別于0、15、30、60、90、120 min對(duì)小鼠進(jìn)行血糖測(cè)定,采用尾尖取血,實(shí)驗(yàn)過(guò)程保持禁食不禁水狀態(tài)。

2.3.7 小鼠臟器取材以及組織病理學(xué)檢測(cè) 在實(shí)驗(yàn)終期,采用2.5%異氟烷麻醉小鼠,脫頸處死。剪取固定位置的結(jié)腸、空腸及回腸,置于卡諾氏固定液中,將組織用常規(guī)石蠟包埋制片,切片脫蠟后進(jìn)行阿利新藍(lán)-過(guò)碘酸雪夫氏(Alcian blue periodic acid-Schiff,AB-PAS)染色。在顯微鏡下拍照觀察腸道絨毛長(zhǎng)度、隱窩深度以及杯狀細(xì)胞數(shù)量,利用Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行進(jìn)一步處理分析。

Edu免疫熒光檢測(cè):于解剖取材的前48 h對(duì)小鼠進(jìn)行1次腹腔注射Edu溶液,注射劑量為5 mg·kg-1。實(shí)驗(yàn)終末期采集小鼠腸道組織在顯微鏡下觀察腸道組織中Edu陽(yáng)性細(xì)胞的遷移距離。利用Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行進(jìn)一步處理分析,量取每根絨毛上陽(yáng)性細(xì)胞區(qū)域的中點(diǎn)到小腸隱窩底部的距離,記為腸干細(xì)胞的增殖距離。

2.3.8 小鼠腸道組織中基因表達(dá)檢測(cè) 稱取小鼠空腸組織10 mg左右,研磨勻漿,按照試劑盒流程進(jìn)行mRNA提取。提取后進(jìn)行RNA濃度測(cè)定,按一定比例稀釋到所需濃度,根據(jù)cDNA試劑盒規(guī)定轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),使用QuantStudio 5型qPCR儀進(jìn)行擴(kuò)增及檢測(cè)設(shè)置。

擴(kuò)增條件設(shè)置為:94 ℃預(yù)變性30 s,循環(huán)階段94 ℃進(jìn)行5 s變性,60 ℃退火30 s,進(jìn)行40～45個(gè)循環(huán),引物序列見表1。擴(kuò)增結(jié)束后,數(shù)據(jù)處理以β-actin為內(nèi)參基因,由2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 目的基因qPCR引物序列

2.3.9 小鼠腸道微生物群落多樣性組成譜分析 小鼠處死后,解剖小鼠后取出小腸腸段,用消毒處理過(guò)的器械剪開小腸,將其內(nèi)容物全部收集至無(wú)菌離心管中,迅速置于液氮冷凍保存。采用Illumina PE250平臺(tái)對(duì)DNA片段進(jìn)行雙端測(cè)序,測(cè)序相關(guān)工作由上海派森諾公司完成。

3 結(jié)果

3.1 黃芪總提物可有效改善秀麗隱桿線蟲衰老狀態(tài)

由圖1A可知,在自然衰老情況下,黃芪總提物各劑量組可顯著提高線蟲的自然壽命,且生存曲線提示,在生命后期黃芪總提物的改善作用更為明顯。進(jìn)一步分析壽命數(shù)據(jù)可知,低劑量(P<0.01)及高劑量(P<0.05)黃芪總提物給藥后均能顯著提高線蟲的平均壽命,各劑量組均能顯著提高線蟲的最高壽命(P<0.000 1)(表2),以上結(jié)果初步提示黃芪具有良好的抗衰老藥效。

注:A.黃芪總提物對(duì)線蟲自然壽命的影響;B.不同時(shí)期線蟲的運(yùn)動(dòng)能力;C.不同時(shí)期線蟲的咽泵速率;D.各組線蟲體內(nèi)脂褐素?zé)晒怙@微圖(標(biāo)尺=200 μm);E.各組線蟲體內(nèi)脂褐素?zé)晒鈴?qiáng)度定量分析。與Aged組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1。

表2 黃芪總提物對(duì)線蟲自然壽命的影響

隨著時(shí)間增長(zhǎng),線蟲的爬行能力及咽泵速率均呈下降趨勢(shì),說(shuō)明線蟲機(jī)體狀態(tài)隨壽命增長(zhǎng)而日漸弱化。與空白對(duì)照組相比,黃芪總提物各劑量組可在Day10、14、17顯著改善其爬行能力(P<0.05)(圖1B);黃芪總提物各劑量組均顯著改善了線蟲在Day10、14、18的咽泵速率(P<0.01)(圖1C),提示黃芪總提物具有一定改善機(jī)體健康狀態(tài)的作用。

與空白對(duì)照組相比,黃芪總提物干預(yù)15 d后,各劑量組線蟲體內(nèi)脂褐素?zé)晒鈴?qiáng)度較弱(P<0.01,P<0.000 1),黃芪總提物能顯著降低線蟲體內(nèi)脂褐素的堆積(圖1D～E),提示黃芪具有一定抗衰老作用。

3.2 黃芪總提物可有效改善黑腹果蠅衰老狀態(tài)

由圖2A～B的生存曲線可知,在自然衰老情況下,黃芪總提物各劑量對(duì)果蠅的生存率均無(wú)顯著影響。然而對(duì)壽命計(jì)算可得,中劑量(1.25 mg·mL-1)黃芪總提物可顯著提高雌性果蠅的平均壽命(P<0.05),各劑量組的黃芪總提物均可顯著提高雌性果蠅的中位壽命(P<0.05,P<0.01)(表3)。采用紫外照射的方法構(gòu)建果蠅的氧化損傷模型,加速其衰老進(jìn)程。由圖2C～D可知,與未進(jìn)行紫外照射的果蠅相比,紫外照射后果蠅壽命縮短(P<0.05),提示紫外照射成功引起機(jī)體損傷反應(yīng)。而給藥組均不同程度地改善果蠅生存率,其中以中劑量組(1.25 mg·mL-1)效果最為顯著(P<0.05,P<0.01),提示黃芪總提物可降低紫外輻射造成的機(jī)體損傷,提高壽命延緩衰老。

注:A.雌性自然衰老果蠅生存率;B.雄性自然衰老果蠅生存率;C.UV應(yīng)激下雌性果蠅生存率;D.UV應(yīng)激下雄性果蠅生存率;E.雌性自然衰老果蠅逆重力爬行;F.雄性自然衰老果蠅逆重力爬行。與Aged組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。

表3 黃芪總提物對(duì)果蠅自然衰老壽命的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組雌性果蠅相比,黃芪總提物各劑量組對(duì)其爬行能力未見明顯改善作用(圖2E);而與空白對(duì)照組雄性果蠅相比,黃芪總提物各劑量均顯著提高了雄性果蠅的逆重力爬行能力(P<0.05,P<0.01,P<0.001,P<0.0001)(圖2F),提示黃芪總提物具有一定改善機(jī)體健康狀態(tài)的作用。

3.3 黃芪總提物可顯著改善小鼠的腸道結(jié)構(gòu)及功能

以口服葡萄糖吸收以及胭脂紅染色來(lái)評(píng)估小鼠的腸道功能,黃芪總提物給藥可顯著增加18月齡小鼠15 min時(shí)間點(diǎn)的葡萄糖吸收(P<0.05)(圖3A),促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)吸收。隨著年齡增長(zhǎng),衰老小鼠也出現(xiàn)更長(zhǎng)的腸道轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間(P<0.01),黃芪總提物可顯著恢復(fù)其腸道轉(zhuǎn)運(yùn)功能(P<0.05)(圖3B)。對(duì)于以上功能變化,在2組小鼠臟籠交換飼養(yǎng)后,黃芪總提物則未見改善效果。

在腸道整體形態(tài)上,隨著年齡增長(zhǎng),衰老小鼠消化道、小腸、結(jié)腸長(zhǎng)度出現(xiàn)代償性增長(zhǎng)(P<0.001,P<0.000 1),以達(dá)到保證足夠營(yíng)養(yǎng)吸收的目的(圖3C～F)。黃芪總提物給藥后能夠顯著恢復(fù)衰老小鼠消化道、小腸、結(jié)腸長(zhǎng)度(P<0.01,P<0.000 1)(圖3E～F),這提示黃芪總提物具有一定的腸道保護(hù)作用。

經(jīng)臟籠飼養(yǎng)后,未經(jīng)給藥的衰老組小鼠在消化道、結(jié)腸長(zhǎng)度上也相較于普通衰老小鼠較短(P<0.05),而臟籠給藥組小鼠的藥效作用并沒(méi)有普通給藥組顯著(圖3C～F),這提示黃芪總提物對(duì)腸道形態(tài)的作用與腸道微生物存在密切聯(lián)系。

3.4 黃芪總提物能顯著改善18月齡小鼠的腸道結(jié)構(gòu)

對(duì)小鼠空腸組織進(jìn)行AB-PAS染色,顯微鏡下觀察其腸道絨毛結(jié)構(gòu)(圖4A)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與年輕對(duì)照組小鼠相比,自然衰老小鼠小腸絨毛出現(xiàn)代償性增長(zhǎng)(P<0.01),且黃芪總提物能恢復(fù)空腸組織中的小腸絨毛長(zhǎng)度。

注:A.各組小鼠空腸組織AB-PAS染色顯微圖(標(biāo)尺:50～200 μm);B.各組小鼠空腸絨毛平均長(zhǎng)度;C.各組小鼠空腸絨毛上杯狀細(xì)胞數(shù)量。與Aged組比較,*P<0.05,**P<0.01,****P<0.000 1。

經(jīng)臟籠飼養(yǎng)后,未經(jīng)給藥的衰老組小鼠小腸絨毛長(zhǎng)度也相較于普通衰老小鼠較短(P<0.05),而臟籠給藥組小鼠的藥效作用并沒(méi)有普通給藥組顯著(圖4B)。

鏡下觀察AB-PAS病理染色,研究發(fā)現(xiàn),與年輕小鼠相比,自然衰老小鼠小腸絨毛中杯狀細(xì)胞數(shù)量減少(P<0.000 1),經(jīng)黃芪總提物給藥后,可顯著增加其杯狀細(xì)胞數(shù)量(P<0.01)。黃芪或可通過(guò)恢復(fù)杯狀細(xì)胞的數(shù)量來(lái)進(jìn)一步促進(jìn)其黏液分泌,以實(shí)現(xiàn)腸道保護(hù)。經(jīng)臟籠飼養(yǎng)后,給藥組小鼠的藥效作用并沒(méi)有普通給藥組顯著(圖4C),提示黃芪總提物對(duì)腸道形態(tài)的作用與腸道微生物存在密切聯(lián)系。

3.5 黃芪總提物能促進(jìn)18月齡小鼠的腸干細(xì)胞增殖能力

研究結(jié)果顯示,隨著年齡增長(zhǎng),小鼠腸道組織中Lgr5基因以及黏蛋白Muc2基因表達(dá)量顯著降低(P<0.05,P<0.001),黃芪總提物給藥后能顯著提高M(jìn)uc2基因表達(dá)量(P<0.01),并對(duì)Lgr5表達(dá)有一定恢復(fù)趨勢(shì)(圖5A～B)。經(jīng)臟籠飼養(yǎng)后,未經(jīng)給藥的衰老組小鼠體內(nèi)基因表達(dá)水平也接近于給藥組小鼠。

注:A.各組小鼠空腸組織中各基因表達(dá)量;B.各組小鼠空腸組織Edu標(biāo)記腸細(xì)胞顯微圖(標(biāo)尺:100 μm);C.各組小鼠腸干細(xì)胞遷移距離。與Aged組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1。

Edu標(biāo)記腸干細(xì)胞染色結(jié)果顯示,黃芪總提物給藥后,可顯著提高腸干細(xì)胞的遷移距離(P<0.000 1)(圖5C)。而臟籠飼養(yǎng)的2組小鼠腸干細(xì)胞的增殖能力趨于相近,均高于模型組的遷移距離(P<0.05,P<0.000 1),但未達(dá)到普通給藥組的改善效果(圖5D)。

3.6 黃芪總提物對(duì)衰老小鼠的腸道菌群紊亂具有一定改善作用

為了探究黃芪對(duì)衰老小鼠腸道微生物群的影響,本研究首先采用16S rRNA測(cè)序分析了小鼠的腸道菌群多樣性。研究結(jié)果顯示,隨著年齡增長(zhǎng),小鼠腸道微生物群Chao1指數(shù)顯著降低(P<0.001),黃芪給藥后具有一定改善趨勢(shì),且經(jīng)臟籠飼養(yǎng)的衰老組小鼠的Chao1指數(shù)也高于普通衰老組小鼠;但與年輕對(duì)照組相比,衰老小鼠腸道菌群Shannon以及Simpson指數(shù)均顯著提高(P<0.05,P<0.001)(圖6A)。在門水平上對(duì)各組小鼠進(jìn)行對(duì)比分析,結(jié)果顯示衰老組小鼠的物種組成與年輕小鼠存在差別,且黃芪給藥后也具有一定恢復(fù)作用(圖6B)。對(duì)小鼠腸道微生物各級(jí)類群進(jìn)行分析(圖6C)發(fā)現(xiàn),黃芪給藥后僅對(duì)科和屬的各類群數(shù)量有一定改善趨勢(shì)但無(wú)顯著作用。PCoA分析顯示衰老小鼠的腸道微生物群與年輕小鼠存在顯著差別,且黃芪給藥后具有一定改變,且同籠飼養(yǎng)的小鼠在微生物組成上趨于一致性(圖6D)。

注:A.各組小鼠Alpha指數(shù)比較;B.各組小鼠在門水平上物種組成;C.各級(jí)微生物分類群數(shù)量;D.各組小鼠PCoA分析結(jié)果。與Aged組比較,*P<0.05,***P<0.001。

進(jìn)一步深入分析厚壁門(Firmicutes)下細(xì)菌類群發(fā)現(xiàn),黃芪給藥可顯著上調(diào)衰老小鼠體內(nèi)芽孢桿菌綱(Bacilli)、乳酸桿菌科(Unidentified-Lactobacillus)細(xì)菌豐度(P<0.05,P<0.01)(圖7A～F)。另外,分析發(fā)現(xiàn)黃芪總提物還可顯著下調(diào)假單胞菌目(Pseudomonadales)下莫拉菌科(Moraxellaceae)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)以及嗜冷菌屬亞種(Psychrobacter-Sanguinis)豐度(P<0.01)(圖7G～J)。

且經(jīng)臟籠飼養(yǎng)后,未經(jīng)給藥的衰老小鼠其各菌群豐度接近于常規(guī)給藥組,而臟籠給藥組則失去顯著藥效。綜上結(jié)果可得,黃芪對(duì)小鼠的腸道菌群調(diào)控作用受到菌群本身變化的影響,腸道微生物在其中發(fā)揮重要作用。

4 討論

本研究引入非嚙齒類生物秀麗隱桿線蟲及黑腹果蠅作為黃芪總提物的藥效學(xué)評(píng)估對(duì)象,初步評(píng)價(jià)其抗衰老藥效。研究結(jié)果顯示,黃芪總提物具有較明顯的抗衰老藥效,為進(jìn)一步在小鼠體內(nèi)考察其藥效及機(jī)制提供了良好的基礎(chǔ)。

基于課題組前期研究基礎(chǔ),本研究主要考察黃芪總提物在13～18月齡期間干預(yù)小鼠衰老進(jìn)程的藥效作用,并聚焦于黃芪對(duì)小鼠腸道衰老的作用。小腸是人體最大的營(yíng)養(yǎng)吸收及免疫器官,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要由腸絨毛吸收。隨著年齡增長(zhǎng),腸絨毛結(jié)構(gòu)惡化,隱窩數(shù)目和深度度減少,腸干細(xì)胞數(shù)目減少和增殖能力減退[11]。研究結(jié)果顯示,黃芪總提物給藥5個(gè)月可顯著改善小鼠的腸道營(yíng)養(yǎng)吸收功能、轉(zhuǎn)運(yùn)功能,并能恢復(fù)腸道長(zhǎng)度,改善小腸絨毛形態(tài)(圖4)。

腸干細(xì)胞耗竭是目前公認(rèn)的衰老標(biāo)志。衰老腸干細(xì)胞再生分化功能失衡是誘發(fā)老年人腸道相關(guān)疾病的關(guān)鍵病理機(jī)制[12-13]。調(diào)控腸干細(xì)胞是延緩衰老的潛在途徑之一[14]。有研究[15]也揭示了年齡相關(guān)的吸收不良主要是由于腸干細(xì)胞的耗竭和活性降低。本研究結(jié)果顯示,黃芪給藥后可增加腸干細(xì)胞遷移距離,上調(diào)腸干細(xì)胞標(biāo)志物L(fēng)gr5和腸杯狀細(xì)胞標(biāo)志物Muc2的基因轉(zhuǎn)錄水平。以上結(jié)果初步提示,黃芪可以恢復(fù)老年小鼠腸干細(xì)胞數(shù)量,并促進(jìn)干細(xì)胞分化,增加腸道終末分化功能細(xì)胞數(shù)量(圖4)。

近年來(lái),也多有研究發(fā)現(xiàn),在哺乳動(dòng)物中通過(guò)糞菌移植可影響衰老表征變化[16-17]。這些研究都為調(diào)控腸道菌群以干預(yù)衰老提供了新的證據(jù)。本研究將老年小鼠給予黃芪后,與未給藥的老年小鼠互換籠盒飼養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn),臟籠飼養(yǎng)的2組小鼠在腸道吸收能力、腸道形態(tài)、腸絨毛結(jié)構(gòu)、腸干細(xì)胞及相關(guān)標(biāo)志物水平上都趨于一致性,且均與單獨(dú)給藥組和衰老組小鼠存在差別。因此,腸道菌群或許是黃芪改善腸干細(xì)胞功能的關(guān)鍵要素。

黃芪總提物可在一定程度上改善隨年齡增加引起的腸道菌群紊亂,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)黃芪改善腸道微生物主要聚焦于對(duì)乳酸桿菌的恢復(fù)作用。與本研究結(jié)果類似的,有報(bào)道[18]在衰老小鼠模型中施用嗜酸乳桿菌DDS-1已被證明可以引起腸道微生物組成變化,導(dǎo)致代謝表型的改善,并增強(qiáng)盲腸和黏膜短鏈脂肪酸的產(chǎn)生;唾液乳桿菌也已被證明可以促進(jìn)秀麗隱桿線蟲的生長(zhǎng)并延長(zhǎng)其壽命;植物乳桿菌TWK10被證實(shí)可以改善衰老引起的身體成分改變,特別是肌肉質(zhì)量、力量和脂肪量的改變。

黃芪總提物可有效改善衰老小鼠的腸道功能,恢復(fù)腸干細(xì)胞增殖分化活力,可推測(cè)黃芪或可通過(guò)對(duì)腸道乳桿菌的恢復(fù)進(jìn)一步促進(jìn)腸干細(xì)胞的活性,但其中因果關(guān)系后續(xù)需進(jìn)一步通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。