趙新如,程建明,薛峰

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 210023)

郁李仁為薔薇科郁李的種仁,其又名小李仁或李仁肉,是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食兩用原料[1]。郁李仁富含纖維素,因此被認(rèn)為具有促進(jìn)消化和降低膽固醇的作用[2]。此外,郁李仁中還富含抗氧化物質(zhì),因此也被認(rèn)為具有保護(hù)心腦血管和抗癌的作用[3-4]。一直以來(lái),郁李仁被用于提取纖維素、油脂和苦杏仁苷。然而,關(guān)于郁李仁中蛋白質(zhì)的研究卻鮮有報(bào)道。郁李仁蛋白作為植物蛋白的一種,其研究與開發(fā)可以減少動(dòng)物蛋白的使用,從而降低溫室氣體的排放[5]。然而,與動(dòng)物蛋白相比,植物蛋白的功能特性較差,通常需要進(jìn)行某些修飾以增強(qiáng)其功能特性。常用的修飾方法包括物理改性、化學(xué)改性和酶法改性[6]。然而,如何改善郁李仁蛋白質(zhì)功能特性尚缺乏系統(tǒng)性的研究。

本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn),采用超聲波處理可以改善郁李仁分離蛋白的溶解性、乳化性、起泡性和凝膠特性[1];采用高壓均質(zhì)處理可以改善郁李仁分離蛋白的溶解性和流變學(xué)特性[7];采用多糖接枝修飾可以改善郁李仁分離蛋白的成膜特性[8]。然而,能否采用酶法修飾改善郁李仁分離蛋白功能特性尚未可知。此外,與物理修飾和化學(xué)修飾相比較,酶法修飾具有特異性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、工業(yè)化程度高以及安全性高等優(yōu)勢(shì)。限制性酶解技術(shù)是一種廣泛用于改善植物蛋白質(zhì)功能特性的生物學(xué)方法,可以對(duì)植物蛋白質(zhì)進(jìn)行部分水解,使得植物蛋白質(zhì)發(fā)生去折疊化,從而暴露更多的活性基團(tuán)[9]。目前,該技術(shù)已經(jīng)成功用于改善大豆蛋白[10]、豌豆蛋白[11]、綠豆蛋白[12]、大米蛋白[13]、藜麥蛋白[14]以及核桃蛋白[15]的功能特性。因此,本研究擬采用限制性酶解技術(shù)來(lái)改善郁李仁蛋白的功能特性,以期為拓展郁李仁蛋白的應(yīng)用領(lǐng)域提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

郁李仁(貨號(hào):2212139,寧夏明德中藥飲片有限公司);堿性蛋白酶、福林酚試劑、疏水熒光探針(ANS)、牛血清白蛋白、亮氨酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、十二烷基磺酸鈉(SDS)、大豆油(貨號(hào):S10154、S30000、S27737、S12012、S20120、S24162、S30731、S15013、S24362,上海源葉生物科技有限公司);三硝基苯磺酸(TNBS)(貨號(hào):P2297,美國(guó)Sigma公司);上樣緩沖液、預(yù)制膠、考馬斯亮藍(lán)染液、電泳緩沖液(貨號(hào):W004-1-1、W002-6-1、W010-1-1、W007-1-1,南京建成生物工程研究所);蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品(貨號(hào):26616,美國(guó)Thermo Scientific公司);氫氧化鈉(貨號(hào):150708,西隴化工股份有限公司);鹽酸(貨號(hào):20170914,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)。

TD-6離心機(jī),長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司;FA1204電子分析天平,上海市安亭電子儀器廠;PHS-3E pH計(jì),上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;LGJ-18S冷凍干燥機(jī),北京松源華興科技發(fā)展有限公司;HH-6水浴鍋,常州國(guó)華電器有限公司;FM200高速剪切機(jī),上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司;752N紫外可見分光光度計(jì),上海儀電分析儀器有限公司;F-7000熒光光譜儀,日本Hitachi公司;電泳儀,美國(guó)Bio-rad公司;Mos-450圓二色譜儀,法國(guó)Biologic公司;Q500差示掃描量熱儀,美國(guó)TA公司;DSA25表面張力儀,德國(guó)Kruss公司;Spark10M酶標(biāo)儀,瑞士Tecan公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 郁李仁分離蛋白的制備 采用本團(tuán)隊(duì)建立的堿提酸沉法來(lái)制備郁李仁分離蛋白[1],其步驟簡(jiǎn)述如下:將郁李仁粉碎過(guò)60目篩備用。在過(guò)篩后的郁李仁粉中加入正己烷脫脂。將脫脂后的郁李仁粉分散在去離子水中,調(diào)整pH值至8.5以提取蛋白質(zhì)。調(diào)整pH值至4.5,離心收集蛋白質(zhì)沉淀。將蛋白質(zhì)沉淀分散在去離子水中,調(diào)整pH至7.0,冷凍干燥后于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 限制性酶解 將5 g郁李仁分離蛋白分散到100 mL去離子水中。將蛋白質(zhì)溶液放入恒溫水浴鍋中(60 ℃),調(diào)整pH至8.5。加入堿性蛋白酶,酶與底物的質(zhì)量比例為0.05∶1。酶解時(shí)間為0～2 h。反應(yīng)結(jié)束后采用高溫(95 ℃,10 min)處理來(lái)終止酶解,并調(diào)整pH值至7.0。樣品處理結(jié)束后,采用冷凍干燥獲得酶解產(chǎn)物。

1.2.3 水解度的測(cè)定 采用TNBS法測(cè)定郁李仁分離蛋白的水解度[16],其步驟簡(jiǎn)述如下:將10 mg樣品溶解在10 mL SDS溶液中。取0.125 mL樣品溶液加入到1 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol·L-1,pH 8.2)中。加入1 mL TNBS溶液后啟動(dòng)反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后在340 nm下測(cè)定吸光度。同時(shí)以亮氨酸做標(biāo)準(zhǔn)品,計(jì)算郁李仁分離蛋白的水解度。

1.2.4 亞基組成分析 采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法分析樣品的亞基組成[1]。

1.2.5 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 采用圓二色譜法測(cè)定樣品的二級(jí)結(jié)構(gòu)[17]。樣品濃度為0.2 mg·mL-1,掃描波長(zhǎng)為190～250 nm。

1.2.6 三級(jí)結(jié)構(gòu)分析 采用內(nèi)源熒光光譜法測(cè)定樣品的三級(jí)結(jié)構(gòu)[17]。樣品濃度為1.5 mg·mL-1,激發(fā)波長(zhǎng)為290 nm,掃描波長(zhǎng)為300～400 nm。

1.2.7 溶解性測(cè)定 采用福林酚法測(cè)定樣品的溶解性[1],其步驟簡(jiǎn)述如下:采用去離子水配制2 mg·mL-1的樣品溶液,分別調(diào)整pH值至3～8。在12 000×g下離心30 min,取上清液測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品,計(jì)算樣品溶解度。

1.2.8 乳化性測(cè)定 采用濁度法測(cè)定樣品的乳化活性和乳化穩(wěn)定性[1],其步驟簡(jiǎn)述如下:采用磷酸鹽緩沖液(10 mmol·L-1,pH=7.0)配制2 mg·mL-1的樣品溶液。取30 mL的樣品溶液與10 mL的大豆油混合。經(jīng)高速剪切后,分別于0、5 min取50 μL乳液與5 mL SDS溶液混合,在500 nm下測(cè)定吸光值,用于計(jì)算乳化活性和乳化穩(wěn)定性。

1.2.9 ζ-電勢(shì)測(cè)定 采用ζ-電勢(shì)儀測(cè)定樣品的ζ-電勢(shì),樣品濃度為0.2 mg·mL-1。

1.2.10 表面疏水性測(cè)定 采用熒光探針測(cè)定樣品的表面疏水性[1],其步驟簡(jiǎn)述如下:將1 mL樣品溶液(0.05～2.00 mg·mL-1)與5 μL ANS溶液(0.05%)混合后,測(cè)定其熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長(zhǎng)為390 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為470 nm。

1.2.11 表面張力測(cè)定 采用杜諾依環(huán)法測(cè)定樣品的表面張力,其步驟如下:將2 mg·mL-1的樣品溶液滴入大豆油中,于300 s后測(cè)定該體系的表面張力值。

1.2.12 熱穩(wěn)定性測(cè)定 采用差示掃描量熱儀分析樣品的熱穩(wěn)定性。樣品質(zhì)量5.0 mg,溫度掃描范圍20～200 ℃,升溫速率10 ℃·min-1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品平行測(cè)定3次,所獲得的數(shù)據(jù)采用SPSS26.0軟件進(jìn)行平均值計(jì)算和單因素方差分析(One-WayANOVA)。在95%的置信區(qū)間,采用Duncan檢驗(yàn)比較不同處理之間的顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 酶解處理對(duì)郁李仁分離蛋白水解度的影響

如圖1所示,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),郁李仁分離蛋白的水解度呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)。這一結(jié)果表明,在堿性蛋白酶的作用下,郁李仁蛋白質(zhì)中的肽鍵開始斷裂,從而釋放出更多的游離氨基。

注:相同字母表示P>0.05,不同字母表示P<0.05。

2.2 酶解處理對(duì)郁李仁分離蛋白亞基組成的影響

如圖2所示,郁李仁分離蛋白的亞基主要集中在43～55 kDa和17～26 kDa兩個(gè)區(qū)域。在加入堿性蛋白酶反應(yīng)0.5 h后,郁李仁分離蛋白中分子量在43～55 kDa的亞基出現(xiàn)了缺失,而同時(shí)出現(xiàn)了2個(gè)分子量小于17 kDa的新亞基。這一結(jié)果說(shuō)明堿性蛋白酶處理可以誘導(dǎo)郁李仁分離蛋白發(fā)生水解,從而形成新的亞基。此外,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),郁李仁分離蛋白逐漸出現(xiàn)3個(gè)分子量小于17 kDa的新亞基,這一結(jié)果也很好地解釋了水解度隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增加的原因(圖1)。

圖2 限制性酶解處理對(duì)郁李仁分離蛋白亞基組成的影響

2.3 酶解處理對(duì)郁李仁分離蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

如圖3所示,在加入堿性蛋白酶反應(yīng)0.5 h后,郁李仁分離蛋白中無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯的增加。這一結(jié)果表明堿性蛋白酶誘導(dǎo)的水解使得郁李仁分離蛋白結(jié)構(gòu)由有序轉(zhuǎn)向無(wú)序。然而,當(dāng)酶解時(shí)間延長(zhǎng)至2.0 h時(shí),郁李仁分離蛋白中無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的比例卻開始下降。

2.4 酶解處理對(duì)郁李仁分離蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

如圖4所示,堿性蛋白酶修飾使得郁李仁分離蛋白的熒光強(qiáng)度增加。這一結(jié)果說(shuō)明郁李仁分離蛋白中色氨酸上吲哚環(huán)的微環(huán)境發(fā)生了變化,即蛋白質(zhì)發(fā)生了去折疊化現(xiàn)象,酶解修飾誘導(dǎo)郁李仁分離蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。然而,當(dāng)酶解時(shí)間延長(zhǎng)至2.0 h時(shí),郁李仁分離蛋白的熒光強(qiáng)度發(fā)生了下降。

2.5 酶解處理對(duì)郁李仁分離蛋白溶解性的影響

如圖5所示,郁李仁分離蛋白的溶解度在pH=5時(shí)最低,而當(dāng)pH值偏離5時(shí),溶解度逐漸增加,這說(shuō)明郁李仁分離蛋白的等電點(diǎn)在5附近。與未經(jīng)酶解修飾的郁李仁分離蛋白相比較,酶解處理可以增加郁李仁分離蛋白的溶解度,尤其是可以顯著提高等電點(diǎn)附近的溶解度。此外,郁李仁分離蛋白的溶解度隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。

注:相同字母表示P>0.05,不同字母表示P<0.05。

2.6 酶解處理對(duì)郁李仁分離蛋白乳化性的影響

如圖6～7所示,酶解處理可以顯著改善郁李仁分離蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。然而,當(dāng)酶解時(shí)間延長(zhǎng)至2.0 h時(shí),郁李仁分離蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性均有所下降。

注:相同字母表示P>0.05,不同字母表示P<0.05。

注:相同字母表示P>0.05,不同字母表示P<0.05。

2.7 酶解處理對(duì)郁李仁分離蛋白ζ-電勢(shì)的影響

如圖8所示,酶解處理可以顯著增加郁李仁分離蛋白表面的電荷數(shù)量,這主要與酶解處理誘導(dǎo)蛋白質(zhì)內(nèi)部帶點(diǎn)基團(tuán)的暴露相關(guān)。而表面電荷數(shù)量的增加也有助于解釋溶解性和乳化性的提高,因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子間靜電相互作用力的增加有助于其在溶液中的分散以及提高其所制備乳液的穩(wěn)定性[18]。然而,當(dāng)酶解時(shí)間延長(zhǎng)至2.0 h時(shí),郁李仁分離蛋白表面的電荷數(shù)量有所下降,這同樣可能與蛋白質(zhì)聚集行為的產(chǎn)生有關(guān)。

2.8 酶解處理對(duì)郁李仁分離蛋白表面疏水性的影響

如圖9所示,酶解處理可以顯著增加郁李仁分離蛋白的表面疏水性,這主要與酶解處理誘導(dǎo)非極性氨基酸的暴露相關(guān)[19]。而表面疏水性的增加也有助于解釋乳化性的改善(圖6～7),因?yàn)檩^高的表面疏水性可以提高蛋白質(zhì)在油水界面的吸附能力。然而,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)中過(guò)多的疏水基團(tuán)暴露時(shí),蛋白質(zhì)分子間會(huì)通過(guò)疏水相互作用力形成新的聚集體,這也就是為什么當(dāng)酶解時(shí)間延長(zhǎng)至2.0 h時(shí),表面疏水性會(huì)發(fā)生下降的主要原因。

注:相同字母表示P>0.05,不同字母表示P<0.05。

2.9 酶解處理對(duì)郁李仁分離蛋白表面張力的影響

如圖10所示,酶解處理可以顯著降低郁李仁分離蛋白在油水界面的表面張力,這主要是因?yàn)槊附馓幚砜梢哉T導(dǎo)小分子肽鏈的釋放、疏水性基團(tuán)的暴露以及蛋白質(zhì)分子的去折疊化[20]。而表面張力的降低也有助于進(jìn)一步解釋乳化性的改善。此外,當(dāng)酶解時(shí)間延長(zhǎng)至2.0 h時(shí),表面張力有所增加,這同樣可以歸因于過(guò)度酶解所導(dǎo)致的蛋白質(zhì)聚集體的形成。

注:相同字母表示P>0.05,不同字母表示P<0.05。

2.10 酶解處理對(duì)郁李仁分離蛋白熱穩(wěn)定性的影響

如圖11所示,酶解處理可以降低郁李仁分離蛋白的變性溫度,且其變性溫度隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。這主要是因?yàn)槊附庹T導(dǎo)小分子肽鏈的形成,而這些小分子肽鏈在熱處理過(guò)程中,更易于發(fā)生結(jié)構(gòu)變化,從而降低了蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。

圖11 限制性酶解處理對(duì)郁李仁分離蛋白熱穩(wěn)定性的影響

3 討論

本研究采用堿性蛋白酶,是因?yàn)閷?duì)于大多數(shù)植物蛋白而言,堿性蛋白酶比中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶具有更高的水解度[12]。因此,在獲得相同水解度的時(shí)候,采用堿性蛋白酶所需的時(shí)間將更短。此外,堿性蛋白酶也被廣泛用于藜麥蛋白、花生蛋白、大米蛋白、火麻仁蛋白和鷹嘴豆蛋白等植物蛋白的水解[21]。

本研究采用SDS-PAGE法對(duì)蛋白質(zhì)亞基進(jìn)行分析,該方法僅能對(duì)蛋白質(zhì)亞基含量變化進(jìn)行半定量分析,即通過(guò)觀測(cè)相應(yīng)條帶的增減或者粗細(xì)來(lái)判斷亞基含量的多少。因此,未來(lái)可以采用凝膠色譜柱或者分子篩技術(shù)對(duì)相應(yīng)亞基進(jìn)行分離純化,繼而對(duì)其進(jìn)行定量和定性分析,這也可以為進(jìn)一步闡釋酶解修飾的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

酶解修飾導(dǎo)致蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)由有序轉(zhuǎn)向無(wú)序,主要因?yàn)槊附馄茐牧说鞍踪|(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中的氨基酸序列,從而導(dǎo)致維持二級(jí)結(jié)構(gòu)的分子間相互作用力發(fā)生了變化,具體反映在二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲含量的增加[22]。然而,過(guò)度酶解卻導(dǎo)致二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲含量的下降。這可能是因?yàn)槊附鈱?dǎo)致郁李仁分離蛋白內(nèi)部的疏水性基團(tuán)、氨基或者羥基過(guò)度的暴露,而這些暴露的基團(tuán)可以通過(guò)疏水相互作用或者氫鍵迫使蛋白質(zhì)重新形成有序的結(jié)構(gòu)。導(dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)部分子過(guò)度暴露的修飾技術(shù)不僅局限于酶解修飾,其他修飾技術(shù),例如超聲波,也會(huì)誘導(dǎo)植物蛋白內(nèi)部基團(tuán)的過(guò)度暴露,從而出現(xiàn)蛋白質(zhì)重新聚集的現(xiàn)象[1,23-24]。

蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光的強(qiáng)弱可以反映蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[25]。本研究表明,適度酶解可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生去折疊化,而過(guò)度酶解卻可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)發(fā)生聚集現(xiàn)象,從而產(chǎn)生熒光遮蔽效應(yīng),具體反映在熒光強(qiáng)度的下降。這一現(xiàn)象與二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲比例下降相一致(圖3)。

酶解修飾最顯著的特征便是小分子量肽鏈的增加、內(nèi)部基團(tuán)的暴露以及結(jié)構(gòu)發(fā)生去折疊化,這些變化均可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子與水分子之間的親和性,從而改善蛋白質(zhì)的溶解性和乳化性[12,26]。此外,蛋白質(zhì)溶解性隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,這主要是因?yàn)樾》肿恿侩逆湹尼尫烹S著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。這一點(diǎn)可以通過(guò)圖2中蛋白質(zhì)亞基組成的變化來(lái)證明,即蛋白質(zhì)中小分子亞基的生成隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。

酶解修飾對(duì)郁李仁分離蛋白乳化性的改善主要?dú)w因于具有兩親性的多肽的釋放以及蛋白質(zhì)內(nèi)部游離氨基的暴露,從而提高蛋白質(zhì)在油水界面的吸附速度以及降低油水界面的表面張力[27]。而過(guò)度酶解所導(dǎo)致的乳化性能下降,可能與過(guò)度酶解誘導(dǎo)蛋白質(zhì)聚集和親水性基團(tuán)的釋放相關(guān)。前者可以降低蛋白質(zhì)在油水界面的吸附速度,后者可以降低蛋白質(zhì)在油水界面的吸附能力。

總而言之,限制性酶解技術(shù)可以顯著改善郁李仁分離蛋白的溶解性、乳化性以及表面疏水性。這些功能特性的改善主要取決于限制性酶解處理對(duì)郁李仁分離蛋白結(jié)構(gòu)的修飾作用,即誘導(dǎo)一級(jí)結(jié)構(gòu)中小分子肽鏈的釋放、誘導(dǎo)二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲比例的增加,誘導(dǎo)三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生去折疊化。然而,本文僅涉及郁李仁分離蛋白的基礎(chǔ)性研究,并未探討改性后的郁李仁分離蛋白的應(yīng)用。鑒于改性后的郁李仁分離蛋白具有較好的溶解性、乳化性以及表面疏水性,未來(lái)的應(yīng)用研究可以考慮其作為脂溶性功效成分的載體或者天然乳化劑。