王鵬,邵俊偉,左騰,郭聞一,張利龍,邱振東,王衛(wèi)星
(武漢大學人民醫(yī)院 1.普通外科 2.胃腸外Ⅱ科,湖北 武漢 430060)
急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis,ANP)是一種嚴重的消化系統(tǒng)疾病,其起病急驟、臨床癥狀嚴重,且極易導致胰腺外臟器功能損傷,其發(fā)病機制尚未完全清楚,臨床治療也缺乏有效的治療方案[1-3]。腎臟是ANP胰外臟器損傷的常見靶器官,當ANP發(fā)生時,腎功能損傷易發(fā)生在ANP的早期,ANP伴有腎功能損傷的患者病死率約為71.2%[4]。因此對于ANP相關(guān)腎功能損傷的治療十分必要,是目前ANP胰外臟器損傷研究的重點[5-7]。目前中醫(yī)藥聯(lián)合西醫(yī)治療是胰腺炎研究的熱點,芍藥苷(paeoniflorin)是傳統(tǒng)中藥材芍藥的有效提取物,具有多種藥理作用,如抗炎、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛以及免疫調(diào)節(jié)等多種功能[8-10]。其可以抑制脂多糖誘導的膿毒癥大鼠的全身炎癥反應(yīng)并提高其存活率,但是在ANP相關(guān)腎損傷中芍藥苷是否能夠發(fā)揮其藥理作用,如能發(fā)揮其作用,其具體機制如何尚未見報道。因此,本研究通過建立ANP相關(guān)腎損傷大鼠模型,應(yīng)用芍藥苷對其進行干預,觀察其干預效果,然后探討其發(fā)揮作用的可能機制。
芍藥苷(C23O28H11;分子量:480.45;純度≥95%)購于南京建成生物公司,TNF-α、IL-1β、IL-6的ELISA試劑盒購于華美生物。兔抗-NF-κBp65(1∶200;ab16502)、內(nèi)參GAPDH(1∶2 500;ab8245)和抗-caspase3(1∶100;ab2302)抗體購自Abcam公司。兔抗p38(1∶1 000;8690)和抗磷酸化p38(p-p38)(2∶1 000;4511)抗體購自Cell Signaling Technologies.(美國加利福尼亞州赫拉克勒斯)。TUNEL檢測試劑盒購于羅氏公司。
武漢大學實驗動物中心提供128只SD大鼠(體質(zhì)量180~200 g)。將大鼠置于特定的無病原體條件下,進行12 h的光暗循環(huán),并自由飲水。大鼠術(shù)前禁食。動物福利遵守赫爾辛基宣言。本研究由武漢大學動物倫理委員會批準[批號:WDRM動(福)第20221005B]。
將40只大鼠隨機分為5組,每組8只,分別為假手術(shù)組、ANP模型組(ANP組)、ANP模型+芍藥苷處理組(芍藥苷組),后者按芍藥苷劑量(50、100、150 mg/kg)分為3組。實驗前一晚大鼠禁食但可自由飲水。ANP模型采用膽胰管逆行注射5%的?;悄懰徕c(1 mg/kg)建立,假手術(shù)組僅做開腹后翻動小腸處理。3個芍藥苷組在ANP模型建立后通過股靜脈連續(xù)注射2次芍藥苷(中間間隔30 min),假手術(shù)組與ANP組以相同的方式注射生理鹽水。各組大鼠在建模后12 h異氟烷氣體麻醉后處死并取材檢測相關(guān)指標,分析安全有效的芍藥苷劑量。隨后將72只SD大鼠隨機分為3組,每組24只,分別為假手術(shù)組、ANP組、芍藥苷組,處理方法同前,芍藥苷劑量按前一部分實驗結(jié)果選擇。分別在造模后3、6、12 h,每組各取8只大鼠麻醉后處死,下腔靜脈采血,血液標本靜止30 min后離心分離血清,取大鼠胰頭組織以及腎組織取材后固定及-80 ℃凍存。
1.4.1 血清指標檢測 采用全自動生化分析儀(奧林巴斯2700,日本)檢測血清中淀粉酶(AMY)、脂肪酶(LIPA)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)水平。
1.4.2 病理學分析 大鼠胰腺組織及腎組織經(jīng)多聚甲醛固定后,石蠟包埋、切片、HE染色,通過光鏡觀察。根據(jù)Schimidt等[11]所提出的胰腺損傷病理評分對胰腺組織進行病理評分,根據(jù)Paller等[12]所提出的腎臟病理損傷評分對腎組織進行病理評分。
1.4.3 ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-1β以及IL-6的表達 取血清后低溫離心,取上清,按ELISA試劑盒說明準備標準品、洗滌工作液、生物素標記抗體工作液的配置、辣過氧化物酶標記親和素工作液,并將上述試劑放置室溫下平衡1 h,加樣,37 ℃恒溫孵育2 h,然后洗板加入辣根過氧化物酶標記親和素工作液37 ℃恒溫孵育1 h,洗板,加入底物,終止反應(yīng),應(yīng)用酶標儀測定光密度值。
1.4.4 免疫組化檢測腎臟組織NF-κB以及caspase-3的表達 腎臟組織的石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化、抗原修復、去除內(nèi)源性過氧化物酶、封閉、一抗4 ℃過夜、采用免疫組化試劑盒進行后續(xù)顯影(DAB顯色)、蘇木精染色,脫水、封片,在光鏡下觀察細胞核內(nèi)黃染為陽性表達,光鏡下拍照,采用Image Pro-Plus 6.0軟件進行統(tǒng)計分析[13]。
1.4.5 TUNEL細胞凋亡實驗 將腎組織石蠟包埋后切割成3 μm的切片。脫蠟、水化并在室溫下與蛋白酶K(武漢古德生物科技有限公司)孵育15 min。剩余步驟根據(jù)推薦的原位細胞死亡檢測試劑盒POD(Roche Diagnostics)提供的方案進行。DAB染色后用蘇木精染色細胞核。TUNEL結(jié)果用Olympus BX53顯微鏡觀察。TUNEL陽性結(jié)果為細胞核棕色染色[14]。
1.4.6 Western blot分析 使用RIPA均漿裂解大鼠腎臟組織并提取總蛋白,BCA法檢測蛋白濃度。凝膠電泳分離蛋白質(zhì),并通過Bio-Rad轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜,封閉2 h后清洗充分后,加入p38(抗體濃度1∶1 000)、p-p38(抗體濃度1∶1 000)以及GAPDH抗體(抗體濃度1∶2 500)4 ℃孵育過夜。第二天加入熒光二抗,常溫孵育1 h后,充分清洗后,應(yīng)用奧德賽紅外成像系統(tǒng)采集并轉(zhuǎn)化為灰度圖,Quality One 軟件系統(tǒng)分析灰度。
計數(shù)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(±s)表示,通過SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件采用單因素方差分析進行統(tǒng)計學處理,組間比較采用Tukey多重比較,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
不同劑量的芍藥苷均能明顯降低ANP大鼠血清AMY、LIPA水平(均P<0.05),并呈一定程度的劑量依賴趨勢,但150 mg/kg芍藥苷組的ALT、AST高于50、100 mg/kg芍藥苷組,且相較100 mg/kg組,未明顯降低AMY及LIPA水平(表1),故選擇100 mg/kg芍藥苷用于后續(xù)實驗。
表1 各組大鼠血清AMY、LIPA、ALT、AST水平(±s)Table 1 Serum levels of AMY,LIPA,ALT,and AST in each group of rats (±s)
注:1)與假手術(shù)組比較,P<0. 05;2)與ANP組比較,P<0. 05;3)與50 mg/kg芍藥苷組比較,P<0.05Notes:1) P<0.05 vs.sham surgery group; 2) P<0.05 vs.ANP group; 3) P<0.05 vs.50 mg/kg paeoniflorin group
組別假手術(shù)組ANP組芍藥苷組(mg/kg)50 100 150 AMY(U/L)1 755.7±214.0 8 287.5±1 394.51)LIPA(U/L)4 417.9±553.1 14 599.5±1 741.51)ALT(U/L)40.1±4.8 183.5±54.61)AST(U/L)127.9±37.2 618.8±165.71)480.3±70.41)357.6±51.71),2),3)514.0±65.61)7 244.1±793.21),2)6 333.1±683.91),2),3)5 244.3±445.81),2),3)14 190.3±803.11)12 675.0±735.21),2),3)11 362.8±905.01),2),3)158.6±24.81)114.1±9.41),2),3)275.2±84.51),2),3)
與假手術(shù)組比較,ANP組與芍藥苷組胰腺組織均出現(xiàn)明顯的病理學改變,后者胰腺間質(zhì)水腫較ANP組減輕,出血減少,胰腺病理學評分在各個時間均低于ANP組(均P<0.05)(圖1)。與假手術(shù)組比較,ANP組與芍藥苷組均觀察到腎臟組織病變,表現(xiàn)為不同程度的腎皮質(zhì)刷狀緣丟失、細胞壞死、小管上皮細胞脫落、管型形成和腎小管擴張,且隨著時間的延長腎臟病理評分逐步升高,但芍藥苷組腎臟病理學評分在各個時間點均低于ANP組(均P<0.05)(圖2)。
圖1 大鼠胰腺組織病理檢測 A:造模后各時間點胰腺病理學評分;B:造模后12 h各組胰腺組織HE染色(×200)Figure 1 Pathological examination of rat pancreatic tissues A: Pancreatic histopathological scores at various time points after modeling; B: HE Staining of pancreatic tissues in different groups at 12 h post-modeling (×200)
圖2 大鼠腎臟組織病理檢測 A:造模后各時間點腎臟病理學評分;B:造模后12 h各組腎臟組織HE染色(×200)Figure 2 Pathological examination of rat kidney Tissues A: Renal histopathological scores at various time points after modeling; B: HE staining of renal tissues in different groups at 12 h post-modeling (×200)
在造模后各時間點分析,ANP組與芍藥苷組的AMY均在造模后6 h達最高值,而兩組的LIPA、BUN以及Cr水平最高值均在造模后12 h出現(xiàn),但芍藥苷組的各項指標在各時間點均明顯低于ANP組(均P<0.05)(圖3)。
ELISA結(jié)果顯示,ANP組與芍藥苷組血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平在造模后均隨時間延長而逐漸升高,但芍藥苷組的以上指標水平在各時間點均明顯低于ANP組(均P<0.05)(圖4)。
圖4 各組血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較Figure 4 Comparison of serum TNF-α,IL-1β,and IL-6 levels among groups
在各組大鼠造模后12 h的腎臟組織標本中,免疫組化結(jié)果顯示,ANP組與芍藥苷組NF-κB與caspase-3的表達均明顯升高,但芍藥苷組兩者的升高程度均明顯低于ANP組(均P<0.05);TUNEL染色結(jié)果顯示,ANP組與芍藥苷組的細胞凋亡均明顯增加,但后者的細胞凋亡明顯少于前者(均P<0.05)(圖5)。
圖5 腎臟組織中NF-κB與caspase-3表達情況及細胞凋亡情況Figure 5 Expression of NF-κB and caspase-3 in renal tissues and assessment of cell apoptosis
通過Western blot檢測各組造模后12 h腎臟組織p38與p-p38的表達,結(jié)果顯示,ANP組與芍藥苷組p-p38/p38比例均明顯升高,但后者的升高程度明顯低于前者(均P<0.05),ANP組約為80%,芍藥苷組約為60%(圖6)。
圖6 各組腎臟組織p38與p-p38檢測及p-p38/p38比例比較Figure 6 Detection of p38 and p-p38 in renal tissues and comparison of the p-p38/p38 ratio in each group
急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是消化系統(tǒng)中常見疾病,屬于自限性疾病的一種,但是當治療方法不當或其他原因?qū)е轮委熝舆t時可導致ANP的發(fā)生[15]。ANP的病因主要為炎癥因子所致的級聯(lián)瀑布反應(yīng)、氧化應(yīng)激所致的細胞凋亡、腸道菌群失調(diào)等多種病理生理機制[16]。其中炎癥因子所致的級聯(lián)瀑布反應(yīng)可導致全身炎性反應(yīng)綜合征,導致胰腺外臟器的損傷[17],腎臟作為常見的靶器官,極易受到炎癥因子的影響,從而導致腎臟功能障礙,進而引發(fā)多器官功能衰竭,導致病情危重加重患者死亡[6,18-20]。目前早期液體復蘇、鎮(zhèn)痛、營養(yǎng)支持以及后期炎癥及感染性并發(fā)癥的控制是治療ANP的重要靶點,因此尋求一種新的抗炎藥物對于ANP及相關(guān)胰腺外并發(fā)癥具有重要的意義[21-24]。
芍藥苷作為傳統(tǒng)中藥芍藥的有效提取物,其藥理作用廣泛,近年來其在抗腫瘤以及抗炎等方面的藥理作用不斷被發(fā)掘[25-26]。芍藥苷在肝臟纖維化疾病、結(jié)直腸惡性腫瘤、自身免疫性肝病、潰瘍性結(jié)腸炎以及慢性疼痛中均有一定的功效,而芍藥苷在ANP相關(guān)腎損傷中的作用如何、其具體作用機制尚無明確定論,在本研究中通過構(gòu)建ANP+腎損傷大鼠模型,可以觀察到芍藥苷具有減輕ANP的炎癥反應(yīng),具體表現(xiàn)為降低胰腺病理評分,且對肝功影響較小,降低機體炎癥指標如TNF-α、IL-1β以及IL-6水平。胰腺本位器官的功能保護對于ANP的治療十分重要,在早期如能及時保護胰腺功能,逆轉(zhuǎn)炎性反應(yīng)對于患者的預后具有重要意義,但ANP之所以病情危重在于其疾病進展速度快且極易引發(fā)胰外臟器損傷,特別是腎功能損傷。本研究結(jié)果顯示,芍藥苷可減輕腎皮質(zhì)水腫,減少腎小管管型,具有保護腎功能的作用。ANP后腎損傷的一個重要機制是腎臟的急性缺血導致的腎皮質(zhì)細胞的凋亡,通過TUNEL凋亡實驗觀察到應(yīng)用芍藥苷治療后腎臟皮質(zhì)細胞TUNEL陽性細胞較ANP組明顯降低,而芍藥苷組NF-κB的表達低于ANP組(此指標反映機體氧化應(yīng)激水平),因此芍藥苷的保護機制可能為通過抑制氧化應(yīng)激所致的細胞凋亡,從而達到保護腎功能的作用。通過免疫組化檢測凋亡指標caspase-3的表達情況觀察到,應(yīng)用芍藥苷治療后,腎臟組織中caspase-3的表達情況較ANP組明顯降低。因此,結(jié)合caspase-3的表達以及TUNEL實驗的結(jié)果,芍藥苷可能通過抑制細胞凋亡起到保護腎功能的作用。
除細胞凋亡原因外,炎癥所致的應(yīng)激反應(yīng)對于細胞凋亡具有協(xié)同作用,炎癥指標TNF-α、IL-1β以及IL-6可以通過激活NF-κB的前體I-κB,使得I-κB磷酸化形成NF-κB-I-κB復合體,從而導致炎癥的發(fā)生進展,而p38信號通路,當被特定的炎性細胞因子、病原體或細胞應(yīng)激刺激時,p38被激活磷酸化后并轉(zhuǎn)移到細胞核中。p-p38可以激活I(lǐng)-κB并誘導NF-κB信號轉(zhuǎn)導途徑[27-28]。本研究表明ANP組中NF-κB的表達明顯高于假手術(shù)組,應(yīng)用芍藥苷治療后NF-κB的水平下降,而通過Western blot 技術(shù)分析p38的磷酸化情況,可以觀察到ANP組磷酸化水平最高,而應(yīng)用芍藥苷干預后腎臟組織的p38磷酸化水平明顯低于ANP組。
綜上,芍藥苷能夠改善ANP所致的急性腎損傷,其可能的機制與通過抑制P38MAPK信號通路所介導的炎癥反應(yīng)及減輕組織細胞凋亡相關(guān)。本研究僅在動物實驗及組織水平驗證了芍藥苷對于ANP相關(guān)腎損傷的保護作用,后續(xù)仍需在細胞水平進行進一步驗證。
利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明:王鵬、王衛(wèi)星負責實驗設(shè)計及具體實驗統(tǒng)籌及操作;邵俊偉負責動物實驗部分指導;左騰、郭聞一負責動物實驗部分操作;張利龍負責生化實驗部分操作及統(tǒng)計數(shù)值;邱振東負責生化實驗部分操作。