敖嘉怡， 葉連寶， 馬宇昕， 褚夫江， 周 暢△

（1廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系，廣東 廣州 510006；2廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)系，廣東 廣州 510006；3廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院/廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣東 廣州 510006）

胃癌是一種常見的起源于胃粘膜上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，其在惡性腫瘤中全球發(fā)病率居第五位、死亡率居第四位［1］。進(jìn)展期胃癌患者難以通過外科手術(shù)等手段進(jìn)行根治性治療，目前主要治療方案仍是聯(lián)合化療，但有效的化療藥物種類較少且易出現(xiàn)毒副作用。而傳統(tǒng)細(xì)胞毒性藥物對胃癌治療效果已達(dá)到瓶頸，分子靶向藥物與其相比具有低毒、高效等特點，因此近年來開發(fā)新型分子靶向藥物成為胃癌研究熱點之一。小分子酪氨酸激酶抑制劑A2B 是一種由本課題組前期以來那替尼（neratinib）和新型細(xì)胞間充質(zhì)-表皮轉(zhuǎn)化因子（cellular mesenchymal-epithelial transition factor， c-Met）抑制劑MET-2 ［spiro（indoline-3，4'-piperidine）-2-ones］作為先導(dǎo)結(jié)構(gòu)設(shè)計合成的氨基嘧啶類化合物，體外活性實驗證實A2B 對表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2， HER2）具 有 雙 重 抑 制 作用［8］，但該藥物在胃癌治療中的抗癌效應(yīng)及分子機制尚未明確。研究表明EGFR、HER2 及c-Met 的高表達(dá)與胃癌預(yù)后不良有關(guān)［2-3］，而磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase， PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B， PKB/Akt）信號通路為EGFR、HER2 及c-Met三者共同作用的下游通路［4-6］，該通路的異常激活能夠抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。本項工作擬以EGFR 及HER2 高表達(dá)的人胃癌細(xì)胞SGC-7901 為主要研究對象，以EGFR、HER2 及c-Met 為作用靶點，聚焦PI3K/Akt信號通路及腫瘤細(xì)胞凋亡途徑，探討A2B抗胃癌的作用及相關(guān)分子生物學(xué)機制，為研發(fā)治療胃癌的新型小分子酪氨酸激酶抑制劑提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

1.1 試劑 胎牛血清購自TOCYTO；RPMI-1640 培養(yǎng)液、PBS 緩沖液購自Gibco；0.25%胰蛋白酶購自BI；青、鏈霉素雙抗溶液購自HyClone；CCK-8 試劑盒購自Glpbio；二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma；Beyo-Click? EdU-488 細(xì)胞增殖檢測試劑盒、SDS-PAGE 快速配膠試劑盒、Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；EGFR 抗體、HER2 抗體、c-Met 抗體、B 細(xì)胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2， Bcl-2）抗體、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）抗體、caspase-3/p17/p19 抗體、PI3K 抗體和山羊抗兔Ⅱ抗購自Proteintech；山羊抗鼠Ⅱ抗購自上海泊灣生物技術(shù)有限公司；Akt 抗體和p-Akt 抗體購自常州市祥泰生物技術(shù)有限公司；小分子酪氨酸激酶抑制劑A2B 由本課題組葉連寶教授前期設(shè)計合成，已獲得專利授權(quán)［7］。

1.2 儀器 二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱購自Thermo Fisher；酶標(biāo)儀購自Bio-Rad；化學(xué)發(fā)光成像與分析系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司；BD FACSCalibur 流式細(xì)胞儀購自BD。

2 實驗方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞株SGC-7901 由本實驗室保存，在含10%胎牛血清、1%青、鏈霉素雙抗溶液的RPMI-1640 培養(yǎng)液中貼壁培養(yǎng)，并置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，每兩天換液一次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2 CCK-8 法檢測細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期人胃癌細(xì)胞SGC-7901 制備成5×104/mL 單細(xì)胞懸液，以每孔100 μL 接種于96 孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后根據(jù)分組更換新鮮培養(yǎng)液。分組為對照組（正常培養(yǎng)組）、不同濃度（2.5、5、10、20、40、80、100 和160 μmol/L）的A2B 實驗組和僅添加培養(yǎng)液的空白組，每組4 個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48 和72 h 后，每孔加入含10 μL CCK-8 溶液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2~3 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm 波長處各孔的吸光度（A）值，以空白孔調(diào)零，計算細(xì)胞相對活力，并使用SPSS 軟件計算IC50值。細(xì)胞相對活力（%）=（A實驗組-A空白組）/（A對照組-A空白組）×100%。實驗重復(fù)3 次。

2.3 平板集落形成實驗檢測細(xì)胞集落形成能力將處于對數(shù)生長期SGC-7901 細(xì)胞以每孔1×103接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后去除原培養(yǎng)液，分為4組：對照（control）組（細(xì)胞正常培養(yǎng)組）、溶劑組（vehicle組，用含0.08% DMSO 培養(yǎng)液處理細(xì)胞）和A2B （10和20 μmol/L）實驗組，后續(xù)實驗分組情況同此描述。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，10 d 后終止培養(yǎng)。經(jīng)4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min 后，結(jié)晶紫染色10 min，隨后使用流水清洗并晾干拍照記錄，于倒置顯微鏡下計算大于50個細(xì)胞的集落數(shù)，實驗重復(fù)3次。

2.4 EdU 細(xì)胞染色實驗檢測細(xì)胞增殖情況 EdU細(xì)胞染色實驗［17］使細(xì)胞DNA 標(biāo)記上熒光探針，增殖的細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，Hoechst 33342 染液使活細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。取對數(shù)生長期SGC-7901細(xì)胞以每孔2×104接種于24孔板中，細(xì)胞貼壁后隨機分為4 個實驗組。藥物處理24 h 后去除一半原培養(yǎng)液，更換為含EdU 的新鮮培養(yǎng)液，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h。終止培養(yǎng)后根據(jù)試劑盒中說明書進(jìn)行后續(xù)實驗，通過熒光倒置顯微鏡拍照，采用ImageJ 軟件對EdU+細(xì)胞及活細(xì)胞計數(shù)，實驗重復(fù)3次。

2.5 Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測細(xì)胞凋亡率Annexin V-FITC/PI 雙染法［18］可用于檢測細(xì)胞凋亡情況，其中Annexin V-FITC 可以染色早期凋亡細(xì)胞，呈現(xiàn)綠色熒光；PI可以染色壞死細(xì)胞或晚期凋亡細(xì)胞，呈現(xiàn)紅色熒光。取對數(shù)生長期SGC-7901 細(xì)胞接種于10 cm 培養(yǎng)皿，細(xì)胞貼壁后隨機分為4 個實驗組。藥物處理24 h 后用不含EDTA 的胰蛋白酶消化收集全部細(xì)胞，制備成3×105/mL的單細(xì)胞懸液，用預(yù)冷的PBS 洗滌1~2 次，細(xì)胞沉淀中加入200 μL Annexin VFITC 結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI，室溫避光孵育15~20 min，隨后使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，實驗重復(fù)3次。

2.6 JC-1 染色法檢測細(xì)胞線粒體膜電位變化 JC-1 染色法［19］可通過JC-1 從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變檢測線粒體膜電位的下降情況。細(xì)胞接種及給藥同2.5，藥物處理24 h 后用不含EDTA 的胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，PBS 洗滌1~2 次后用0.5 mL 完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，隨后加入0.5 ml JC-1染色工作液，充分混勻后置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育25 min。孵育結(jié)束后，40.2×g、4 ℃離心3 min，去除培養(yǎng)液后用1×JC-1染色緩沖液洗滌2 次，最后用400 μL 1×JC-1 染色緩沖液重懸細(xì)胞，并使用流式細(xì)胞儀檢測JC-1 紅綠熒光比例，實驗重復(fù)3次。

2.7 Western blot 檢測蛋白表達(dá)情況 細(xì)胞接種及給藥同2.5，藥物處理24 h后用胰蛋白酶消化收集全部細(xì)胞，預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞1~2 次，加入適量的裂解液置于冰浴中裂解20 min，利用細(xì)胞超聲破碎儀超聲8 s，共2~3次，低溫高速離心機中4 ℃、9 558.7×g離心10 min 后收集上清液，用BCA 定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量后加入5×上樣緩沖液高溫變性。每組取20~30 μg 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，然后低溫轉(zhuǎn)膜至0.22 μm PVDF 膜，TBST 洗膜1~2 次，每次5 min，5%脫脂奶粉溶液封閉2 h，按照說明書比例用抗體稀釋液稀釋Ⅰ抗/Ⅱ抗，加入Ⅰ抗于4 ℃環(huán)境中孵育過夜；Ⅰ抗孵育結(jié)束后，TBST 洗膜10 min×3 次，室溫下加入Ⅱ抗孵育1 h，TBST 洗膜10 min×3 次；置于ECL 顯影液中顯影，并利用化學(xué)發(fā)光成像與分析系統(tǒng)拍照記錄，最后用ImageJ軟件分析灰度值。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

利用GraphPad Prism 9.0 或SPSS Statistics 26.0軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，利用單因素方差分析（oneway ANOVA）檢驗各組間差異，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 A2B對人胃癌細(xì)胞SGC-7901及正常胃粘膜細(xì)胞GES-1活力的影響

利用CCK-8 法于24、48 和72 h 檢測A2B 作用于人胃癌細(xì)胞SGC-7901 的IC50值分別為26.85、19.58和12.24 μmol/L（圖1A）。同時檢測了A2B作用于正常胃粘膜細(xì)胞GES-1 24 h 后的IC50值為48.68 μmol/L（圖1B），通過擬合曲線換算A2B 作用于胃癌細(xì)胞24 h 的IC50濃度下，GES-1 細(xì)胞相對活力為72.84%?？紤]到后續(xù)其他細(xì)胞功能學(xué)實驗細(xì)胞存活狀態(tài)，故將后續(xù)部分實驗條件設(shè)定為10 和20 μmol/L A2B 作用于SGC-7901細(xì)胞24 h。

Figure 1.The viability of SGC-7901 cells （A） and GES-1 cells （B） was decreased after treatment with A2B （CCK-8 assay）.Mean±SD.n=3.圖1 A2B抑制人胃癌細(xì)胞SGC-7901及正常胃粘膜細(xì)胞GES-1的活力

2 A2B 對人胃癌細(xì)胞SGC-7901 中EGFR、HER2及c-Met蛋白表達(dá)的影響

Western blot 實驗結(jié)果顯示，與溶劑（vehicle）組相比，A2B （10 μmol/L）組中EGFR和HER2蛋白表達(dá)量顯著減少（P<0.01），而c-Met蛋白表達(dá)量無顯著變化，A2B （20 μmol/L）組中EGFR、HER2 及c-Met 蛋白表達(dá)量均顯著減少（P<0.01），見圖2。

Figure 2.A2B down-regulated the protein expression of EGFR， HER2 and c-Met in SGC-7901 cells.The protein expression levels of EGFR， HER2 and c-Met in SGC-7901 cells treated with 10 and 20 μmol/L A2B for 24 h were measured by Western blot.Mean±SD.n=3.*P<0.05， **P<0.01 vs control group； ##P<0.01 vs vehicle group； △P<0.05， △△P<0.01 vs A2B （10 μmol/L） group.圖2 A2B下調(diào)人胃癌細(xì)胞SGC-7901中EGFR、HER2和c-Met蛋白的表達(dá)水平

3 A2B對人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖能力的影響

EdU 染色實驗結(jié)果顯示，與vehicle 組相比，A2B（10 μmol/L）組和A2B （20 μmol/L）組中EdU+細(xì)胞比例顯著減少且活細(xì)胞數(shù)也逐漸減少（P<0.01）；與A2B （10 μmol/L）組相比，A2B （20 μmol/L）組中EdU+細(xì)胞比例下降更為顯著（P<0.01），見圖3A。平板集落形成實驗結(jié)果顯示，與vehicle 組相比，A2B（10μmol/L）組和A2B （20 μmol/L）組中集落數(shù)顯著減少（P<0.01），見圖3B。

Figure 3.Effect of A2B on the proliferation of SGC-7901 cells.A： the numbers of EdU+ cells were decreased after treatment with 10 and 20 μmol/L A2B for 24 h （EdU staining， scale bar=100 μm）； B： SGC-7901 cells showed weak proliferation ability with fewer colony counts after treatment with 10 and 20 μmol/L A2B for 24 h in the plate colony formation assay.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control group； ##P<0.01 vs vehicle group； △△P<0.01 vs A2B （10 μmol/L） group.圖3 A2B對人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖能力的影響

4 A2B對人胃癌細(xì)胞SGC-7901凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI 雙染法結(jié)果顯示，與vehicle組相比，A2B （10 μmol/L）組和A2B （20 μmol/L）組中細(xì)胞凋亡率顯著增加（P<0.05）；與A2B （10 μmol/L）組相比，A2B （20 μmol/L）組的細(xì)胞凋亡率增加更為顯著（P<0.01），見圖4A。JC-1 染色法結(jié)果顯示，與溶劑（vehicle）組相比，A2B （10 μmol/L）組和A2B（20 μmol/L）組中JC-1 綠色熒光比例顯著增加（P<0.01）；與A2B （10 μmol/L）組相比，A2B （20 μmol/L）組的JC-1 綠色熒光比例增加更為顯著（P<0.05），見圖4B。利用Western blot 檢測凋亡相關(guān)蛋白，與溶劑組相比，A2B （10 μmol/L）組中caspase-3 表達(dá)量顯著減少（P<0.05），A2B （20 μmol/L）組中Bax/Bcl-2 和cleaved caspase-3 表達(dá)量顯著增加且caspase-3 表達(dá)量顯著減少（P<0.05）；與A2B （10 μmol/L）組相比，20 μmol/L A2B 對Bax/Bcl-2 和caspase-3 的調(diào)控更加顯著（P<0.05），見圖4C。

5 A2B 對 人 胃 癌 細(xì) 胞SGC-7901 中PI3K/Akt 信 號通路蛋白表達(dá)的影響

Western blot 結(jié)果顯示，與vehicle 組相比，A2B（10 μmol/L）組和A2B （20 μmol/L）組中p-Akt/Akt 比值均顯著減少（P<0.05）；與A2B （10 μmol/L）組相比，A2B （20 μmol/L）組中p-Akt/Akt 比值減少更為顯著（P<0.05），見圖5。

Figure 5.A2B down-regulated the ratio of p-Akt/Akt in SGC-7901 cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05， **P<0.01 vs control group； #P<0.05， ##P<0.01 vs vehicle group； △P<0.05 vs A2B （10 μmol/L） group.圖5 A2B下調(diào)人胃癌細(xì)胞SGC-7901中p-Akt/Akt比值

討 論

目前，臨床上胃癌治療應(yīng)用的分子靶向藥物主要分為單克隆抗體、小分子抑制劑和抗體偶聯(lián)藥物。分子靶向藥物可通過阻斷腫瘤細(xì)胞異?；罨男盘柾坊蛞种七^表達(dá)的靶標(biāo)，從而達(dá)到抗腫瘤的目的［16］。

小分子酪氨酸激酶抑制劑A2B 是一種含有螺環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基嘧啶類化合物，由來那替尼和新型c-Met抑制劑MET-2作為先導(dǎo)結(jié)構(gòu)設(shè)計合成。前期實驗結(jié)果已證實A2B 對野生型EGFR 和HER2 的抑制效果與來那替尼抑制效果相當(dāng)［8］，但其對胃癌細(xì)胞的作用及分子機制尚不清楚。本研究通過體外實驗驗證了A2B 能夠抑制人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖。CCK-8實驗結(jié)果顯示A2B 呈時間-濃度依賴性抑制SGC-7901 細(xì)胞活力，且對正常胃粘膜細(xì)胞GES-1 活力影響小于SGC-7901 細(xì)胞。EdU 細(xì)胞染色實驗和平板集落形成實驗結(jié)果都進(jìn)一步證實了A2B 能顯著抑制SGC-7901細(xì)胞的增殖能力。

EGFR、HER2及c-Met同屬于酪氨酸激酶受體家族，是近年來胃癌分子靶向藥物的“明星靶點”。Fu等［9］研究表明丹皮酚能夠顯著下調(diào)HER2，抑制NFκB 信號通路的激活，從而抑制SGC-7901 細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。作為合成A2B 的先導(dǎo)結(jié)構(gòu)，來那替尼能夠選擇性抑制HER2 和EGFR 的表達(dá)，而MET-2是一種新型c-Met 抑制劑。研究表明EGFR 抑制劑的耐藥機制與MET基因擴增有關(guān)［20］，故基于來那替尼與MET-2 的結(jié)構(gòu)優(yōu)化或許可打破EGFR 抑制劑的耐藥。本研究通過Western blot 實驗檢測到10μmol/L A2B 能夠顯著下調(diào)EGFR 和HER2 蛋白表達(dá)水平，而20 μmol/L A2B 能夠同時下調(diào)EGFR、HER2及c-Met蛋白表達(dá)水平。以上結(jié)果說明，在分子生物學(xué)基礎(chǔ)上A2B 對EGFR、HER2 及c-Met 的靶向作用與其藥物設(shè)計目標(biāo)一致。

細(xì)胞凋亡屬于細(xì)胞程序性死亡的一種，細(xì)胞凋亡調(diào)控與胃黏膜組織的癌變過程存在聯(lián)系［10］。內(nèi)源性線粒體途徑是細(xì)胞凋亡發(fā)生的途徑之一，其早期標(biāo)志性事件是線粒體膜電位的破壞。Li 等［19］研究表明中草藥花椒提取物可通過破壞人肝癌細(xì)胞的線粒體膜電位，激活細(xì)胞線粒體凋亡途徑、抑制腫瘤細(xì)胞增殖。本研究通過AnnexinV-FITC/PI 雙染法和JC-1染色法證實了A2B 實驗組中SGC-7901 細(xì)胞凋亡率增加且細(xì)胞線粒體膜電位降低。抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax 同屬于Bcl-2 家族，研究表明通過調(diào)控兩者蛋白表達(dá)能夠激活caspase-9、caspase-3 及其下游底物PARP 進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞凋亡［11，14］。本研究結(jié)果顯示經(jīng)A2B 處理后SGC-7901 細(xì)胞中caspase-3蛋白表達(dá)水平下調(diào)，Bax/Bcl-2 比值及cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平上調(diào)，進(jìn)一步說明A2B能夠激活SGC-7901細(xì)胞中線粒體凋亡途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

PI3K/Akt 信號通路在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，抑制PI3K/Akt信號通路的異常激活能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和自噬［12-13，15］。同時PI3K/Akt信號通路是EGFR、HER2和c-Met三者共同作用的下游通路［4-6］。本研究檢測到經(jīng)A2B 處理后SGC-7901 細(xì)胞中Akt 磷酸化水平顯著降低，同時影響了PI3K/Akt信號通路下游線粒體途徑中Bax 和Bcl-2 的表達(dá)，表明A2B 可能通過抑制SGC-7901細(xì)胞中PI3K/Akt信號通路激活誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究以小分子酪氨酸激酶抑制劑A2B 為切入點，驗證了A2B 在人胃癌細(xì)胞SGC-7901中能夠同時抑制EGFR、HER2 及c-Met 的表達(dá)。同時本研究探討了A2B 通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞SGC-7901 發(fā)生線粒體凋亡的分子機制。下一步我們將通過建立胃癌細(xì)胞荷瘤裸鼠模型驗證體內(nèi)實驗是否與體外實驗結(jié)果一致。