彭雨婷， 武 鋒， 任益凡， 徐澤宇， 萊智勇， 徐 鈞△

（1山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001；2山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001；3山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，山西 太原 030001）

食管胃結(jié)合部腺癌（adenocarcinoma of esophagogastric junction， AEG）是腫瘤中心位于食管-胃解剖交界線上下5 cm 范圍以內(nèi)的腺癌［1］。其解剖結(jié)構(gòu)和生物學(xué)行為既不同于食管癌也不同于胃癌。在全球范圍內(nèi)，盡管遠(yuǎn)端胃癌的發(fā)病率和死亡率呈穩(wěn)步下降狀態(tài)，但AEG 的發(fā)病率在過去幾十年中持續(xù)呈現(xiàn)上升趨勢［2］，尤其在西方國家，其發(fā)病率急劇增加［3］。美國研究結(jié)果表明，自1973 年至1992 年，AEG 的發(fā)病率增加了近2.5 倍［4］。而國內(nèi)關(guān)于AEG 發(fā)病率的研究報道暫時還較少。從國內(nèi)某一項(xiàng)單機(jī)構(gòu)數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，僅在1988 年至2012 年間，在研究者所在機(jī)構(gòu)中，發(fā)現(xiàn)AEG 的比例由原來的22.3%增加到35.7%［5］。

目前，AEG 的治療方式仍然以手術(shù)為主。雖然一定程度可以短期控制病情和抑制遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，但患者的遠(yuǎn)期存活率在近年來依舊沒有明顯改善。AEG普遍預(yù)后較差的主要原因之一在于AEG的早期癥狀不典型，大部分患者在腫瘤初期階段尚未診斷出來，一旦被確診時或已經(jīng)發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等晚期征象。且AEG 的發(fā)病原因復(fù)雜，尚未知曉其明確的發(fā)病機(jī)制。因此只有明確AEG 的易感因素，在分子水平上進(jìn)行更加深入的機(jī)制研究，才能有效地遏制疾病的發(fā)生發(fā)展，便于疾病能夠早期診斷、及時治療，從而降低患者的死亡率以及提高患者的遠(yuǎn)期存活率。

多梳蛋白家族（ploycomb group proteins， PcG）通過修飾染色質(zhì)來調(diào)控轉(zhuǎn)錄過程，在調(diào)節(jié)細(xì)胞的周期和衰老、細(xì)胞命運(yùn)決定以及腫瘤等多種生理及病理功能中起到重要作用［6］。截止到目前為止，已經(jīng)有越來越多的證據(jù)表明，PcG 蛋白參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)控，其可作為治療反應(yīng)和預(yù)后的生物標(biāo)志物［7］。

色素框同源蛋白4（chromobox 4， CBX4）作為PcG 中的重要成員之一［8］，也稱為多梳蛋白2（polycomb 2， Pc2），是具有小泛素相關(guān)修飾物（small ubiquitin-related modifier， SUMD）E3 連接酶活性的蛋白質(zhì)［9］。由于其可調(diào)控RNA 轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)翻譯后修飾等多個環(huán)節(jié)，因而可參與調(diào)節(jié)多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有文獻(xiàn)報道，在多種惡性腫瘤中，如肺癌、乳腺癌、肝癌、骨肉瘤及宮頸癌等，CBX4可以作為腫瘤基因促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移［10-16］。但也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在有些腫瘤中，CBX4對腫瘤的惡性進(jìn)展起到了抑制作用，例如Wang 等［17］研究發(fā)現(xiàn)CBX4 通過介導(dǎo)Runx2 來遏制結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。CBX4是作為腫瘤基因或是抑癌因子，取決于是在何種細(xì)胞中以及與其相互起作用的因子。綜上所述，盡管CBX4 在多種腫瘤中已有研究，但CBX4 在AEG中的表達(dá)水平以及功能作用暫不清楚，有待我們進(jìn)一步研究。

本研究檢測40 對AEG 患者腫瘤組織和對應(yīng)的臨近正常組織中CBX4 的表達(dá)水平，分析CBX4 的表達(dá)量與患者預(yù)后生存時間的關(guān)系；同時選擇恰當(dāng)?shù)募?xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過敲低CBX4在AEG 細(xì)胞中的表達(dá)，研究沉默CBX4對AEG 細(xì)胞增殖、遷移以及侵襲的影響，并初步探討CBX4 在AEG 中起作用的分子機(jī)制，以期為AEG 患者提供新的分子標(biāo)志物以及治療靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 數(shù)據(jù)收集 收集山西省腫瘤醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)切除的22 例患者的AEG 組織，將這22 例患者的AEG組織以及配對的癌旁組織送往深圳華大基因研究院，采用Illumina HiSeq 測序平臺進(jìn)行高通量測序［18］。CBX4 與Wnt/β-catenin 信號通路蛋白相關(guān)性分析使用在線GEPIA2數(shù)據(jù)庫。

1.2 人胃食管結(jié)合部腺癌組織樣本 臨床組織樣本均取自于2017 年6 月至2019 年6 月在山西省腫瘤醫(yī)院接受手術(shù)治療患者的40 例AEG 組織和距離腫瘤2~5 cm范圍內(nèi)配對正常組織。腫瘤標(biāo)本以及配對的正常組織均取自手術(shù)切除的組織，切緣術(shù)后病理類型全為陰性。40 例患者基本信息見表1。AEG 的診斷與治療均依據(jù)中國學(xué)者普遍認(rèn)可的Siewert分型及治療方法，所有患者均未接受任何其他的術(shù)前治療。本次研究中涉及的所有患者，均已獲得知情同意，且書面知情同意書均已簽署。所有方案均經(jīng)山西省醫(yī)學(xué)科學(xué)院倫理委員會和山西省腫瘤醫(yī)院批準(zhǔn)。

表1 40例患者的基本信息Table 1.Clinical information of 40 patients

1.3 細(xì)胞系 由于AEG 解剖位置以及結(jié)構(gòu)的特殊性，暫時沒有特定的AEG 細(xì)胞系?？紤]到AEG 的病理類型，故選用食管腺癌以及胃癌細(xì)胞系作為替代細(xì)胞完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究選用了以下4 種細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)研究對象：AGS、HGC-27、SK-GT-4 和TE-1。均購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.4 試劑 胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、胰蛋白酶（Trypsin）、RPMI-1640 培養(yǎng)液和BCA 蛋白濃度測定試劑盒購于賽文創(chuàng)新（北京）生物科技有限公司；Trizol 試劑、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（Cell Counting Kit-8，CCK-8）和LipofectamineTM2000 試劑盒購自Invitrogen；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司；PVDF 膜購自Millipore；兔抗CBX4、c-MYC 和細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）多克隆抗體購自上海生工生物工程股份有限公司。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 4 種AEG 細(xì)胞系（AGS、SK-GT-4、HGC-27和TE1）和1種正常人胃黏膜上皮細(xì)胞（GES-1）均用含有10% FBS 和1%青霉素和鏈霉素雙抗的RPMI-1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2、濕度97%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。每2~3 d 更換1 次新鮮培養(yǎng)基。待細(xì)胞融合至80%~90%時，以胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將AGS和SK-GT-4細(xì)胞接種于6孔板上培養(yǎng)，每孔1×105個細(xì)胞。待細(xì)胞密度培養(yǎng)到50%~70%后更換成不含F(xiàn)BS 的RPMI-1640 培養(yǎng)基。根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑的產(chǎn)品說明書，使用Lipofectamine 2000分別將CBX4 siRNA （si-CBX4）或亂序無意義陰性對照（negative control siRNA， si-NC）轉(zhuǎn)染在6 孔板上培養(yǎng)的AGS 和SK-GT-4 細(xì)胞中。si-CBX4 和si-NC購自上海吉瑪生物有限公司，序列見表2。轉(zhuǎn)染6 h后，更換成含有FBS的培養(yǎng)基。

表2 siRNA序列和RT-qPCR引物序列Table 2.Sequences of siRNA and primers for RT-qPCR

2.3 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction， RT-qPCR） 根據(jù)提取RNA 試劑盒的說明書，用提取細(xì)胞RNA 試劑盒提取細(xì)胞的總RNA，同時使用Trizol 試劑從AEG 組織樣品中分離出RNA。使用微量核酸儀檢測RNA的純度和濃度。使用 Prime-Script? 一步式RT-qPCR試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后以cDNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)設(shè)定為95 ℃ 10 min；然后95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s，重復(fù)45 個循環(huán)。GAPDH是內(nèi)參照。GAPDH和CBX4引物序列見表2。

2.4 劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 將經(jīng)敲減處理過AGS 和SKGT-4 的si-NC 組和si-CBX4 組的細(xì)胞以5×105的細(xì)胞濃度均勻接種在 6 孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)至小孔長滿。使用無菌移液槍槍頭的尖端在每個孔中進(jìn)行劃痕處理。然后用PBS 進(jìn)行洗滌以清除細(xì)胞碎片，然后在不含 FBS 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在劃痕0、24 h 時，在每孔的相同位置拍攝記錄細(xì)胞的遷移狀態(tài)。

2.5 CCK-8實(shí)驗(yàn) 將AGS和SK-GT-4細(xì)胞經(jīng)敲減處理后，每孔吸取100 μL 的經(jīng)敲減處理過的AGS 和SK-GT-4 細(xì)胞分別接種于96 孔板，調(diào)整細(xì)胞濃度到每孔2×103個細(xì)胞，每組設(shè)置3 個復(fù)孔。用同樣的方法鋪5 板96 孔培養(yǎng)板。取其中一板，在鋪板后孵育約4 h，待細(xì)胞完全貼壁，向每個孔中加入 10 μL 的CCK-8 工作液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育2~4 h。然后應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測每個孔在450 nm 處的吸光度（A）值。其余4 板在連續(xù)4 d 的相同時間段每孔加入10 μL 的CCK-8 工作液以及測量A值，連續(xù)觀察5 d AGS 和SK-GT-4細(xì)胞的si-NC組和si-CBX4組的細(xì)胞活力。

2.6 Transwell 實(shí)驗(yàn) 用不含血清的培養(yǎng)基重懸經(jīng)敲減處理過細(xì)胞，采用特制的Matrigel Invasion Chamber，在上室加入200 μL 細(xì)胞懸液（無血清），在下室加入 600 μL 含10% FBS 的培養(yǎng)基。放入恒溫孵箱中孵育48 h后，拿出培養(yǎng)板，用鑷子小心取出細(xì)胞小室，吸干上室內(nèi)的液體，移到預(yù)先加入約600 μL的4%的多聚甲醛的孔中，室溫固定30 min 后用0.1%~0.2%結(jié)晶紫染色5~10 min，觀察計(jì)數(shù)。

2.7 Western blot 將RIPA 裂解液與蛋白酶抑制劑按照100∶1 的比例配置。經(jīng)干擾處理過的si-NC 組和si-CBX4組的細(xì)胞，用裂解液（含有蛋白酶抑制劑）從細(xì)胞中分離總蛋白30 min，隨后在13 000 ×g下離心10 min后以收集蛋白質(zhì)的上清液。使用BCA試劑盒測蛋白濃度后，各管蛋白用裂解液和loading buffer定量后金屬浴變性10 min。每孔20 μg 蛋白上樣，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離等量的蛋白質(zhì)。電泳結(jié)束后，然后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用5%脫脂牛奶（TBST配制）封閉 2 h后，分別加入CBX4、c-MYC、cyclin D1、β-catenin、和β-actinⅠ抗，4 ℃孵育過夜。用TBST 洗膜3 次后，加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的Ⅱ抗，在室溫下?lián)u床孵育 2 h。最后，加入電化學(xué)發(fā)光檢測試劑，避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。以β-actin 為內(nèi)參照，并使用ImageJ軟件分析目的條帶的灰度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，兩組均數(shù)比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較使用單因素方差分析。采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，生存分析采用log-rank 檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 AEG 組織高通量測序得出CBX4 可能與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)

對22 對山西腫瘤醫(yī)院的AEG 患者組織進(jìn)行高通量測序，對測序所得到的40 523 個RNA 轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)進(jìn)行“基因權(quán)重共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析”，并將這22 例AEG 組織的臨床樣本的血清學(xué)的腫瘤標(biāo)志物和WGCNA 分析所獲得的modules 分別做相關(guān)性分析，分析結(jié)果表示研究目標(biāo)將鎖定在Blue module 和Brown module 兩個基因群。對Blue module 和Brown module 這兩個基因群進(jìn)行功能富集分析，分析發(fā)現(xiàn)在Blue module 和Brown module 中排名前五的幾種基因可能是這兩個基因群組的核心基因（表3），選用Brown module 中前三個基因在AEG 組織中進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)與臨近正常組織相比，TRIM28 和SLC3A2 在AEG 組織中表達(dá)無明顯差異，而CBX4 在AEG 中表達(dá)增高。因而選用CBX4 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，加以驗(yàn)證分析。

表3 Blue module（TOP1）和Brown module （TOP5）中的核心基因Table 3.core genes in Blue module （TOP1） and Brown module （TOP5）

2 CBX4在食管胃結(jié)合部腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)

2.1 RT-qPCR 檢測CBX4在食管胃結(jié)合部腺癌組織中的表達(dá) 為了確定CBX4 在AEG 發(fā)生中的作用，通過提取山西省腫瘤醫(yī)院的40 對AEG 組織和匹配的相鄰正常組織的樣本RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 后，使用RT-qPCR 檢測CBX4 在食管胃結(jié)合部腺癌組織中的表達(dá)情況。與臨近正常組織相比，AEG 組織中CBX4 的表達(dá)量顯著上調(diào)（P<0.01）。使用GraphPad Prism 8.0 對患者手術(shù)后生存時間與CBX4 表達(dá)量的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，當(dāng)CBX4表達(dá)量高時，患者預(yù)后生存時間較短，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。

Figure 1.The expression of CBX4 in 40 pairs of AEG tissues and matched adjacent normal tissues was detected by RT-qPCR （A），and then the survival rate was analyzed （B）.Mean±SD.n=40.**P<0.01 vs normal.圖1 CBX4表達(dá)量及生存率分析

2.2 檢測CBX4 在食管胃結(jié)合部腺癌細(xì)胞中的表達(dá) 利用RT-qPCR 和Western blot 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測AEG細(xì)胞系中CBX4的表達(dá)情況。結(jié)果表明，相較于正常胃上皮細(xì)胞GES-1， CBX4在AEG細(xì)胞系中均呈高表達(dá)。數(shù)據(jù)表明，CBX4 表達(dá)的增高可能有助于AEG的發(fā)展。見圖2。

Figure 2.Expression of CBX4 in GES-1， AGS， HGC-27， SK-GT-4 and TE-1 cell lines.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs GES-1.圖2 CBX4在GES-1、AGS、HGC-27、SK-GT-4和TE-1細(xì)胞系中的表達(dá)情況

3 沉默CBX4 對食管胃結(jié)合部腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力的影響

3.1 siRNA 敲低CBX4表達(dá)的效率 與對照組si-NC 相比，經(jīng)過si-CBX4 敲減處理后的AGS 和SK-GT-4細(xì)胞中CBX4的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)（P<0.05），證實(shí)CBX4 敲減有效果。其中在AGS 和SK-GT-4 中，si-CBX4-1 的敲減效率最好，選擇其對細(xì)胞進(jìn)行敲減處理完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖3。

Figure 3.Verifying the knockdown efficiency of CBX4 siRNA using RT-qPCR （A） and Western blot （B）.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs si-NC.圖3 RT-qPCR和Western blot驗(yàn)證CBX4 siRNA的敲減效率

3.2 沉默CBX4對食管胃結(jié)合部腺癌細(xì)胞活力的影響 將用si-CBX4-1 處理過的AGS 和SK-GT-4 細(xì)胞鋪進(jìn)96 孔板中，利用CCK-8 實(shí)驗(yàn)測量細(xì)胞的活力。結(jié)果表明，與si-NC 組相比，當(dāng)CBX4 的表達(dá)量降低后，AGS和SK-GT-4細(xì)胞的活力明顯下降，見圖4。

Figure 4.Effects of CBX4 silencing on the viability of AGS and SK-GT-4 cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05， **P<0.01 vs si-NC.圖4 沉默CBX4對AGS和SK-GT-4細(xì)胞活力的影響

3.3 沉默CBX4對食管胃結(jié)合部腺癌細(xì)胞遷移功能的影響 待6 孔板中的AGS 和SK-GT-4 長到70%~80%左右時，對 AGS 和SK-GT-4 細(xì)胞進(jìn)行敲減處理，通過劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測沉默CBX4對AGS 和SK-GT-4 細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)CBX4基因表達(dá)量下降后，AGS 細(xì)胞和SK-GT-4 細(xì)胞的遷移能力明顯下降，見圖5。

Figure 5.Effects of CBX4 silencing on the migration of AGS and SK-GT-4 cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs si-NC.圖5 沉默CBX4對AGS和SK-GT-4細(xì)胞遷移能力的影響

3.4 沉默CBX4對食管胃結(jié)合部腺癌細(xì)胞侵襲功能的影響 通過Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測沉默CBX4對AGS 細(xì)胞和SK-GT-4 細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果表明，當(dāng)CBX4敲低后，AGS 細(xì)胞和SK-GT-4 細(xì)胞侵襲能力明顯下降，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖6。

Figure 6.Effect of CBX4 silencing on the invasive ability of AGS and SK-GT-4 cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05， **P<0.01 vs si-NC.圖6 沉默CBX4對AGS和SK-GT-4細(xì)胞侵襲能力的影響

4 沉默CBX4 對Wnt/β-catenin 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

通過在線數(shù)據(jù)庫GEPIA2 在線分析CBX4 與c-MYC存在正相關(guān)（P<0.05），如圖7A所示。而c-MYC是Wnt/β-catenin 信號通路的重要分子，在多種腫瘤中 起 作 用［19］。因 而 探 究CBX4 是 否 通 過Wnt/β-catenin 信號通路來調(diào)節(jié)AEG。利用Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測沉默CBX4是否與Wnt/β-catenin 通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)量相關(guān)。結(jié)果表明當(dāng)CBX4基因敲低后，在AGS 和SK-GT-4 細(xì)胞中CBX4 的表達(dá)下降，β-catenin 以及下游靶基因c-MYC、cyclin D1 的蛋白表達(dá)水平明顯下降，見圖7。

Figure 7.The effect of CBX4 knockdown on the expression of Wnt/β-catenin signal pathway-related proteins.Mean±SD.n=3.*P<0.05， **P<0.01 vs si-NC.圖7 沉默CBX4后Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的變化

討 論

AEG 作為一種多因素導(dǎo)致的疾病，具體病因尚不明確［20］，可能與遺傳因素、環(huán)境因素、胃食管反流病、肥胖等多種因素有關(guān)［21］。但與其他部位的胃癌相比，食管胃交界處的腫瘤更容易出現(xiàn)胃壁深部浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)［22］。因此將食管胃結(jié)合部腺癌作為一種獨(dú)立的疾病進(jìn)行研究［23］。目前基因靶向治療已經(jīng)逐漸成為很多疾病的治療方向，而導(dǎo)致AEG 發(fā)展的確切機(jī)制仍不清楚，針對AEG 的靶向治療仍未取得很好的進(jìn)展。因此，研究新的治療靶點(diǎn)對于為AEG提供新的治療方向至關(guān)重要。

CBX4 是一種參與腫瘤發(fā)生和細(xì)胞周期調(diào)控的特異性PCG 蛋白［22］，其在不同類型的腫瘤中表達(dá)有所不同，并具有不同的生物學(xué)功能。CBX4在腫瘤中的作用首次在肝細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)，Wang 等［13］研究發(fā)現(xiàn)：CBX4 在肝細(xì)胞肝癌中表達(dá)增高； Jiang 等［14］研究發(fā)現(xiàn)在腎透明細(xì)胞癌中CBX4 表達(dá)顯著增加；但是Xiong 等［24］研究發(fā)現(xiàn)在慢性粒細(xì)胞白血病中，發(fā)現(xiàn)CBX4表達(dá)量在患者外周血白細(xì)胞表達(dá)低于正常人。盡管如此，關(guān)于CBX4 在AEG 中的表達(dá)至今未有報道。在本研究中，通過對22 對AEG 組織進(jìn)行高通量測序的結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CBX4 可能是促進(jìn)AEG發(fā)展的核心分子，因而后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，利用RT-qPCR對40 對AEG 組織以及配對的正常組織進(jìn)行CBX4 表達(dá)量的檢測，結(jié)果表明，CBX4 在40 對AEG 組織中表達(dá)明顯高于正常組織。說明CBX4 在AEG 中可能起促進(jìn)發(fā)展的作用。

HU 等［10］研究提示與正常肺組織相比，CBX4 在肺腫瘤中高度表達(dá)。且CBX4表達(dá)高時，腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力顯著增強(qiáng)；相反，表達(dá)量下降時，人肺癌細(xì)胞生長和遷移明顯受到抑制。因而本研究進(jìn)一步檢測正常細(xì)胞與AEG 細(xì)胞系中CBX4 的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)CBX4 在AEG 細(xì)胞系中表達(dá)均增高，且在檢測的幾種腫瘤細(xì)胞中，AGS 細(xì)胞和SK-GT-4 細(xì)胞中CBX4的表達(dá)量增高更為明顯，因而選用這兩種細(xì)胞完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。利用CCK-8 實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測CBX4 的表達(dá)量與AEG 細(xì)胞增殖、遷移以及侵襲能力的關(guān)系，結(jié)果表明當(dāng)CBX4敲低時，AEG細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力顯著減弱。

Wnt/β-catenin 信號通路是一種復(fù)雜的分子機(jī)制，它由一系列蛋白質(zhì)組成［25］，具有高度的保守性和嚴(yán)格的控制性，能夠調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖和分化過程［26］，并且在某些情況下會引起異常激活。其異常激活會導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，加速細(xì)胞的分化和遷移［27］，因而經(jīng)常與發(fā)病率的提高、疾病進(jìn)一步惡化、預(yù)后不良，甚至包括腫瘤相關(guān)死亡率上升等因素密切相關(guān)［28］。β-catenin 是Wnt/β-catenin 通路的重要調(diào)控因子［29］，當(dāng)該信號通路被激活時抑制β-catenin 降解，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)β-catenin 大量聚集，進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，誘導(dǎo)下游靶基因c-MYC和cyclin D1的轉(zhuǎn)錄［30］。利用GEPIA2 數(shù)據(jù)庫在線分析可得CBX4 與c-MYC正相關(guān)，而c-MYC 又是Wnt/β-catenin 信號通路重要分子。進(jìn)而，我們推測在AEG 中，對于Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控，CBX4 可能參與其中。因而，通過Western blot 法檢測CBX4沉默后，β-catenin、 c-MYC和cyclin D1 表達(dá)水平是否發(fā)生變化。結(jié)果表明，當(dāng)CBX4 表達(dá)下降時，在AGS 細(xì)胞和SK-GT-4 細(xì)胞中β-catenin、c-MYC和cyclin D1的表達(dá)水平均有所下降，進(jìn)而提示在AEG 中CBX4 能夠活化Wnt/β-catenin 信號通路促進(jìn)惡行表型。

綜上所述，CBX4 在AEG 細(xì)胞系中以及在AEG組織中表達(dá)升高，當(dāng)CBX4 表達(dá)下降時，AEG 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力顯著減弱，并且CBX4 可能是通過Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)AEG細(xì)胞的惡行表型。此研究結(jié)果表明，沉默CBX4可能對AEG 的發(fā)生發(fā)展具有抑制作用，為AEG 患者的靶向治療以及早期診斷提供新的參考點(diǎn)。