任舒凡， 林欣儀， 張婉玲， 王 通

（暨南大學生命科學技術學院，暨南大學附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510632）

新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease-2019，COVID-19）是一種由新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2， SARS-CoV-2）引發(fā)的傳染?。?］，其典型癥狀包括發(fā)燒、干咳、乏力、氣促和肺炎等［2］。COVID-19患者體內往往會出現過度分泌促炎細胞因子的現象，即細胞因子風暴（cytokine storm）［3］。細胞因子風暴可在COVID-19 患者中誘發(fā)多種器官損傷［4］。研究表明有14%~78%的COVID-19患者可出現肝損傷，表現為天冬氨酸轉氨酶、谷丙轉氨酶、堿性磷酸酶和γ-谷氨酰轉移酶水平顯著升高，及血漿白蛋白降低［5-6］。肝細胞已被證實是SARSCoV-2的靶細胞［7］，且多有COVID-19死亡病例表現為肝組織纖維化、輕度炎癥浸潤和線粒體腫脹等［8-9］。但是，SARS-CoV-2引起肝損傷的機制尚不清楚。

作為抗病毒免疫的關鍵細胞因子，I 型干擾素（type I interferon， IFN-I）在已被發(fā)現多數COVD-19患者中顯著上調［10］。其中，IFN-α可誘導肝細胞發(fā)生以ISG （IFN-stimulated gene）化（ISGylation）為代表的抗病毒免疫應答［11］，SARS-CoV-2 所編碼的木瓜蛋白酶樣蛋白酶（papain-like protease， PLpro）已被證明具有去ISG 化（deISGylation）活性，提示SARS-CoV-2 通過PLpro蛋白抵御機體的抗病毒免疫應答［12］。

綜合上述研究進展，SARS-CoV-2 PLpro（簡稱PLpro）有可能對IFN-α 應答的肝細胞發(fā)揮作用。因此，本研究構建了穩(wěn)定表達PLpro 的單克隆Huh7 肝細胞株，并建立了IFN-α 應答狀態(tài)下的Huh7 肝細胞模型，同時結合功能蛋白質分析和生物學驗證以解析上述科學問題。

材 料 和 方 法

1 主要細胞

Huh7 為人肝癌細胞系，購買于中國典型培養(yǎng)物保藏中心；293T為人腎上皮細胞系，購買于美國細胞培養(yǎng)物收藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），實驗所使用的細胞系經過支原體檢測，均為支原體陰性。

2 主要試劑

胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）購自Biological Industries；苯甲磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride， PMSF）購自Sigma-Aldrich；DMEM 培養(yǎng)液、青霉素/鏈霉素溶液、丙酮酸鈉溶液、胰蛋白酶-EDTA（0.25%）和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）購自Gibco；感染試劑Lipofectamine 3000、10%Bis-Tris 預制膠、蛋白質電泳緩沖液、蛋白質轉膜緩沖液和聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜購自Invitrogen；pcDNA3.1-PLpro-3×flag 載體由廣州達弘生物科技有限公司構建；人炎癥相關細胞因子檢測試劑盒（cytometric bead array， CBA）購自BD Biosciences；乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase， LDH）細胞毒性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；兔抗人ISG15 抗體（2743S）、兔抗人α-Tubulin 抗體（2125S）、辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔抗體（7074S）購自Cell Signaling Technology；雞源SARS-CoV-1 PLpro 抗體（AB-0602-0250）購 自LifeSensors；重 組 蛋 白IFN-α2（90105-CNAY-20）、兔 抗 人CA2 抗 體（10478-RP02）和 兔 抗 人SCARB1 抗體（11069-T38）購自北京義翹神州科技股份有限公司；兔抗人IRF9 抗體（14167-1-AP）購自Proteintech；兔抗人CD63 抗體（ab134045）和HRP-山羊抗雞抗體（ab6877）購自Abcam；Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 凋亡檢測試劑盒購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；去內毒素質粒提取試劑盒購自Qiagen；蛋白質酶抑制劑購自Roche；RNA 提取試劑盒和胰蛋白酶（質譜級）購自Promega；C18 除鹽柱購自GL Sciences；所用引物由廣州睿博生物技術有限公司根據設計合成，序列見表1。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

3 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱（SANYO）；超低溫冰箱和細胞操作安全柜（海爾公司）；流式細胞儀（BD Biosciences）；qPCR 儀（Bio-Rad）；蛋白質凝膠電泳/轉印系統(tǒng)和Orbitrap Fusion Lumos質譜儀（Thermo Fisher Scientific）；真空冷凍干燥機（湖南赫西儀器裝備有限公司）。

4 主要方法

4.1 細胞培養(yǎng) Huh7和293T細胞使用完全DMEM培養(yǎng)液（含10% FBS、0.1 g/L 鏈霉素、100 U/mL 青霉素、10 mg/L環(huán)丙沙星和1 mmol/L 丙酮酸鈉）在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

4.2 SARS-CoV-2 PLpro 慢病毒載體構建 載體pcDNA3.1-SARS-CoV-2-PLpro-3×flag 作為模板進行PCR，PCR 產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行切膠回收，得到SARS-CoV-2 PLpro 全長序列。將pLVX-EGFPPuro 質粒EcoRI 和BamHI 雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收。使用T4 DNA 連接酶將兩端含有酶切位點黏端的PLpro 序列與線性的pLVX-EGFP-Puro載體于16 ℃酶連反應16 h。將連接后的產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞中，隨后挑取單克隆進行菌液培養(yǎng)，測序驗證后使用去內毒素質粒提取試劑盒提取菌液質粒，獲得SARS-CoV-2 PLpro慢病毒載體。

4.3 SARS-CoV-2 PLpro 穩(wěn)定株構建 在293T 細胞轉染實驗前，將完全DMEM 培養(yǎng)液替換成基礎DMEM 培養(yǎng)液，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。在離心管中加入DNA 溶液（pLVX-EGFP-PLpro-Puro 質粒9 μg，pMD2.G 輔助質粒3 μg，pSPAX2 輔助質粒6μg），與800 μL的基礎DMEM 培養(yǎng)液、27 μL的P3000混合均勻。另一離心管中加入27 μL Lipo3000 和800 μL 基礎DMEM 培養(yǎng)液，室溫下孵育5 min。將兩管混合成一管后在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育20 min。將轉染液加進細胞液于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)6 h 后更換DMEM 培養(yǎng)液（含10% FBS、1 mmol/L 丙酮酸鈉），于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細胞病毒上清，于230×g離心3 min，0.45 μm 濾器過濾上清液收集于50 mL 離心管中。加入7.8 mL 40% PEG 8000 和3.4 mL 3 mmol/L Na-Cl，于4 ℃保存。24 h 后4 ℃ 、3 200×g離心30 min，去上清后加入1 mL 完全DMEM 培養(yǎng)液重懸病毒沉淀，分裝后于-80 ℃冰箱長期保存。Huh7 細胞感染前24 h，以每孔4×105細胞個數的密度鋪于6孔板中，并在細胞密度約為30%時感染慢病毒。感染48 h后用嘌呤霉素連續(xù)作用7 d，獲得具有過表達SARSCoV-2 PLpro 的Huh7 細胞（PLpro 細胞）和NC 細胞，并進行單克隆擴增。

4.4 建立處于IFN-α 應答狀態(tài)的肝細胞模型 將NC 細胞或PLpro 細胞以每孔4×105的密度接種于6孔板中，加入完全DMEM 培養(yǎng)液，并于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。24 h 后加入3 ng/L 的IFN-α，并繼續(xù)培養(yǎng)24 h，該作用濃度模擬COVID-19 患者體內的IFN-α水平［13］。

4.5 RT-qPCR 按照Promega RNA 提取試劑盒的說明書提取總細胞RNA，用Ⅰ型DNA 酶去除DNA 后將RNA 逆轉錄為cDNA。八聯(lián)管加入cDNA、SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix 和前后引物后進行qPCR。

4.6 Western blot 參照本團隊以往的報道［14-15］，細胞蛋白質以裂解液（含1%的SDS 和1 mmol/L PMSF；加入蛋白酶抑制劑）進行裂解后進行超聲處理。于4 ℃ 、12 000×g離心30 min，取上清。取20 μg 蛋白質在10% Bis-Tris 預制膠中進行Western blot，使用5%脫脂牛奶封閉PVDF 膜1 h。加入ISG15 抗體（1∶1 000）、α-Tubulin 抗體（1∶2 000）、SARS-CoV-1 PLpro抗體（1∶2 500）、CA2 抗體（1∶1 000）和SCARB1 抗體（1∶1 000）、IRF9 抗體（1∶1 000）和CD63 抗體（1∶1 000），于4 ℃垂直搖床過夜孵育。第2 天加入HRP標記的兔/雞Ⅱ抗（1∶2 000），室溫孵育1 h 后在顯影儀拍攝保存實驗結果。

4.7 蛋白質酶解除鹽 該步驟參考本團隊以往報道的方法［14-15］。簡要為，取150 μg 蛋白進行酶解除鹽，經還原、烷基化，于超濾管中進行14 h酶解，收集肽段并利用C18脫鹽柱頭除鹽。

4.8 質譜分析

4.8.1 數據依賴采集質譜（data-dependent acquisition mass spectrometry， DDA-MS）建庫 將6 個樣品的肽段干粉于4 ℃、16 500×g離心5 min 后加入20μL 0.1%（體積比）甲酸重溶，取2 μL 肽段進行肽段濃度檢測，其余肽段于4 ℃、16 500×g離心，離心時間大于30 min。準備DDA 上樣肽段：每個樣品取3 μg，共18 μg，根據肽段的總體積，加入3.5 μL iRT 以及補相應的0.1%甲酸至總體積為25 μL，使用Thermo Orbitrap Fusion Lumos 質譜儀進行DDA-MS 分析。每次取3 μg 混合肽段進行DDA-MS 分析，一共取4 次，每次進行120 min的質譜分析。

4.8.2 數據非依賴采集質譜（data-independent acquisition mass spectrometry， DIA-MS）分 析 準 備DIA 上樣肽段樣品：6 個樣品各取9 μL 并加入1 μL iRT，根據各自的肽段濃度各取3 μg 相應的肽段體積，使用Thermo Orbitrap Fusion Lumos 質譜儀進行DIA-MS分析，每個樣品進行120 min的質譜分析。

4.8.3 蛋白的鑒定和定量 使用Spectronaut 14.10軟件對DDA 質譜數據搜庫及DDA 庫建立。完成DDA 建庫后，進入Analysis 面版，點擊“Set up a DIA Analysis…”，導入6 個DIA 的.raw 文件和.fasta 文件，并選擇上述構建完成的DDA 庫，設置參數后點擊“finish”開始對DIA樣品進行鑒定定量分析。

4.9 生物信息學分析

4.9.1 差異蛋白質的計算 以表達差異倍數（fold change）>1.5 倍且P<0.01 為篩選標準進行差異表達蛋白（differentially expressed proteins， DEPs）的篩選。

4.9.2 主成分分析（principal component analysis，PCA） 在R studio 4.1.2中進行PCA析。

4.9.3 聚類分析 使用MATLAB R2020b 軟件中“clustergram”命令對DEPs 進行層次聚類分析，首先對樣品定量值進行l(wèi)og10 對數轉換并標準化轉換，組內距離量度方法（linkage）為離差平方和法（ward）運行命令。

4.9.4 ingenuity pathway analysis （IPA） 參考本課題組已報道的方法使用IPA 中的核心分析模塊進行上游調控因子（upstream regulator analysis）和通路分析［15］。

4.10 cytometric bead array analysis （CBA） 參考本團隊以往的報道［16］，使用CBA 試劑盒對細胞培養(yǎng)上清的細胞因子進行測定，流式細胞數據使用FCAP軟件（3.0.1版本）分析。

4.11 LDH 毒性檢測 根據LDH 細胞毒性檢測試劑盒說明書進行實驗。收集細胞上清，將細胞上清于400×g離心5 min，去除細胞沉淀。配制工作液：等體積的乳酸、LDH 和1×INT。將120 μL 細胞上清加進96 孔板中，每孔加入60 μL 工作液。將樣品在室溫下避光孵育30 min，并在490 nm 和630 nm 處測量吸光度（A）值。

4.12 Annexin V-Alexa Fluor 647/PI細胞凋亡檢測細胞經PBS 洗滌后用不含EDTA 的胰酶消化，300×g離心5 min 后收集細胞。用預冷的PBS 洗滌細胞2次，每次300×g離心5 min，棄上清。加入100 μL 1×結合緩沖液重懸細胞，加入5 μL Annexin V-Alexa Fluor 647 和10 μL PI 染料，輕輕混勻后避光室溫反應15 min。加入400 μL 1×結合緩沖液，混勻后放置于冰上，用流式細胞儀檢測。

5 統(tǒng)計學處理

使用GraphPad Prism 8 軟件或R studio（版本4.1.2）進行統(tǒng)計分析。當數據服從正態(tài)分布和方差齊性時，使用非配對Student'st檢驗；當數據服從正態(tài)分布但不服從方差齊性時，使用非配對Student'st'檢驗；兩者都不滿足時，使用Kolmogorov-Smirnov 檢驗。P<0.05 被認為具有統(tǒng)計學意義。條形圖中顯示的所有數據均為均數±標準誤（mean±SEM）。

結 果

1 SARS-CoV-2 PLpro具去ISG化活性

本研究共構建了3 株可持續(xù)表達PLpro 蛋白的單克隆細胞（PLpro1、PLpro2 和PLpro3）和一株僅穩(wěn)轉pLVX-EGFP-Puro 的單克隆細胞（NC），見圖1A。兩組細胞經IFN-α 處理后，NC 組出現了典型的ISG化蛋白條帶，而3 株PLpro 單克隆細胞的ISG 化蛋白條的灰度均較NC 組弱，見圖1B?；叶戎档慕y(tǒng)計分析表明，PLpro組的ISG化蛋白的灰度值顯著低于NC組（P<0.01），見圖1C。上述結果表明PLpro 穩(wěn)定表達細胞株可表達具ISG 化活性的PLpro，提示細胞模型構建成功。

Figure 1.Characterization of monoclonal cells expressing SARS-CoV-2 PLpro.A： the expression of SARS-CoV-2 PLpro detected by Western blot； B and C ： verification of PLpro deISGylation activity.Mean±SEM.n=3.*P<0.05， **P<0.01 vs NC group.圖1 穩(wěn)定表達SARS-CoV-2 PLpro蛋白的Huh7單克隆細胞株的表征

2 差異蛋白質組分析

分別以IFN-α 作用于NC 和PLpro 細胞后，本研究開展了DIA-MS 分析。結果表明，三次獨立生物學重復中，NC 細胞組可定量的蛋白質數目分別為5 877、5 863 和5 855 個，其中交集數為5 767 個，占總數的97%；三次獨立生物學重復中，PLpro 細胞組可定量的蛋白質數目分別為5 811、5 847 和5 806 個，其中交集數為5 671 個，占總數的95.6%；所有實驗組可定量交集蛋白數為5 619 個（圖2A）。以上述5 619 個交集定量蛋白質進行PCA 分析，結果表明，PLpro組和NC組在PC1維度能被區(qū)分（圖2B）。統(tǒng)計分析共獲得149個DEPs，與NC組相比，PLpro組中有100 個上調DEPs 和49 個下調DEPs（圖2C）。利用這些DEPs 進行層次聚類分析結果顯示，NC 組和PLpro組可被區(qū)分，表明這些DEPs 具實驗組特異性（圖2D）。

Figure 2.DEPs differentiated the PLpro groups from the NC group.A： Venn diagram of quantified proteins in the NC and the PLpro groups； B： principal component analysis； C： volcano plot depicting the DEPs， significantly up- and down- regulated DEPs in the PLpro groups are shown in red and blue， respectively； D： hierarchical clustering analysis with DEPs.圖2 差異蛋白質可有效區(qū)分PLpro和NC組

3 PLpro 可在對IFN-α 應答狀態(tài)的Huh7 肝細胞中獨立激活細胞因子風暴效應蛋白

以上述149 個DEPs 開展的IPA 上游分析（upstream analysis）結果表明，有35個上游調控蛋白（upstream regulator）被顯著激活（z-score>1.96），12 個上游調控蛋白被顯著抑制（z-score<-1.96）。其中IL-6、IFNG、OSM、IL-13、TNF、CD40LG 和IL-1β 是顯著被激活的上游細胞因子（圖3A）。

為了驗證IPA 和質譜分析結果，本研究對IPA 預測的上游因子的4 個下游DEPs 進行了IB 驗證，這些DEPs 分別為CA2、SCARB1、CD63 和IRF9（圖3B）。經三次獨立生物學重復和灰度分析，結果顯示PLpro可在IFN-α 應答的Huh7 細胞中顯著上調IRF9（P<0.05）和SCARB1蛋白（P< 0.01），該變化趨勢與質譜分析定量結果一致（圖3C~3F）。

本研究進而檢測了細胞培養(yǎng)上清中的IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12 p70 和TNF 共6 種炎癥因子的豐度。結果表明，在NC 組和PLpro 組分泌的上清中，IL-6、TNF、IL10、IL-12 p70 和IL-1β 的濃度均低于檢出限，僅可檢測出IL-8。經細胞數量歸一化后，兩組間的IL-8 濃度無顯著差異（圖4A）。以上結果表明，在對IFN-α應答的Huh7肝細胞中，PLpro不會直接上調上述6種炎癥因子的分泌。

本研究進一步使用RT-qPCR 技術對其中的IL-1β、TNF和IL-6三種促炎細胞因子的mRNA 表達量進行了分析。結果表明，IL-1β和IL-6mRNA 的表達量在PLpro 組和NC 組間均無顯著差異（P>0.05，圖4B、4C），而PLpro 組的TNFmRNA 的表達量顯著低于NC 組（圖4D，P<0.05）。由此可見肝細胞在IFN-α應答狀態(tài)下，PLpro 未促進其上述促炎因子的mRNA表達。

4 PLpro 誘導處于IFN-α 應答狀態(tài)的Huh7 細胞的壞死性細胞死亡

流式細胞術分析表明，無論是NC 組還是PLpro組，對IFN-α 應答的Huh7 肝細胞的死亡形式主要以壞死為主，這些壞死細胞表現為Annexin V 和PI雙陽性（圖5A）。從統(tǒng)計分析結果可知，PLpro 組的細胞壞死水平顯著高于NC 組（P<0.01，圖5B）。在培養(yǎng)上清中，PLpro 組的LDH 水平顯著高于NC 組（P<0.01，圖5C）。

Figure 5.Cell death analysis of the IFN-α-responsive Huh7 cells in PLpro and NC groups.A and B： flow cytometric analysis of cell necrosis； C： LDH cytotoxicity assay.Mean±SEM.n=3.*P<0.05， **P<0.01 vs NC group.圖5 PLpro誘導IFN-α應答性Huh-7細胞的細胞死亡分析

討 論

SARS-CoV-2 是一種RNA 病毒，其主要攜帶4 種結構蛋白質和16種非結構蛋白質（non-structural protein， NSP）［17］。SARS-CoV-2 入侵機體，會激活細胞中IFN-Ⅰ［10，18］。IFN-I 與受體結合，可通過信號級聯(lián)最終誘導IFN 刺激基因（interferon stimulated gene，ISG）轉錄，其中ISG15是IFN-I的主要下游基因之一，它可通過泛素激活酶（E1）、泛素結合酶（E2）和泛素連接酶（E3）的序貫作用與靶蛋白質結合，完成蛋白質的ISG 化，從而發(fā)揮包括抗病毒等在內的多種生物學效應［19］。PLpro 是非結構蛋白NSP3 最大的結構域［20］，具去ISG 化修飾活性，可干擾IFN-Ⅰ介導的ISG化，削弱IFN-Ⅰ的抗病毒功能［12］。

本研究從處于IFN-α應答狀態(tài)的Huh7肝細胞研究模型入手，以蛋白質組學技術分析了PLpro蛋白對肝細胞的系統(tǒng)影響。結果提示PLpro 不但可圍繞IFN 通路發(fā)揮調控作用，同時可上調包括IL-6、IFNγ、OSM、IL-13、TNF、CD40LG 和IL-1β 在內的數種細胞因子的下游效應蛋白。上述細胞因子中，除了IL-13外，其余皆為已知參與COVID-19相關細胞因子風暴的促炎細胞因子［21-23］。在一項對中國150 名COVID-19 患者的回顧性研究中，作者分析比較了82 例COVID-19治愈病例和68例COVID-19死亡病例的數據，顯示IL-6 水平在COVID-19 死亡病例中顯著升高［24］。目前，上述細胞因子風暴相關的系統(tǒng)炎癥也被證實與COVID-19患者肝損傷顯著相關［25-27］。

本研究結果提示PLpro 在誘導炎癥因子下游效應蛋白時具獨立性，即PLpro發(fā)揮上述作用時無需誘導上調這些炎癥因子。事實上，這種現象與Tang等［16］的報道具一定的相似性，該研究觀察到IL-1β可在不需要誘導TNF 表達的情況下，獨立在人類滑膜細胞中誘導上調TNF 相關效應蛋白。因此，PLpro 這種獨立誘導過度炎癥應答的能力可能對炎癥因子風暴的效應起到獨立的放大作用。

本研究結果提示PLpro 可誘導處于IFN-α 應答狀態(tài)下的Huh7 細胞發(fā)生細胞壞死。已知過度炎癥反應可導致細胞死亡，而細胞死亡會進一步導致炎癥的加劇，形成了正反饋回路。兩者的相互作用被稱 為“PANoptosis”［28］。Li 等［29］的 研究表 明，SARSCoV-2 可激活caspase-8 蛋白，并誘發(fā)肺上皮細胞的細胞凋亡和炎癥細胞因子上調。Li 等［30］的研究表明，SARS-CoV-2 的Spike 蛋白可通過上調細胞內活性氧水平并抑制PI3K/AKT/mTOR 通路，進而誘發(fā)細胞的炎癥反應和凋亡。Gholizadeh 等［31］的研究表明，在COVID-19患者中，肝酶水平異常的患者LDH水平顯著高于肝酶水平正常患者。這與本研究結果中PLpro組細胞上清中LDH顯著上調有一定的可比性。

SARS-CoV-2 PLpro 蛋白已被認為是潛在COVID-19 藥物靶點，其中YM155、隱丹參酮和GRL0617等均顯示出對該蛋白的抑制作用［32］。例如，Shin等［12］的研究表明，GRL0617可通過抑制PLpro蛋白酶活性從而破壞病毒誘導的細胞病理效應，維持IFN通路的活化，減少病毒在感染細胞中的復制。

綜上，本研究結合了功能蛋白質組學策略和生物學驗證的體外實驗，結果提示在對IFN-α 應答的Huh7 肝細胞中，PLpro 蛋白可獨立促進Huh7 肝細胞的炎癥因子的下游效應蛋白的表達，從而誘導多度的炎癥應答，并誘導Huh7肝細胞壞死性細胞死亡。