邱智軍,原江鋒,龔明貴

河南科技大學食品與生物工程學院 河南省食品微生物工程技術研究中心,洛陽 471023

連翹是一種傳統(tǒng)大宗藥材,是指植物連翹(Forsythiasuspensa)[1]的干果。連翹常用于中醫(yī)治療,具有抗菌、抗炎、抗癌等藥理功效[2-4]。根據(jù)果實的成熟度和采收時間,連翹可分為青翹(green Forsythiae Fructus,GF)和老翹(ripe Forsythiae Fructus,RF)。根據(jù)氣候條件,GF通常在7月下旬至9月上旬收獲,此時果實幾乎成熟,但仍呈綠色,大多數(shù)GF果實尚未有裂痕。RF通常在10月收獲,此時果實完全成熟,呈黃色且開裂。參考《中華人民共和國藥典》2020版[5],GF和RF在應用中都被稱為連翹。

連翹在中國分布十分廣泛。根據(jù)連翹資源的歷史獲取情況,山西、河南和陜西三省分別占總供應量的40%、30%和20%,連翹的資源也分布在安徽和湖北省[6]。連翹多為野生資源,當?shù)厝藭诤侠淼臅r間段(7月下旬至9月上旬)采摘連翹為搶青,這一現(xiàn)象導致市面上的GF數(shù)量要高于RF。近些年來,連翹精油受到了相當大的關注[7],Jiao等[8]在連翹中發(fā)現(xiàn)了21種精油化合物,精油表現(xiàn)出相對良好的抗菌活性。烯烴、醇和酯是連翹精油中發(fā)揮藥理作用的主要成分[9,10]。但是,關于連翹生長環(huán)境和采收時間差異的影響,尚未對主產(chǎn)區(qū)的連翹精油進行定量系統(tǒng)評價,利用GC-MS技術對不同地區(qū)的連翹精油成分進行分析仍值得研究,以促進連翹綜合利用。

本研究從中國五個省(主要產(chǎn)區(qū))采集了13批連翹,采用GC-MS結合主成分分析(PCA)和聚類分析(CA)對其精油成分進行了分析和質量評價。其中,基于PCA的質量評價模型用于不同批次連翹的綜合質量評估[11],CA則用于不同批次連翹的無監(jiān)督分類分析[12]。

1 材料與方法

1.1 植物材料

2018年,共從五個省份采集了13批次連翹(S1～S13),包括9批次GF和4批次RF(見表1)。經(jīng)河南科技大學園藝與植物保護學院張巧明副教授鑒定為木犀科植物連翹Forsythiasuspensa的干燥果實。所有材料在室溫下在干燥器中避光保存,使用前用粉碎機(40目)粉碎。

表1 樣品采集信息

1.2 方法

1.2.1 精油提取

參考《中華人民共和國藥典》2020版[5]的揮發(fā)油測定法,連翹精油通過水蒸汽蒸餾方法獲得。將粉碎后的25 g連翹樣品浸泡在300 mL蒸餾水中,使用加熱套加熱至沸,保持微沸5 h,直到精油體積不再增加,結束加熱,獲得黃色精油,4 ℃避光保存?zhèn)溆?。重復三?所得精油的產(chǎn)率以百分比(V/W)表示。

1.2.2 GC-MS分析

使用配備DB-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm;膜厚0.25 μm)的GC/MS-Trace-DSQ系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific,America)分析來自不同地區(qū)的連翹精油。流速為1 mL/min的高純度氦氣作為載氣。吹掃流速為3.0 mL/min。溫度編程如下:從60 ℃(保持2 min)到130 ℃,速率為4 ℃/min,然后從130 ℃到260 ℃(維持20 min),速率為5 ℃/min。進樣體積1 μL(分流比1/50),進樣口溫度250 ℃。MS在220 ℃的界面溫度下以電子轟擊模式(70 eV)運行;離子源溫度為200 ℃,溶劑延遲時間為4 min,質量范圍為40～600 amu,掃描速率為6次/s。通過將其質譜與NIST質譜庫相匹配,確定了精油的化學成分。單個組分的相對面積(relative area,RA)表示為鑒定化合物的百分比。

1.2.3 統(tǒng)計分析

使用SPSS軟件版本25.0進行基于精油化學成分的PCA和CA分析。散點圖由Origin 9.0繪制。

2 結果與討論

2.1 連翹精油產(chǎn)量

來自不同地區(qū)的連翹樣品的精油產(chǎn)量不同。GF精油的產(chǎn)率范圍為1.13%～2.34%,而RF精油的產(chǎn)率在1.42%～1.82%之間(見表2)。其中,S1河南盧氏GF(2.34%)和S13河南盧氏RF(1.82%)的精油產(chǎn)量最高,S9山西太原GF和S11湖北武漢RF(1.13%)的精油產(chǎn)量最低。從藥用植物中提取的精油具有廣泛的藥理應用,如抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗糖尿病和抗衰老功效[13-15]。有報道,來自陜西楊凌的鼠尾草中精油產(chǎn)量在0.91%～1.62%之間[16];紅花中精油的產(chǎn)量為1.60%[17]。與這些藥材相比,連翹樣品的精油產(chǎn)率(1.13%～2.34%)相對較高,值得進一步研究。對于不同地區(qū)的藥用植物,不同的精油產(chǎn)量被認為與環(huán)境條件有關,如降水、溫度、太陽輻射、土壤條件和連翹物種的基因型[18];另一方面,對于同一地區(qū)的GF和RF,精油產(chǎn)量可能在采收期、發(fā)育階段和連翹物種上表現(xiàn)出差異[19]。

表2 連翹樣品精油中的化合物

2.2 連翹精油成分

通過GC-MS鑒定的精油的詳細成分在樣品中表現(xiàn)出顯著的化學多態(tài)性。在所有樣品提取的精油中總共有54種化合物被鑒定識別,占總成分的比例在80.76%至91.08%之間(見表2)。在這些樣品中,烯烴是精油中最豐富的成分,其次是醇類。

隨著尋求自然本源療法的興起,基于精油的芳香療法已在國內廣泛應用。連翹精油被證明能夠通過促進生物活性成分透皮吸收,從而實現(xiàn)緩解外部綜合征的功能[2,20]。同時,連翹精油中的化合物還具有諸多用途,比如:用作化妝品香料(3-蒈烯、α-蒎烯和β-蒎烯);鎮(zhèn)咳和抑菌(檸檬烯)[21];抗炎和退熱(桉葉油醇、綠花白千層醇和香芹酮)[22];抗慢性支氣管炎(香葉醇)[16];香水和除臭劑制備(β-月桂烯)[23];醫(yī)藥和肥皂工業(yè)(α-松油醇)[24];作為合成維生素E和維生素A的原料(芳樟醇和檸檬醛)[25]。從表2可以看出,α-蒎烯和β-蒎烯是連翹精油的主要成分,占比較高,其他的研究在連翹中也觀察到了這種現(xiàn)象[8]。

2.3 主成分分析

對連翹精油中12種常見化合物的主成分分析(PCA)表明,特征值大于1的3個主成分對于總方差的累計貢獻率達到77.24%,所以,這3個主成分(PC1、PC2和PC3)被用于綜合評價樣品的精油成分(見表3)。β-月桂烯、3-蒎烯、α-松油醇、芳樟醇、β-蒎烯和檸檬烯對PC1均有較高的載荷,說明PC1主要反映了這些化合物的信息。另外,綠花白千層醇、α-蒎烷、香芹酮對PC2具有較高的載荷,檸檬醛、香葉醇和桉葉油醇對PC3具有較高的載荷,也可以得出類似的結論?；赑C1和PC2評分的散點圖中連翹樣品被劃分成3個象限組(見圖1),第一象限組包括S13、S12、S2、S11和S10,第三象限組只有一個S8,第四象限組包括S1、S3、S9、S7、S6、S5和S4。其中,第一象限組中樣品主要是RF(除了S2),第四象限組則都是GF。顯然,樣品中的GF和RF是不同的,連翹果實中的精油成分受到了收獲期和發(fā)育程度的很大影響。針對每個樣品,PCA計算得到其三個方差貢獻率最大的主成分,以它們的成分得分為自變量,其相應的方差貢獻率作為權重系數(shù),構建基于線性加權的連翹質量評價函數(shù):H=0.39425*PC1+0.24478*PC2+0.13336*PC3,從而得到它的綜合得分H(見表4)。得分越高,評價質量越好[26]。由表4可知,得分最高三個樣品分別是湖北武漢RF(S11)、陜西洛南RF(S12)和安徽六安RF(S10)。有研究表明[27],在連翹苷、連翹酯苷A、齊墩果酸、熊果酸、蘆丁等諸多活性成分方面,GF要優(yōu)于RF。然而,對于精油成分而言,如上所述,連翹中RF的綜合得分優(yōu)于GF。Feng等[28]在連翹果精油成分的PCA研究中也發(fā)現(xiàn)不同采收時期連翹藥材揮發(fā)油類成分間存在差異。因此,基于精油成分的觀點,可優(yōu)選RF的開發(fā)和利用。

圖1 PCA二維散點圖

表3 PCA組分矩陣

表4 樣品質量評價排序

2.4 聚類分析

聚類分析(CA)是僅基于樣品自身特征,依據(jù)相似性實現(xiàn)樣品聚集的過程[29]。為了研究連翹精油成分與區(qū)域之間的相關性,用歐幾里得距離測量了樣品間的相似度,采用Ward方法對連翹精油中的54種化合物進行了聚類分析。13批樣品按CA分成了4類(見圖2)。第一類由S4和S5組成,都是GF;第二類由S1、S2、S3、S6、S7、S9組成,也都是GF;第三類包含了S10、S11、S12和S13,都屬于RF;S8(山西長治GF)則是一個單獨的類別,即第四類。CA能夠區(qū)分樣品中的GF和RF。除S2河南信陽GF外,CA的結果與PCA基本一致。所以,連翹樣品中的GF和RF通過12種常見化合物和精油中的54種化合物都能夠進行有效區(qū)分。

圖2 連翹樣品聚類分析圖

復雜的環(huán)境因素會影響精油的理化性質[30],PCA和CA分析中,S8山西長治GF作為單獨分類的存在也表明這一點。CA沒有識別出更多明確的區(qū)域特征,其原因可能是收獲期因素對精油理化性質的影響更大。上述結果分析表明,將精油的特征用作連翹收獲期和發(fā)育階段的化學分類標記是可行的。

3 結論

本研究以精油成分為研究對象,系統(tǒng)比較分析了不同產(chǎn)地和采收期連翹果實的精油成分組成和含量,結果表明區(qū)域環(huán)境和采收期兩方面因素共同影響著連翹的精油組成狀況。本研究提供了連翹精油化學成分變化的初步數(shù)據(jù),而連翹精油組成直接決定著其諸多生物活性,因此,為了進一步確定連翹精油組成的變化規(guī)律,從而指導連翹精油資源在醫(yī)療保健和食品工業(yè)領域的開發(fā)利用,還需要進行多年采樣,在規(guī)模更大、采樣條件更準確的樣本上開展廣泛、深入的實驗研究。