周永逸,陳海杰,薛 佳,袁嘉歡,吳 楠,劉訓(xùn)紅,2*,鄒立思,程建明,2

1南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院;2江蘇省經(jīng)典名方工程研究中心,南京 210023

金錢(qián)草系報(bào)春花科植物過(guò)路黃LysimachiachristinaeHance的干燥全草[1],主要產(chǎn)自中國(guó)云川貴等地?，F(xiàn)代研究表明,金錢(qián)草含有黃酮、有機(jī)酸、揮發(fā)油、鞣質(zhì)和氨基酸類(lèi)等化學(xué)成分[2],其主要藥效成分為黃酮類(lèi)和有機(jī)酸類(lèi)成分,有利濕退黃、解毒消腫等功效,臨床上用于治療肝膽結(jié)石、濕熱黃疸等癥[3]。金錢(qián)草作為中醫(yī)臨床配伍常用藥,市場(chǎng)上常出現(xiàn)一些習(xí)用品或混偽品[4]。例如,江浙一帶將連錢(qián)草作為金錢(qián)草習(xí)用,具有利濕通淋、散瘀消腫和清熱解毒等功效[5];另有將小金錢(qián)草作為金錢(qián)草習(xí)用,亦具有清熱解毒、利濕散瘀等作用[6]。這導(dǎo)致金錢(qián)草藥材使用混亂,影響臨床用藥的安全、有效。

目前,關(guān)于金錢(qián)草及其習(xí)用品、混偽品的鑒別,多采用傳統(tǒng)的性狀鑒別、顯微鑒別[7]和薄層色譜(TLC)鑒別[8]。此外,還應(yīng)用紅外光譜法[9]和DNA條形碼技術(shù)[10]探究金錢(qián)草及其習(xí)用品、混偽品的比較鑒別。關(guān)于金錢(qián)草及其習(xí)用品的化學(xué)成分分析,常采用高效液相色譜法(HPLC),其中測(cè)定蘆丁、槲皮素和山柰酚等單一或少數(shù)黃酮類(lèi)成分的含量[11],且儀器靈敏度低,分析所需要的時(shí)間較長(zhǎng),難以滿(mǎn)足日漸提高的中藥質(zhì)量控制要求。近年來(lái),由于液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)具有液相高分離能力和質(zhì)譜高選擇性、高靈敏度,已廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)雜系統(tǒng)的定性和定量分析[12]。

本文基于超快速液相色譜-三重四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UFLC-Triple TOF-MS/MS)分析金錢(qián)草及其習(xí)用品中化學(xué)成分的差異性,并篩選、鑒定差異化學(xué)成分;用超快速液相色譜-三重四極桿/線性離子阱質(zhì)譜(UFLC-QTRAP-MS/MS)同時(shí)測(cè)定已鑒定的共有差異成分的含量,并對(duì)金錢(qián)草與小金錢(qián)草、連錢(qián)草進(jìn)行比較分析。本研究可為金錢(qián)草及其習(xí)用品的藥材鑒別和質(zhì)量控制提供新的方法參考,同時(shí)為揭示其藥效差異及臨床合理用藥提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

SIL-20A XR超快速液相色譜儀,包括LC-20AD二元輸液泵、STL-20A XR自動(dòng)進(jìn)樣器和CTO-20AC柱溫箱(日本島津公司);Triple TOFTM5600 System高分辨四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀和AB QTRAP 5500三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀(配有Analyst 1.6.2軟件,美國(guó)AB SCIEX 公司);湘儀H1650-W高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司);KQ-500B超聲波清洗機(jī)(昆山超聲儀器有限公司)。

MS級(jí)甲酸(美國(guó)ThermoFisher公司);HPLC級(jí)甲醇(美國(guó)Merck公司),純度大于99%;蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

對(duì)照品:綠原酸(chlorogenic acid,批號(hào)Y22M8K36544)、金絲桃苷(hyperin,批號(hào)P12S11F 124379)購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司;槲皮苷(quercitrin,批號(hào)111538-200302)購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院;異槲皮苷(isoquercitrin,批號(hào)102824)購(gòu)于江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司;蘆丁(Rutin,批號(hào)0080-9705)購(gòu)于中國(guó)生物制品檢定所;山柰酚-3-O-蕓香糖苷(kaempferol 3-O-rutinoside,批號(hào)DST200619-075)購(gòu)于成都德斯特生物技術(shù)有限公司,以上標(biāo)準(zhǔn)品純度均大于98%。

金錢(qián)草(S1)和小金錢(qián)草(S2)樣品均在2022年1月10日于四川省巴中市采集,連錢(qián)草(S3)樣品在2022年1月16日于江蘇省淮安市采集,每一藥材均有4個(gè)批次,采集后篩選出雜質(zhì)并立即曬干。藥材樣品均經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)劉訓(xùn)紅教授鑒定,金錢(qián)草為報(bào)春花科植物過(guò)路黃LysimachiachristinaeHance的干燥全草,小金錢(qián)草為旋花科植物馬蹄金DichondrarepensForst.的干燥全草,連錢(qián)草為唇形科植物活血丹Glechomalongituba(Nakai) Kupr.的干燥地上部分。以上樣品均留存樣本于南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定實(shí)驗(yàn)室,標(biāo)本編號(hào)分別為20220110001～20220110004(S1)、20220110005～20220110008(S2)、20220116001～20220116004(S3)。

1.2 溶液制備

1.2.1 對(duì)照品溶液的制備

稱(chēng)取對(duì)照品適量置容量瓶中,精密稱(chēng)定后加入80%甲醇溶解分別配制成對(duì)照品儲(chǔ)備液,置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｈ∩鲜鰧?duì)照品儲(chǔ)備液適量,定容至10 mL容量瓶中配成混合對(duì)照品溶液,搖勻后加80%甲醇逐級(jí)稀釋,以0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后注入U(xiǎn)FLC系統(tǒng)。

1.2.2 供試品溶液的制備

取金錢(qián)草、小金錢(qián)草和連錢(qián)草藥材,用粉碎機(jī)粉碎后過(guò)三號(hào)篩。稱(chēng)取藥材粉末0.5 g置具塞錐形瓶中,精密稱(chēng)定后加入5 mL的80%甲醇,稱(chēng)量,室溫下超聲(500 W,40 kHz)60 min,用相同濃度的甲醇補(bǔ)足重量,搖勻過(guò)濾,濾液離心(12 000 r/min,8 min),以0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后注入U(xiǎn)FLC系統(tǒng)。

1.3 樣品化學(xué)成分的UFLC-Triple TOF-MS/MS定性分析

1.3.1 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm × 250 mm,5 μm);流動(dòng)相由甲醇(A)和0.1%甲酸水(B)組成,梯度洗脫程序:0～2 min,5%→30% A;2～25 min,30%→55% A;25～30 min,55%→5% A;30～32 min,5%A。進(jìn)樣10 μL;流速為0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm;柱溫為30 ℃。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)負(fù)離子模式;噴霧電壓(IS):-4 500 V;離子源溫度(TEM):600 ℃;脫簇電壓(DP):-100 V;簾氣流速(CUR):40 psi;霧化氣體流速(GS1):60 psi;輔助氣體流量(GS2):60 psi;離子噴射電壓浮動(dòng)(ISVF):4 500 V;數(shù)據(jù)采集時(shí)間32 min。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)分析

使用Peakview 1.2和MarkerView 1.2.1對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰匹配、峰對(duì)齊和濾噪處理,結(jié)果進(jìn)一步導(dǎo)入SIMCA-P 13.0軟件。在定性結(jié)果的基礎(chǔ)上,使用主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維分析,以獲得關(guān)于組間差異的信息。首先采用PCA初步觀察各樣品的聚集情況,表現(xiàn)金錢(qián)草、小金錢(qián)草、連錢(qián)草之間的化學(xué)組成差異;再用PLS-DA對(duì)各樣品進(jìn)行分類(lèi),根據(jù)模型得到的變量重要性投影(variable importance for the projection,VIP)值和t檢驗(yàn)結(jié)果,以VIP>1且P<0.05為條件篩選出差異性化學(xué)成分的特征峰,從而找到潛在的差異化學(xué)成分[13]。

1.3.4 差異化學(xué)成分的鑒定

一級(jí)質(zhì)譜確定精確相對(duì)分子質(zhì)量,使用Peakview 1.2軟件中IDA explore功能獲得二級(jí)質(zhì)譜離子,推測(cè)裂解方式,結(jié)合文獻(xiàn)、對(duì)照品比對(duì)以及ChemSpider(https://chemspider.com/)、MassBank(https://massbank.eu)、METLIN(https://metlin.scripps.edu/)和HMDB(https://HMDB.ca/)等數(shù)據(jù)庫(kù)搜索,對(duì)差異化學(xué)成分進(jìn)行鑒定。

1.4 共有差異成分的UFLC-QTRAP-MS/MS定量分析

1.4.1 色譜條件

Waters XBridge?C18色譜柱(4.6 mm × 100 mm,3.5 μm);流動(dòng)相由甲醇(A)和0.4%甲酸水(B)組成,梯度洗脫程序:1～4 min,7%→35% A;4～5 min,35%→40% A;5～8 min,40%→45% A;8～10 min,45%→48% A;10～11 min,48%→5% A;11～12 min,5% A。進(jìn)樣2 μL;流速為0.8 mL/min;柱溫為30 ℃。

1.4.2 質(zhì)譜條件

ESI-掃描,負(fù)離子模式下IS:-4 500 V,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)檢測(cè);TEM:550 ℃;CUR流速:40 psi;GS1和GS2流速:55 psi;全程接口通入氮?dú)?數(shù)據(jù)采集時(shí)間12 min。

1.4.3 方法學(xué)考察

1.4..3.1 線性關(guān)系、檢出限和定量限

混合標(biāo)準(zhǔn)品已知的質(zhì)量濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo)(X),測(cè)得的對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到6個(gè)成分的回歸方程和對(duì)應(yīng)的相關(guān)系數(shù)(r)。同時(shí),分別以3倍和10倍信噪比(S/N)時(shí)成分的質(zhì)量濃度作為檢出限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantification,LOQ),結(jié)果見(jiàn)表1。本文在正式實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)6個(gè)成分在樣品中含量相差較大,為了成分的線性范圍能包含樣品中成分的含量,我們根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果估測(cè)出各個(gè)成分的濃度范圍,配置好的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液逐級(jí)稀釋后進(jìn)樣分析,得到表1中的線性范圍。6個(gè)差異化學(xué)成分在一定濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系,r均不低于0.999 4,LOD為0.18～0.85 ng/mL,LOQ為0.60～2.83 ng/mL。表中山柰酚-3-O-蕓香糖苷含量較低的時(shí)候檢測(cè)不夠靈敏,不能夠呈良好的線性關(guān)系,因此最低濃度與最低檢出限相差較大。

表1 6個(gè)成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限

1.4.3.2 精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一濃度的混合對(duì)照品溶液2 μL,在1 d內(nèi)連續(xù)6次進(jìn)樣分析,記為日內(nèi)精密度;每天進(jìn)樣3針,連續(xù)3 d進(jìn)樣分析,記為日間精密度。計(jì)算得到峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值均小于5.00%,說(shuō)明儀器具有良好的精密度;稱(chēng)定同一樣品6份,每份0.5 g,進(jìn)樣后計(jì)算6個(gè)成分的峰面積的RSD值范圍是1.79%～4.07%,表明該方法具有較好的重復(fù)性;取同一供試品溶液,分別在6個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0、2、4、8、12和24 h)進(jìn)樣分析,計(jì)算得出峰面積的RSD值范圍是1.15%～3.00%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較強(qiáng)。具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 6個(gè)成分的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率

1.4.3.3 加樣回收試驗(yàn)

取0.25 g已知含量的樣品9份置于具塞錐形瓶中,精密稱(chēng)定后分別添加低、中、高三個(gè)水平(80%、100%、120%)的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。每個(gè)濃度都制備3個(gè)平行樣品,按照“1.2.2”項(xiàng)下的方法制備,計(jì)算各成分的平均回收率。最終,綠原酸、金絲桃苷、蘆丁、異槲皮苷、槲皮苷和山柰酚-3-O-蕓香糖苷的平均回收率分別為100.14%、100.80%、99.77%、100.21%、101.89%和100.75%,RSD值均小于5.00%,表明此方法準(zhǔn)確度較好,可以用于樣品的測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試品制備方法的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)前期分別對(duì)提取溶劑(60%、70%、80%、90%、100%甲醇;60%、70%、80%、90%、100%乙醇)、提取時(shí)間(15、30、45、60、75、90 min)以及料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 (g/mL))進(jìn)行單因素考察。結(jié)果表明,80%甲醇溶液、1∶10料液比、60 min超聲提取效率最佳。為了確定1∶10的料液比是否提取率最高,因此又重新配置了1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14(g/mL)這5種料液比,用80%甲醇超聲提取60 min,結(jié)果顯示1∶10的料液比提取效率更高,因此選擇在室溫下用80%甲醇、1∶10的料液比,超聲60 min作為優(yōu)化的提取條件。

2.2 樣品化學(xué)成分的差異性分析

2.2.1 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)前期考察了不同流動(dòng)相(甲醇-0.1%甲酸水、乙醇-水、甲醇-水和乙腈-0.1%甲酸水)在梯度洗脫下對(duì)樣品中各峰分離度的影響,結(jié)果顯示以甲醇作為洗脫劑A,0.1%的甲酸水作為洗脫劑B,化合物分離的效果較好。同時(shí),液相色譜用檢測(cè)波長(zhǎng)測(cè)定時(shí)一般都選擇在對(duì)樣品有最大吸收的波長(zhǎng)下進(jìn)行,以獲得最大的靈敏度和抗干擾能力。為了獲得更好的分離效果、響應(yīng)值及減小干擾,考察了不同檢測(cè)波長(zhǎng)(254、300、360 nm)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。結(jié)果表明,當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm時(shí),成分有最大的響應(yīng)值,受雜質(zhì)干擾小,因此選擇360 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。前期查閱文獻(xiàn)可知,金錢(qián)草、小金錢(qián)草和連錢(qián)草中產(chǎn)生藥理作用的主要是黃酮和有機(jī)酸類(lèi)成分[14-16],分別在正負(fù)離子模式下進(jìn)樣,發(fā)現(xiàn)黃酮類(lèi)和有機(jī)酸類(lèi)成分均在負(fù)離子模式下具有更高的響應(yīng),因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品在負(fù)離子模式下進(jìn)行測(cè)定。負(fù)離子模式下金錢(qián)草、小金錢(qián)草和連錢(qián)草的UFLC-Triple TOF-MS/MS基峰圖如圖1所示。

圖1 金錢(qián)草(S1)、小金錢(qián)草(S2)、連錢(qián)草(S3)負(fù)離子模式下的UFLC-Triple TOF-MS /MS基峰圖

2.2.2 主成分分析(PCA)

PCA是一種使用降維概念將變量重新組合為新的復(fù)合變量的統(tǒng)計(jì)方法,從中選擇少數(shù)變量以反映大多數(shù)原始信息。用SIMCA-P 13.0軟件對(duì)金錢(qián)草、小金錢(qián)草和連錢(qián)草樣品進(jìn)行PCA分析,模型的驗(yàn)證結(jié)果(R2X=0.952,Q2=0.918)表明該模型穩(wěn)定,結(jié)果可靠。如圖2所示,三者樣品各自聚為一類(lèi),說(shuō)明金錢(qián)草、小金錢(qián)草、連錢(qián)草每個(gè)批次樣品間的化學(xué)成分比較穩(wěn)定;另外,金錢(qián)草、小金錢(qián)草、連錢(qián)草樣品分類(lèi)結(jié)果較為理想,分布在坐標(biāo)軸上的三個(gè)不同區(qū)域,說(shuō)明它們之間的化學(xué)成分存在差異。其中,金錢(qián)草和連錢(qián)草分布的距離較遠(yuǎn),金錢(qián)草位于PC1軸負(fù)半軸和PC2軸負(fù)半軸,而連錢(qián)草處在PC1軸正半軸和PC2軸正半軸,說(shuō)明兩者化學(xué)成分差異較大。

圖2 金錢(qián)草及其習(xí)用品負(fù)離子模式下PCA得分圖

2.2.3 偏最小二乘判別分析(PLS-DA)

PLS-DA是一種有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計(jì)方法,通過(guò)建立代謝物表達(dá)量與樣品類(lèi)別之間的關(guān)系模型,從而來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品類(lèi)別的預(yù)測(cè)。實(shí)驗(yàn)對(duì)金錢(qián)草、小金錢(qián)草和連錢(qián)草樣品兩兩進(jìn)行PLS-DA分析,結(jié)果如圖3所示。模型驗(yàn)證結(jié)果(R2Y=0.999、0.989、0.998,Q2=0.999、0.986、0.997)表明該模型有效可靠。

圖3 金錢(qián)草及其習(xí)用品PLS-DA得分圖(a)和VIP得分圖(b)

2.2.4 差異化學(xué)成分的鑒定

以VIP>1且P<0.05為條件篩選具有差異性表達(dá)的化合物,并對(duì)符合條件的差異化學(xué)成分進(jìn)行鑒定,最終鑒定出13個(gè)化學(xué)成分,結(jié)果見(jiàn)表3。其中6種成分為它們的共有差異化學(xué)成分,分別是綠原酸、金絲桃苷、蘆丁、異槲皮苷、槲皮苷和山柰酚-3-O-蕓香糖苷。

2.3 共有差異成分的定量分析

2.3.1 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

為了讓6種成分在較短的分析時(shí)間內(nèi)達(dá)到最佳的分離,實(shí)驗(yàn)對(duì)色譜柱、流動(dòng)相進(jìn)行了考察。首先考察了Waters XBridge?mm,3.5 μm)、ZORBAX Extend-C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)和Thermo AcclaimTMRSLC 120 C18(2.1 mm×150 mm,2.2 μm)色譜柱對(duì)6個(gè)目標(biāo)成分的分離效果。結(jié)果顯示,前者色譜柱檢測(cè)靈敏度高,分離效果優(yōu)于后兩者;同時(shí),實(shí)驗(yàn)考察了在梯度洗脫下不同流動(dòng)相(甲醇-0.4%甲酸水、乙醇-水、乙腈-0.4%甲酸水和乙腈-水)對(duì)樣品中各峰分離度的影響,結(jié)果顯示以甲醇作為洗脫劑A,0.4%的甲酸水作為洗脫劑B色譜峰的分離度最好。

取6種成分的單獨(dú)標(biāo)準(zhǔn)品溶液,在MS Only模式下,將溶液注入U(xiǎn)FLC系統(tǒng),調(diào)整質(zhì)譜條件獲得各化合物的母離子信息。將母離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo),之后尋找合適的特征子離子,再通過(guò)優(yōu)化碰撞能量、去簇電壓等條件,得到各成分的特征碎片離子及相應(yīng)的質(zhì)譜條件。實(shí)驗(yàn)前期分別在正離子和負(fù)離子模式下對(duì)6種成分標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描,觀察其響應(yīng)程度。由于待測(cè)化合物大多含有羥基,氫質(zhì)子易失去,所以6種成分在負(fù)離子模式下有更好的響應(yīng)。得到優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)和保留時(shí)間見(jiàn)表4,提取離子色譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 6種成分的提取離子色譜圖

表4 6種成分的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)

2.3.2 樣品含量測(cè)定

根據(jù)表1中線性方程計(jì)算樣品中各個(gè)成分的含量,最終結(jié)果如表5,含量堆積圖如圖5所示。圖中可以清晰看出,6種化學(xué)成分含量在金錢(qián)草、小金錢(qián)草和連錢(qián)草樣品中存在明顯差異,在金錢(qián)草樣品中蘆丁和山柰酚-3-O-蕓香糖苷這的含量較高,其余的4種成分在小金錢(qián)草樣品中含量較高,而連錢(qián)草中每種成分的含量均最少。從共有差異化學(xué)成分含量總量來(lái)分析,小金錢(qián)草中6種成分的含量總量最多,而連錢(qián)草中6種成分的含量總量最少。

圖5 金錢(qián)草及其習(xí)用品中6種成分的含量柱狀圖

表5 6種成分的含量測(cè)定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

本文首先參考了植物代謝組學(xué)的思路,建立了UFLC-Triple TOF-MS/MS方法,首先運(yùn)用PCA,結(jié)果顯示金錢(qián)草、小金錢(qián)草、連錢(qián)草樣品分布在坐標(biāo)軸上的三個(gè)不同區(qū)域,說(shuō)明它們之間的化學(xué)成分存在差異。并根據(jù)PLS-DA后得到的VIP值和t檢驗(yàn)結(jié)果,篩選并鑒定出了13種差異化學(xué)成分,其中6種為共有差異化學(xué)成分,即綠原酸、金絲桃苷、蘆丁、異槲皮苷、槲皮苷和山柰酚-3-O-蕓香糖苷。6種成分可以進(jìn)一步分類(lèi)為1個(gè)有機(jī)酸類(lèi)化合物和5個(gè)黃酮類(lèi)化合物,黃酮和有機(jī)酸類(lèi)化合物在抗腫瘤、抗炎、保護(hù)血管和抗氧化方面有顯著貢獻(xiàn)[17,18]。文獻(xiàn)記載,金錢(qián)草、小金錢(qián)草和連錢(qián)草對(duì)治療結(jié)石都有效果,其中連錢(qián)草在臨床上治療尿路結(jié)石效果更佳,金錢(qián)草更適宜治療肝膽結(jié)石[19]。除此以外,小金錢(qián)草在苗族民間為治療肝炎的常用藥?；瘜W(xué)成分和含量的差異可能是導(dǎo)致三者功效及臨床使用不一致的原因,因此對(duì)這6種共有差異化學(xué)成分的含量進(jìn)行同時(shí)測(cè)定,分析金錢(qián)草及其習(xí)用品中差異化學(xué)成分的含量變化,為探究金錢(qián)草、小金錢(qián)草及連錢(qián)草的藥效差異的物質(zhì)基礎(chǔ)具有一定意義。

建立UFLC-QTRAP-MS/MS同時(shí)測(cè)定6種差異化學(xué)成分含量的方法,結(jié)果顯示,蘆丁和山柰酚-3-O-蕓香糖苷這2種成分在金錢(qián)草中的含量比較高,其余4種成分在小金錢(qián)草中含量較高。其中,金錢(qián)草樣品中蘆丁的含量最高,平均含量為127.16 μg/g,是小金錢(qián)草的2.4倍,連錢(qián)草的71倍;小金錢(qián)草樣品中槲皮苷含量最高,平均含量為177.30 μg/g;連錢(qián)草樣品中綠原酸的含量最高,平均含量為66.83 μg/g?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,蘆丁具有很強(qiáng)的抗氧化能力,具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用[20];Yu等[21]通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了山柰酚-3-O-蕓香糖苷具有抗炎以及內(nèi)皮保護(hù)的藥理活性,同時(shí)蘆丁和山柰酚-3-O-蕓香糖苷都具有神經(jīng)保護(hù)的作用[22];金絲桃苷能夠改善心血管功能,具有抗腫瘤、抗抑郁等功效[23];綠原酸能夠治療代謝類(lèi)的疾病,且具有抗菌、抗炎等藥理作用[24];槲皮苷與金絲桃苷藥效類(lèi)似,具有抗腫瘤、抗抑郁等功效外,還有潛在的降血糖、降血脂等作用[25];異槲皮苷具有保護(hù)心血管、抗應(yīng)激、降血糖及抗過(guò)敏等多種藥理作用[26]。6個(gè)成分在含量上存在顯著差異,都具有廣泛的藥理作用,可能是導(dǎo)致藥材功能和主治不一致的原因,但是由于中藥中含有多個(gè)成分和靶點(diǎn),其療效的發(fā)揮是協(xié)同作用的結(jié)果,所以產(chǎn)生臨床療效變化差異的物質(zhì)基礎(chǔ)仍需要更深入的研究。

本文基于UFLC-Triple TOF-MS/MS結(jié)合PCA、PLS-DA探究金錢(qián)草及其習(xí)用品中化學(xué)成分的差異性,并用UFLC-QTRAP-MS/MS同時(shí)測(cè)定6個(gè)共有差異成分的含量。本研究可為金錢(qián)草及其習(xí)用品的藥材鑒別和質(zhì)量控制提供新的方法參考,同時(shí)為揭示其藥效差異及臨床合理用藥提供基礎(chǔ)資料。