楊克澤， 吳芳， 魏玉杰， 汪亮芳， 常浩，吳之濤，2， 楊憲忠，2

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究院，甘肅省特種藥源植物種質(zhì)創(chuàng)新與安全利用重點實驗室，甘肅 武威 733006；2.武威市祁連山區(qū)道地中藥材生態(tài)栽培技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 武威 733006）

芍藥（Paeonia LactifloraPall.）是芍藥科芍藥屬著名草本花卉，不僅有極高的觀賞價值，而且有非常重要的藥用價值。河西冷涼地區(qū)因具有獨特的地理優(yōu)勢與氣候條件，適合種植芍藥，主要分布在武威市古浪縣古豐鎮(zhèn)柳條河與黃羊川鎮(zhèn)、金昌等地區(qū)。近年來，芍藥種植面積逐年增加，市場前景非常廣闊。在芍藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展過程中，其病蟲害問題日益增多，且危害越來越嚴重，不僅降低了芍藥的產(chǎn)量，還嚴重影響了其觀賞價值和藥用價值等。

目前，河西冷涼地區(qū)芍藥的主要病害種類有白粉病、根腐病、褐斑病等[1-2]，其中根腐病是為害芍藥根部最嚴重的病害[3-5]。因此，本研究針對河西冷涼地區(qū)芍藥病害情況展開調(diào)查研究，對引起芍藥根腐病的病原菌進行分離和形態(tài)鑒定，同時開展室內(nèi)藥劑篩選試驗，針對芍藥病害的病原、發(fā)病規(guī)律、危害癥狀進行分析，為河西冷涼地區(qū)芍藥根腐病的田間防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

芍藥根腐病病株采自甘肅省武威市涼州區(qū)黃羊鎮(zhèn)新鎮(zhèn)路的甘肅省農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究院芍藥種植基地（N 37°67′35″，E 102°85′32″）。

3%苯醚甲環(huán)唑懸浮劑購自先正達南通作物保護有限公司，30%丙硫菌唑可分散性懸浮劑購自通州先正大農(nóng)藥化工有限公司，24%噻呋酰胺懸浮劑購自北京燕化用生生物有限公司，50%多菌靈可濕性粉劑購自深圳諾普信公司，43%戊唑醇懸浮劑購自上海生農(nóng)生化制品有限公司，20%氟唑菌酰羥胺懸浮種衣劑購自先正達投資有限公司，43%氟菌肟菌脂懸浮劑購自拜爾有限公司，25 g·L-1咯菌腈懸浮種衣劑購自先正達南通作物保護有限公司，30%肟菌戊唑醇懸浮劑購自拜爾有限公司，10%葉菌唑懸浮劑購自安徽久易有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 芍藥根腐病病原菌的分離和致病性測定采集的芍藥根腐病病株逐個記錄發(fā)病癥狀。采用常規(guī)組織分離法[6]樣品中的病原菌進行分離培養(yǎng)，將培養(yǎng)后的菌株稀釋純化進行單孢分離，獲得單孢進行純培養(yǎng)。將在芍藥根腐病株中分離到的頻率較高的菌落，根據(jù)柯赫氏法則[7]驗證分離物的致病性。選擇健康芍藥植株，栽植前剪去過長的根系，將根部放入0.1%的升汞液中浸泡3 min后取出，用無菌水清洗干凈，移栽到裝有基質(zhì)（110 ℃烘箱中高溫消毒）的花盆中，澆水后放入設(shè)施大棚中緩苗；緩苗后，準備1×107個·mL-1的孢子懸浮液進行灌根接種，灌根前刺傷芍藥根部，以灌無菌水作為對照。接種20 d 后進行調(diào)查，并取樣帶回室內(nèi)進行再分離[8]。

1.2.2 芍藥根腐病病原菌鑒定 形態(tài)鑒定：將確定了對芍藥根部有致病性的單孢純系菌落接種于PCA（馬鈴薯20 g、胡蘿卜20 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL）培養(yǎng)基，置于25 ℃黑暗培養(yǎng)5 d 后測定菌落直徑并計算生長速度；10 d 后觀察培養(yǎng)性狀及色澤，并挑取少量菌絲制成臨時玻片在顯微鏡下觀測孢子、產(chǎn)孢細胞和分生孢子形態(tài)，同時進行顯微拍照[9]。形態(tài)鑒定主要依據(jù)Leisle 分類系統(tǒng)并參照Booth和Burgess分類系統(tǒng)[10]。

分子鑒定：根據(jù)致病性測定和形態(tài)鑒定結(jié)果，選擇代表性的菌株委托上海生工生物工程有限公司進行測序。擴增引物分別為ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) 和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)，將測序獲得的序列在NCBI 上通過BLAST 比對后，根據(jù)同源性對分離菌株與數(shù)據(jù)庫中登錄的近緣鐮孢菌采用鄰接法[11]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 芍藥根腐病病原菌室內(nèi)藥劑篩選 采用含毒介質(zhì)法[12]進行室內(nèi)藥劑篩選試驗，具體方法如下。分別量取50 mL PDA 培養(yǎng)基，裝入250 mL 的三角瓶中進行高壓滅菌，滅菌后冷卻至50 ℃左右，分別量取5 mL 3%苯醚甲環(huán)唑懸浮劑、30%丙硫菌唑可分散性懸浮劑、24%噻呋酰胺懸浮劑、50%多菌靈可濕性粉劑、43%戊唑醇懸浮劑、20%氟唑菌酰羥胺懸浮種衣劑、43%氟菌肟菌脂懸浮劑、25 g·L-1咯菌腈懸浮種衣劑、30%肟菌戊唑醇懸浮劑和10%葉菌唑懸浮劑加入裝有PDA 培養(yǎng)基的三角瓶，搖勻后倒入90 mm的培養(yǎng)皿中；用消過毒的打孔器打取直徑為6 mm的病原菌菌片，將其移入冷卻后的PDA 平板中央，以加水作空白對照。每種藥劑分別設(shè)置5個劑量處理（表1），每個處理重復(fù)4次。在25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)5 d，然后測量菌落直徑（mm），計算菌絲生長相對抑制率（%）；以藥劑濃度對數(shù)為橫坐標(x)，相對抑制率的機率值為縱坐標(y)，用Microsoft Excel 軟件繪制標準曲線，計算毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)和抑制中濃度(EC50)，比較不同藥劑的毒力。

表1 10種藥劑的施用劑量處理Table 1 Dosage treatments of 10 Insecticides

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010 進行數(shù)據(jù)整理和分析，采用MEGA 5 的鄰接法（neighbor joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 芍藥根腐病發(fā)病癥狀

芍藥發(fā)生根腐病后，根系腐爛，地上葉片出現(xiàn)褪綠或死亡，植株矮小。在根莖及其以下部位發(fā)病，老根發(fā)病較重，部分細根、新根也有感病。發(fā)病初期，根部產(chǎn)生不規(guī)則黑色或褐色病斑；然后病斑逐漸擴展并凹陷，至大部分根變黑腐爛，嚴重的根部全部腐爛、地上部分干枯全株死亡（圖1）。

圖1 芍藥根腐發(fā)病癥狀Fig. 1 Symptom of root rot of Paeonia lactiflora

2.2 病原菌的形態(tài)特征

自芍藥根部分離的病原物生長速率較快，在PDA 培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)5 d 后，菌落直徑為6.6 cm。菌落正面呈白色絮狀，菌絲放射狀生長，絨狀；菌落背面中心呈紫色，邊緣呈白色（圖2）。在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，小型分生孢子數(shù)量較多，呈卵圓形或腎形，0~1 個隔膜，假頭狀著生在產(chǎn)孢細胞上，大小為(2.37~3.14) μm×(6.51~9.28) μm；大型分生孢子數(shù)量較少，呈鐮刀狀，較均勻，3~5 個 隔 膜，孢 子 大 小 為(3.99~4.74) μm×(22.60~45.94) μm（圖3A 和B）；產(chǎn)孢細胞單瓶梗，較短（圖3C）；厚垣孢子球形，表面光滑，單個或多個著生于菌絲間（圖3D）。

圖2 病原菌形態(tài)特征Fig. 2 Morphological characteristics of pathogenic bacteria

圖3 產(chǎn)孢細胞的形態(tài)特征Fig. 3 Morphological characteristics of sporogenic cells

2.3 致病性測定結(jié)果

用分離到的高頻率菌株SY2020-2 的孢子懸浮液灌根接種，20 d后調(diào)查發(fā)現(xiàn)，芍藥根部出現(xiàn)黑褐色病斑，病斑沿刺傷傷口處縱橫擴展，而對照根部的刺傷處無病斑。取病健交接處進行再分離、純化、培養(yǎng)并與接種菌株進行比較，菌落顏色以及孢子形態(tài)相似，故SY2020-2 對芍藥根具有致病性（圖4）。

圖4 致病性測定Fig. 4 Pathogenicity determination

2.4 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

將SY2020-2 測序獲得的微管蛋白序列在NCBI 上通過BLAST比對，根據(jù)同源性相似度對其與數(shù)據(jù)庫中登錄的近源菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果（圖5）顯示，SY2020-2 與登錄號為MN417204.1（Fusariumoxysporum）和 MN417203.1（Fusarium oxysporum）聚為1 支。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，將菌株SY2020-2鑒定為尖孢鐮孢菌（Fusariumoxysporum）。

圖5 基于微管蛋白序列構(gòu)建的相關(guān)菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 Phylogenetic tree of related strains based on tubulin sequences

2.5 不同殺菌劑對芍藥根腐病菌尖孢鐮孢菌的毒力回歸分析

由表2可知，供試的10種藥劑對SY2020-2均具有較好的毒力效果，其中EC50小于10 mg·L-1的藥劑有6種，由強到弱分別為30%丙硫菌唑、43%氟菌·肟菌脂、50%多菌靈、10%葉菌唑、20%氟唑菌酰胺和30%肟菌·戊唑醇，EC50分別為0.1、1.2、2.7、3.5、4.8和6.4 mg·L-1；43%戊唑醇和24%噻呋酰胺的EC50分別是13.6 和16.8 mg·L-1；25 g·L-1咯菌腈和3%苯醚甲環(huán)唑的EC50分別為124.4和600.2 mg·L-1。

表2 不同殺菌劑對芍藥根腐病菌尖孢鐮孢菌的毒力回歸分析Table 2 Regression analysis of virulence of different fungicides against Fusarium oxysporum

3 討論

芍藥根腐病是危害芍藥生長的主要病害之一，不但會造成大面積傳播，而且危害程度較大。由尖孢鐮孢菌為主要病原菌引起的芍藥根腐病在芍藥種植過程中普遍發(fā)生且危害嚴重。本研究通過實地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，芍藥根腐病在河西冷涼地區(qū)發(fā)生普遍，因此對其病原菌進行了分離與鑒定，并進一步在室內(nèi)進行了藥劑篩選和毒力測定。李麗[13]研究表明，導(dǎo)致芍藥根腐病致病菌為茄腐皮鐮孢菌（F. solani），且茄腐皮鐮孢菌可與鐮孢菌屬內(nèi)的其他鐮孢菌混合侵染引起根腐病。李艷梅等[14]通過接種試驗，證實茄腐皮鐮孢菌和尖孢鐮孢菌為大花蕙蘭根腐病的主要病原菌，且混合接種后的發(fā)病率高于單獨接種。本研究從河西冷涼地區(qū)的芍藥根腐病病株中分離得到SY2020-2 菌株，通過其形態(tài)特征和分子生物學(xué)鑒定，將該菌株鑒定為尖孢鐮孢菌；選用的10 種殺菌劑對尖孢鐮孢菌都有一定的抑制作用，且隨著用量的增大，抑制率逐漸增強。其中對尖孢鐮孢菌毒力最強的藥劑是丙硫菌唑（0.1 mg·L-1），氟唑菌酰胺（4.8 mg·L-1）、氟菌·肟菌脂（1.2 mg·L-1）、多菌靈（2.7 mg·L-1）、肟菌·戊唑醇（6.4 mg·L-1）、葉菌唑（3.5 mg·L-1）的毒力較強；而咯菌腈（124.4 mg·L-1）和苯醚甲環(huán)唑（600.2 mg·L-1）對尖孢鐮孢菌的毒力相對較差。

目前，芍藥根腐病的防治主要是在農(nóng)業(yè)措施的基礎(chǔ)上進行化學(xué)防治。本研究對河西冷涼地區(qū)芍藥根腐病病原進行了鑒定，并對優(yōu)勢病原菌進行了室內(nèi)藥劑篩選，為芍藥根腐病的田間防治提供了理論依據(jù)；篩選出了對尖孢鐮孢菌毒力較強的藥劑，今后，需對其田間防治效果進行進一步地驗證。