張文香 崔文寧 高小寬 梁魁景

(衡水學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河北 衡水 053000)

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是一種活性氧清除劑，植物在遇到逆境脅迫時(shí)便會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧物質(zhì)，影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，因此超氧化物歧化酶活性的提高，有助于提高植物的抗逆性。從分子水平了解超氧化物歧化酶基因的特性，對(duì)于優(yōu)良抗性基因的發(fā)掘以及植物抗性品種的選育均有重要的作用。根據(jù)超氧化物歧化酶的輔因子的不同，可以分為鐵超氧化物歧化酶(Fe-SOD)、錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、鎳超氧化物岐化酶(Ni-SOD)和銅/鋅超氧化物岐化酶(Cu/Zn-SOD)[1，2]。其中，Cu/Zn-SOD是植物體內(nèi)含量最豐富，功能也最重要的一種活性氧清除酶[2]。目前，研究者已在多種植物中克隆到了Cu/Zn-SOD基因，并發(fā)現(xiàn)逆境可以誘導(dǎo)該基因的表達(dá)，提高植物的抗逆性。

芝麻(Sesamum indicum)具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健價(jià)值，被稱為“油中皇后”。芝麻具有較好的耐貧瘠性，因此在多省份廣泛種植，隨著人民生活水平的提高，芝麻需求量日益增長(zhǎng)[3]。干旱是制約芝麻產(chǎn)量的重要影響因素之一，因此本研究通過鑒定分析芝麻Cu/Zn-SOD基因，為芝麻抗性基因的挖掘提供基礎(chǔ)[4]。

1 材料與方法

1.1 芝麻銅/鋅超氧化物歧化酶基因的鑒定

根據(jù)Wang等[5]公布的基因組數(shù)據(jù)，下載芝麻全基因組序列(https：//doi.org/10.6084/m9.figshare. 21151948)，同時(shí)在TAIR網(wǎng)站下載擬南芥Cu/Zn-SOD基因的蛋白序列作為參考序列，通過本地blast篩選得分值≥100的候選蛋白序列。

1.2 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

在EXPASY(https：//web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)芝麻Cu/Zn-SOD蛋白序列的分子量、氨基酸數(shù)量、等電點(diǎn)、親水性、脂肪系數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)等性質(zhì)；通過GSDS2.0(http：//gsds.gao-lab.org/)在線預(yù)測(cè)基因結(jié)構(gòu)；在InterPro(http：//www.ebi.ac.uk/interpro/result/InterProScan/)網(wǎng)站進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；在TMHMM(https：//dtu.biolib.com/DeepTMHMM)網(wǎng)站進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測(cè)；利用SignalP(https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；利用Cell-Ploc 2.0(http：//www.csbio. sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)進(jìn)行蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.3 序列比對(duì)和進(jìn)化樹構(gòu)建

下載擬南芥(Arabidopsis Thaliana)、水稻(Oryza sativa)、番茄(Solanum lycopersicum)、煙草(Nicotiana plumbaginifolia)等的Cu-Zn SOD蛋白序列，利用MEGA軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，首先進(jìn)行ClustW比對(duì)，然后采用NJ的方法構(gòu)建進(jìn)化樹，bootstrap選擇1000，其它為默認(rèn)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 芝麻Cu/Zn-SOD基因家族成員的鑒定及理化性質(zhì)分析

以擬南芥Cu/Zn-SOD的蛋白序列，本地Blast芝麻全基因組蛋白序列，共鑒定出4條Cu/Zn-SOD序列，分別命名為SiCSD1、SiCSD2、SiCSD3、SiCSD4，對(duì)應(yīng)的蛋白ID分別為Sesame03845.t1、Sesame19088.t1、Sesame15283.t1、Sesame06096.t1，對(duì)應(yīng)染色體編號(hào)分別為3號(hào)、10號(hào)、9號(hào)和4號(hào)染色體，見表1。蛋白序列長(zhǎng)度從165個(gè)氨基酸到245個(gè)氨基酸不等，其中，SiCSD1和SiCSD4蛋白序列最短，均為165個(gè)氨基酸，SiCSD2最長(zhǎng)為245個(gè)氨基酸。等電點(diǎn)為5.6～6.92，說明均為酸性蛋白質(zhì)。親水性除SiCSD3為正值外，其余均為負(fù)值，說明SiCSD3為疏水蛋白質(zhì)，其余3條為親水蛋白質(zhì)。脂肪系數(shù)為77.39～95.75，不穩(wěn)定系數(shù)為13.66～34，說明蛋白均較穩(wěn)定，見表1。

表1 芝麻Cu/Zn-SOD基因家族蛋白的理化性質(zhì)

2.2 芝麻Cu/Zn-SOD基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)與蛋白結(jié)構(gòu)域分析

根據(jù)基因注釋文件，通過GSDS軟件繪制芝麻Cu/Zn-SOD基因的結(jié)構(gòu)圖，結(jié)果如圖1a所示，外顯子和內(nèi)含子的數(shù)量各不相同，SiCSD4的外顯子數(shù)量最多，為10個(gè)；SiCSD2的外顯子數(shù)量最少，為7個(gè)；SiCSD1、SiCSD3分別含有9個(gè)和8個(gè)外顯子。在InterPro網(wǎng)站進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)4條蛋白序列均含有Cu/Zn-SOD結(jié)構(gòu)域和Cu2+、Zn2+結(jié)合位點(diǎn)，見圖1b，跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)4條蛋白都不是跨膜蛋白，見圖2，除SiCSD1預(yù)測(cè)到可信度較低的信號(hào)肽序列外，其他3條蛋白都未預(yù)測(cè)到信號(hào)肽序列，見圖3。

圖1 基因結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

圖2 跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.3 芝麻Cu/Zn-SOD基因家族成員二級(jí)結(jié)構(gòu)與亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

通過SOPMA在線預(yù)測(cè)芝麻Cu/Zn-SOD蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3條蛋白都是無(wú)規(guī)則卷曲含量最高，48.86%(SiCSD3)～58.18%(SiCSD4)。延伸鏈含量次之，25.71%(SiCSD2)～32.12%(SiCSD4)。除SiCSD3外，都是α-螺旋含量最低，β-轉(zhuǎn)角次之；SiCSD1的α-螺旋含量最低，為3.03%，SiCSD3的α-螺旋含量最高，為15.07%，SiCSD4的β-轉(zhuǎn)角含量最低為5.45%，SiCSD1的β-轉(zhuǎn)角含量最高為7.88%，見表2。在Plant-mPLoc網(wǎng)站對(duì)芝麻Cu/Zn-SOD蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)，SiCSD1-3都定位于葉綠體，SiCSD4定位于葉綠體和細(xì)胞質(zhì)，見表2。

表2 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)與亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

2.4 芝麻Cu/Zn-SOD基因的進(jìn)化樹分析

利用MEGA軟件，將芝麻的4條Cu/Zn-SOD基因的蛋白序列(SiCSD1-4)與擬南芥(At CSD1-2)、水稻(OsSODC1-2)、番茄(SlSODC1-2)、煙草(NpSODC)進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建進(jìn)化樹，見圖4，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SiCSD3與AtCSD2聚為1支，SiCSD4與AtCSD3聚為1支，SiCSD1和SiCSD2與NpSOODC、SlSODC1、SlSODC2聚在1個(gè)大的分支。

圖4 進(jìn)化樹分析

3 結(jié)論與討論

本研究通過全基因組水平的本地blast，獲得4條芝麻Cu-ZnSOD基因，通過序列與理化性質(zhì)的分析，對(duì)其序列長(zhǎng)度、基因結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位、進(jìn)化關(guān)系等有了一定的了解，可以幫助后續(xù)對(duì)其功能的驗(yàn)證。

植物在遭受逆境脅迫時(shí)，體內(nèi)活性氧升高。SOD是清除活性氧，幫助植物抵抗逆境脅迫的重要酶系統(tǒng)之一。其中，Cu/Zn-SOD又是植物體內(nèi)含量最豐富、功能也最重要的一種SOD，目前對(duì)其研究也比較廣泛，已在小麥[6，7]、棉花[8]、茶樹[9]等多種作物進(jìn)行全基因組水平的SOD基因鑒定。Han等在丹參全因組水平鑒定出3條Cu/Zn-SOD基因[10]。Zhou等在茶樹全基因組中鑒定出7條Cu/Zn-SOD基因，發(fā)現(xiàn)其在抵抗干旱脅迫時(shí)可能發(fā)揮主要的作用[9]。Han等在日本落葉松中鑒定出4條Cu/Zn-SOD基因，其中3條的蛋白序列(LkSOD1，LkSOD3和LkSOD4)定位于細(xì)胞質(zhì)，1條定位于葉綠體[11]，與本研究中芝麻Cu/Zn-SOD類似。Cui等克隆了白菜Cu/Zn-SOD基因(BcCSD1)，發(fā)現(xiàn)其在葉片中表達(dá)量最高，在根中的表達(dá)量最低，不同逆境脅迫處理都能誘導(dǎo)BcCSD1的表達(dá)量升高，尤其ABA處理表達(dá)量升高最明顯[12]。Liu等發(fā)現(xiàn)，將麻風(fēng)樹的Cu/Zn-SOD基因在擬南芥中異位表達(dá)，能夠增強(qiáng)擬南芥的耐鹽性[13]。綜上所述，Cu/Zn-SOD已在多種植物中驗(yàn)證對(duì)提高植物的抗逆性有著重要作用。

本研究對(duì)Cu/Zn-SOD基因序列的鑒定與分析，將為后期基因的克隆、載體構(gòu)建、基因功能驗(yàn)證以及芝麻抗逆基因資源的獲取等提供一定的研究基礎(chǔ)。