翟碩莉王巖張秀豐

(1.衡水學(xué)院生命科學(xué)系，河北 衡水 053000；2.石家莊海關(guān)技術(shù)中心，河北 石家莊 050000)

硒是人體必需且不能自身合成的微量元素，自然界的硒存在無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒2種形式，無(wú)機(jī)硒有毒性且人體難以吸收，有機(jī)硒如硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸等毒性極低，人體可吸收利用[1]，且有研究表明，有機(jī)硒是谷胱甘肽過(guò)氧化酶的重要組成成分，一定量的硒攝入能夠促進(jìn)生長(zhǎng)、對(duì)視覺(jué)器官有重要作用[2]，硒還具有清除自由基、抗癌、提高免疫力等功效[3]。硒的適量攝入有益于人體健康，從食品中攝入有機(jī)硒是膳食硒的有效補(bǔ)充方式。

近年來(lái)，有多項(xiàng)報(bào)道稱(chēng)通過(guò)微生物如酵母菌、乳酸菌可將食品中的無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，在保障食品安全的前提下，本研究選擇食品級(jí)乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵葡萄汁富集硒，通過(guò)對(duì)富硒乳酸菌發(fā)酵葡萄工藝條件的優(yōu)化及發(fā)酵前后功能性物質(zhì)的研究，評(píng)價(jià)乳酸菌發(fā)酵葡萄汁的多酚類(lèi)物質(zhì)、黃酮類(lèi)物質(zhì)及抗氧化活性，使硒元素與乳酸菌二者對(duì)人體的功效實(shí)現(xiàn)“1+1>2”的效果，以期研發(fā)一款集風(fēng)味和功能性于一體的葡萄發(fā)酵制品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巨峰葡萄、脫脂乳、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、白砂糖、食品級(jí)檸檬酸、沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、硝酸鋁、亞硝酸鈉、ABTS、鐵氰化鉀、果膠酶、福林酚試劑、硝酸、鐵氰化鉀等。

1.2 儀器與設(shè)備

培養(yǎng)箱、榨汁機(jī)、分光光度計(jì)、滅菌鍋、阿貝折光儀、pH計(jì)、原子熒光光譜儀、微波消解儀等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 富硒乳酸菌的制備

脫脂乳中加入亞硒酸鈉(加入后濃度為0.8μg·L-1)，115℃，15min滅菌后，接入保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌(1∶1)，42℃恒溫發(fā)酵至凝乳，即為富硒乳酸菌。

1.3.2 葡萄發(fā)酵工藝過(guò)程

巨峰葡萄→挑選、清洗→打漿→加入0.1%果膠酶酶解→8層紗布過(guò)濾→加輔料(白砂糖、檸檬酸)→均質(zhì)→殺菌→冷卻后接種→發(fā)酵→成品。

1.3.3 單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)

固定發(fā)酵溫度36℃，發(fā)酵時(shí)間12h，選取料水比3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3；加糖量3%、5%、7%、9%、11%；接種量1%、2%、3%、4%、5%，以發(fā)酵后pH值和感官評(píng)分為指標(biāo)，以確定單因素的水平范圍。

根據(jù)單因素試驗(yàn)得到的水平范圍，設(shè)計(jì)L9(33)正交試驗(yàn)，見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

1.3.4 感官評(píng)價(jià)

評(píng)定小組成員為20名，男女各1/2人數(shù)，從3個(gè)方面進(jìn)行感官評(píng)分，100分為滿(mǎn)分，取平均分，對(duì)不同發(fā)酵條件的乳酸菌發(fā)酵葡萄汁飲料進(jìn)行感官評(píng)分，感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)表見(jiàn)表2。

表2 葡萄汁感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)表

1.3.5 測(cè)定指標(biāo)

1.3.5.1 pH值

發(fā)酵后葡萄汁攪拌均勻，pH計(jì)測(cè)定。

1.3.5.2 可溶性固形物含量測(cè)定

使用阿貝折光儀測(cè)可溶性固形物，以°Brix表示。

1.3.5.3 總酚測(cè)定

采用Folin-Ciocalteu[4]法在765nm下，測(cè)定貯藏期樣品中的總酚。以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，吸光值為縱坐標(biāo)(Y)，沒(méi)食子酸濃度為橫坐標(biāo)(X)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：

Y=0.018X+0.0012，R2=0.9982

1.3.5.4 總黃酮測(cè)定

采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法在510nm下，測(cè)定總黃酮含量[5]，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，吸光值為縱坐標(biāo)(Y)，蘆丁濃度為橫坐標(biāo)(X)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：

Y=0.0124X-0.0114

1.3.5.5 ABTS清除率測(cè)定[6]

配制7.4mmol·L-1ABTS，2.6mmol·L-1K2S2O8，等體積混合，避光室溫下靜置12h，即儲(chǔ)備液。使用時(shí)以無(wú)水乙醇稀釋?zhuān)?34nm處使吸光值為0.7±0.02，即ABTS+工作液。

葡萄汁與ABTS+工作液反應(yīng)，吸光值記為A1，葡萄汁與無(wú)水乙醇反應(yīng)，吸光值記為A2，無(wú)水乙醇與ABTS+工作液反應(yīng)，吸光值記為A0。

ABTS自由基清除率(%)=[A0-(A1-A2)/

A0]×100%

1.3.5.6 Fe3+還原力的測(cè)定

取0.2mL貯藏期葡萄汁，參考肖夢(mèng)月等[7]的測(cè)定方法，在700nm處測(cè)各貯藏期葡萄汁的吸光值。

1.3.5.7 硒測(cè)定

采用GB 5009.93-2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中硒的測(cè)定》中的 第一法 氫化物原子熒光光譜法[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌發(fā)酵葡萄汁工藝研究

2.1.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1.1 料水比對(duì)發(fā)酵葡萄汁的影響

料水比決定著果汁中葡萄的使用量和發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌提供的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是否充足。從圖1結(jié)果看，料水比過(guò)低，味道過(guò)淡，口感不佳；料水比過(guò)高，葡萄汁太粘稠，評(píng)分較低。料水比從1∶3增加到3∶1，pH值呈先下降再上升趨勢(shì)，料水比2∶1時(shí)pH值稍高于1∶1，感官評(píng)分最高。

圖1 料水比對(duì)葡萄汁pH的影響

2.1.1.2 加糖量對(duì)發(fā)酵葡萄汁的影響

乳酸菌利用葡萄中的碳水化合物進(jìn)行發(fā)酵，白砂糖的加入使得發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的酸被中和，產(chǎn)生適口的酸甜感。由圖2可知，加糖量3%～9%時(shí)，pH值逐漸降低，接種量11%時(shí)pH升高?？赡苁且?yàn)楫?dāng)加糖量過(guò)多時(shí)，乳酸菌不能將糖完全利用，導(dǎo)致pH升高。當(dāng)加糖量為9%和11%時(shí)，感官評(píng)分較高，低于9%，口感偏酸。

圖2 加糖量對(duì)葡萄汁pH的影響

2.1.1.3 接種量對(duì)乳酸菌發(fā)酵山楂汁的影響

如圖3所示，隨乳酸菌接種量的增加，發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生較多的有機(jī)酸，pH逐漸降低，當(dāng)接種量高于3%后，pH回升，可能是發(fā)酵底物不足以提供足夠的營(yíng)養(yǎng)，導(dǎo)致乳酸菌自溶。接種量為3%，感官評(píng)分最高。

圖3 接種量對(duì)葡萄汁pH的影響

2.1.2 正交試驗(yàn)

由表3可知，當(dāng)評(píng)價(jià)指標(biāo)為感官評(píng)分，3個(gè)因素的主次影響順序?yàn)镃>A>B，最佳工藝參數(shù)為A2B2C2；當(dāng)評(píng)價(jià)指標(biāo)為pH值，主次影響順序?yàn)锳>C>B，最佳工藝參數(shù)為A2B3C3。從2個(gè)指標(biāo)的數(shù)據(jù)分析結(jié)果看，加糖量對(duì)乳酸菌發(fā)酵葡萄汁工藝影響最小，從合理膳食的角度考慮，糖的攝入不宜過(guò)多，從口感角度考慮，接種量較大時(shí)酸度大，因此選擇加糖量7%，接種量3%較適宜，最終確定工藝條件為A2B2C2。

表3 L9(33)正交試驗(yàn)表

2.1.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析得出的最佳工藝條件為A2B2C2，即料水比2∶1，加糖量7%，接種量3%，在此條件下發(fā)酵葡萄汁，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果測(cè)定pH值4.08，感官評(píng)分88.3，與正交試驗(yàn)表中的結(jié)果比較，pH值不是最低的，但感官評(píng)分最高，可能是糖酸比較適宜，因此可以選擇A2B2C2作為最佳工藝條件發(fā)酵葡萄汁。

2.2 乳酸菌發(fā)酵葡萄汁理化指標(biāo)和功能性物質(zhì)變化

葡萄中富含有機(jī)酸、糖類(lèi)、酚類(lèi)物質(zhì)、黃酮類(lèi)物質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等，發(fā)酵過(guò)程中，乳酸菌以這些營(yíng)養(yǎng)成分為底物改善葡萄汁的風(fēng)味和功能特性。從表4可知，發(fā)酵后的葡萄汁的pH值降低了0.36，可溶性固形物降低了1.43°Brix，這是由于發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌利用糖類(lèi)物質(zhì)生成了有機(jī)酸，使得葡萄汁pH值降低，可溶性固形物含量減少。

表4 葡萄汁發(fā)酵前后指標(biāo)的變化

試驗(yàn)測(cè)得發(fā)酵后葡萄汁的總酚含量較發(fā)酵前增加了13.9%，總黃酮含量增加了18.2%。葡萄中含有的酚類(lèi)物質(zhì)以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)2種形式存在，游離態(tài)酚被氧化導(dǎo)致總酚含量降低，酸性環(huán)境能夠減緩氧化過(guò)程，而乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的酚酶轉(zhuǎn)化結(jié)合態(tài)酚，形成更多的游離態(tài)酚[9]。多酚類(lèi)物質(zhì)含量的增加能夠清除更多的自由基，使得ABTS自由基清除能力增加，鐵離子還原能力增強(qiáng)，加強(qiáng)了葡萄汁的抗氧化作用。葡萄汁中的硒含量從發(fā)酵前的0.07μg·mL-1增加到0.18μg·mL-1，說(shuō)明發(fā)酵葡萄汁所用乳酸菌具有一定的富硒能力。

3 結(jié)論

本研究以食品級(jí)的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌(1∶1)混菌發(fā)酵葡萄汁，對(duì)其發(fā)酵工藝條件及發(fā)酵前后功能性成分和抗氧化活性進(jìn)行了分析，乳酸菌混菌發(fā)酵葡萄汁能夠提高總酚和總黃酮含量，從而達(dá)到一定的自由基清除能力和鐵離子還原能力，同時(shí)葡萄汁中有機(jī)硒的含量增加了0.11μg·mL-1，說(shuō)明該發(fā)酵葡萄汁具有一定的富硒功能和抗氧化功能。