毛錦江，甘 冰，楊品莉，李 敏，楊燕嫣，韋舟玲

（貴港市人民醫(yī)院產(chǎn)科，廣西 貴港 537100）

耳聾（hearing loss）是一種最常見的人類感覺系統(tǒng)缺陷，70%的遺傳性耳聾屬于非綜合征型聽力缺損。遺傳性耳聾按其遺傳方式可分為常染色體顯性、常染色體隱性、性連鎖和線粒體遺傳，按其臨床表現(xiàn)可分為綜合征型耳聾（syndromic hearing loss，SHL）和非綜合征型耳聾（non-syndromic hearing loss，NSHL）[1]。我國(guó)人群最常見致聾基因——GJB2 基因（gap junctionproteinbeta-2 gene，GJB2 gene），突變檢出率達(dá)21.6%，第2 位致聾基因——SLC26A4 基因（SLC26A4gene 或PDS gene）突變檢出率為20.35%。線粒體DNA（mtDNA）突變是導(dǎo)致我國(guó)人藥物性耳聾的主因，與個(gè)體攜帶線粒體12SrRNA 基因的A1555G 和C1494T 敏感突變相關(guān)檢出率之和達(dá)1.87%[2]。通常聽力正常夫妻如果雙方均屬于隱性遺傳基因引發(fā)的病變異常攜帶者，此時(shí)胎兒約有25%的可能為獲得父母雙等位基因致病變，而成為遺傳性耳聾患者[3]。本研究擬在聽力正常的孕婦且無耳聾家族史及其分娩的新生兒均中開展耳聾基因攜帶率與突變譜的調(diào)查，提供遺傳咨詢與生育指導(dǎo)的干預(yù)模式，現(xiàn)將研究報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2019 年9 月-2021 年12 月來貴港市人民醫(yī)院檢查聽力正常，且無耳聾家族史的孕婦及其分娩的新生兒為研究對(duì)象。研究開始之前簽署知情同意書，自愿接受耳聾基因檢測(cè)。本研究通過醫(yī)院倫理審批。采用隨機(jī)分組法分組，研究組為1806 例孕婦及其分娩的新生兒，攜帶者丈夫進(jìn)行耳聾基因測(cè)序。對(duì)照組為同期1810 例孕婦未行耳聾基因檢測(cè)，僅對(duì)其分娩新生兒出生后進(jìn)行耳聾基因檢測(cè)。

1.2 方法

1.2.1 DNA 的提取 用含EDTA-K3 的真空采血管，新生兒系采集臍帶血2.0～3.0 ml，或采用足跟采血，制作血斑卡；孕婦采集靜脈血2.0～3.0 ml。采用血液基因組DNA 提取試劑盒（KZ-4801），提取純化DNA。用紫外分光光度法檢測(cè)DNA 質(zhì)量濃度和純度，確保DNA 質(zhì)量濃度≥200 ng/L，純度為A260/A280 的比值在1.8～2.0，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR 擴(kuò)增 配置PCR Mix 的擴(kuò)增反應(yīng)液，每個(gè)標(biāo)本分A、B 兩種反應(yīng)液，各加入提取好的樣本DNA 3 μl，按以下程序進(jìn)行PCR 的擴(kuò)增，先預(yù)變性：95℃，9 min；再95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃1 min，共40 循環(huán)；最后72 ℃5 min，16 ℃10 s 完成擴(kuò)增。

1.2.3 耳聾基因雜交檢測(cè) PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：PCR產(chǎn)物熱變性成為單鏈DNA，在醫(yī)用核酸分子雜交儀2012A 與低密度基因芯片探針雜交，通過顯色反應(yīng)，得到清晰可見的檢查結(jié)果。按照耳聾基因檢測(cè)試劑盒（PCR+導(dǎo)流雜交法）的操作說明書，測(cè)定4 個(gè)我國(guó)常見的耳聾易感基因的13 個(gè)熱點(diǎn)突變位點(diǎn)，包括GJB2（35delG、176del16、235delC、299delAT、155delTCTG）、SLC26A4（IVS7 -2A ＞G、2168A ＞G、1229C ＞T）、線粒體DNA（1494C ＞T、1555A ＞G、7445A＞G、12201T＞C）、GJB3（538C＞T）點(diǎn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。運(yùn)用頻數(shù)（%）描述2019-2021 年貴港部分孕婦及其新生兒、攜帶者丈夫的耳聾基因相關(guān)病例等資料。兩組數(shù)據(jù)比較主要采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 1806 例孕婦耳聾基因檢測(cè)結(jié)果 1806 例孕婦中有74 例攜帶，攜帶率為4.09%，其中GJB2 基因攜帶者37 例，攜帶率為2.05%。SLC26A4 基因攜帶者32例，攜帶率為1.77%。藥物性耳聾基因攜帶者5 例，攜帶率為0.28%。GJB3 基因攜帶者0 例，見表1。

表1 1086 例正常聽力孕齡女性人群耳聾基因攜帶率與突變譜調(diào)查（n，%）

2.2 攜帶者夫婦耳聾基因檢查結(jié)果 對(duì)74 例突變攜帶者進(jìn)行電話隨訪，通過宣教及知情告知，38 例孕婦的配偶接受了耳聾基因芯片及相應(yīng)基因的測(cè)序檢測(cè)，36 例耳聾基因測(cè)序均為陰性，2 例為陽性，耳聾基因型為，均與孕婦不同型。隨訪新生兒3 例發(fā)生與孕婦相同基因突變的攜帶者，35 例新生兒耳聾基因檢測(cè)未見異常，見表2。

表2 攜帶者夫妻耳聾基因突變位點(diǎn)情況

對(duì)這38 對(duì)致聾突變攜帶者進(jìn)行遺傳指導(dǎo)，告知先天性聾兒發(fā)生的幾率和風(fēng)險(xiǎn)。28 例GJB2 基因突變致聾屬于常染色隱性遺傳，其中26 例由于其丈夫耳聾基因測(cè)序均為陰性，其胎兒不會(huì)發(fā)生先天性耳聾，繼續(xù)妊娠，其中1 對(duì)夫婦分娩新生兒確診為雜合突變攜帶者，聽力篩查正常。2 例孕婦其丈夫耳聾基因測(cè)序?yàn)殛栃裕桥c孕婦不同型，其胎兒不會(huì)發(fā)生耳聾基因純合子，不會(huì)導(dǎo)致耳聾兒因此沒有進(jìn)一步做羊水穿刺產(chǎn)前診斷，繼續(xù)妊娠，2 例分娩新生兒確診為雜合突變攜帶者，與孕婦一致，聽力篩查正常。9例耳聾基因檢測(cè)結(jié)果為SLC26A4 基因雜合突變，其丈夫耳聾基因測(cè)序陰性，分娩的新生兒耳聾基因均正常。因SLC26A4 基因雜合突變?yōu)榇笄巴?dǎo)水管綜合征患者，向孕婦發(fā)放大前庭導(dǎo)水管綜合征患者注意事項(xiàng)卡片，指導(dǎo)其在日常生活中避免因劇烈運(yùn)動(dòng)或者頭部受到撞擊等環(huán)境因素引發(fā)運(yùn)動(dòng)性耳聾，盡量延緩患者耳聾發(fā)生的時(shí)間。3 例耳聾基因檢測(cè)結(jié)果為線粒體1555M 均質(zhì)突變，其丈夫耳聾基因測(cè)序陰性，分娩的新生兒耳聾基因均正常。線粒體基因雜合突變，為藥物性耳聾，遵循母系遺傳模式。

2.3 最終分娩的新生兒耳聾基因檢測(cè)情況 研究組1806 例孕婦中，有86 例新生兒未行耳聾基因檢測(cè)，包括孕婦在外院分娩47 例、病理妊娠35 例以及失聯(lián)4 例，研究組新生兒攜帶率高于對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.062，P=0.804），見表3。

表3 兩組新生兒攜帶耳聾基因比例（n，%）

2.4 隨訪結(jié)果 對(duì)74 例攜帶者孕婦進(jìn)行了電話隨訪60 例新生兒耳聾基因攜帶，均通過聽力篩查。10 例在外院分娩，未行耳聾基因檢測(cè)，均通過聽力篩查。4 例未能追蹤。

3 討論

耳聾是最常見的出生缺陷之一，新生兒期的發(fā)病率為1‰～3‰，學(xué)齡期兒童耳聾的發(fā)病率增加至3‰～4‰[4-6]。只針對(duì)聾人的篩查和干預(yù)不能很好地阻斷遺傳性耳聾在人群中的傳遞和發(fā)病，擴(kuò)大耳聾基因診斷應(yīng)用范圍就很有必要。如果在聽力正常的孕婦中進(jìn)行致聾基因攜帶率與突變譜的研究，可為耳聾基因篩查、遺傳咨詢、疾病管理提供一定的數(shù)據(jù)資料。按表型特點(diǎn)不同分為綜合征性耳聾（SHL）和非綜合征性耳聾（NSHL）。根據(jù)遺傳方式不同將遺傳性耳聾分為常染色體顯性遺傳（AD）、常染色體隱性遺傳（AR）、X 連鎖遺傳、Y 連鎖遺傳及線粒體遺傳五類，其中以AR 耳聾最多見，占75%～80%。

本研究通過對(duì)1806 例貴港地區(qū)聽力正常且無耳聾家族史的孕婦，進(jìn)行常見GJB2、GJB3、SLC26A4、線粒體12SrRNA4 個(gè)耳聾相關(guān)基因的9 個(gè)致聾突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，明確其耳聾基因突變攜帶情況。對(duì)攜帶耳聾基因突變的孕婦，同時(shí)對(duì)其配偶進(jìn)行基因診斷，在夫婦雙方基因診斷明確的基礎(chǔ)上，利用產(chǎn)前基因診斷技術(shù)來阻斷遺傳性耳聾的傳遞。本研究發(fā)現(xiàn)74 例攜帶，耳聾病易感基因突變攜帶率為4.09%，其中GJB2 基因攜帶者37 例，攜帶率為2.05%；SLC26A4 基因攜帶者32 例，攜帶率為1.77%；藥物性耳聾基因攜帶者5 例，攜帶率為0.28%；GJB3 基因攜帶者0 例。GJB2 基因與SLC26A4 基因突變攜帶率占比較大，合計(jì)約93.24%，與國(guó)內(nèi)學(xué)者的研究相似[7-9]。常見GJB2 基因突變類型主要有235 del C、299 del AT，與劉暢等[10]的研究相似。

本研究中，GJB2 基因在貴港地區(qū)非綜合征性耳聾（NSHL）患者中的突變頻次為37 例檢出率為20.48%，235M 突變雜合子，占該基因突變位點(diǎn)的94.59%，位點(diǎn)在本地區(qū)NSHI 者中為GJB2 基因主要致病位點(diǎn)。與林文津等[11]報(bào)道的檢出率11.06%有差異，與劉雙雙等[12]報(bào)道的19.1%相近，表明存在明顯的地域性差。本研究中SLC26A4 基因突變率為1.77%，僅次于GJB2 基因，其中SLC26A4 IVS7-2A＞G 突變占SLC26A4 基因總突變的78.12%，與之前的研究相似[13]。其中38 例攜帶者的丈夫進(jìn)行芯片檢測(cè)和相應(yīng)基因測(cè)序36 例均為陰性；2 例為陽性攜帶者，但是與孕婦耳聾基因不同型。因病例少，尚未發(fā)現(xiàn)有同一突變攜帶者的夫妻，因此未有需進(jìn)行產(chǎn)前診斷的病例。其最終分娩的新生兒有3 例為耳聾基因攜帶者，均通過聽力篩查。

既往研究發(fā)現(xiàn)[14，15]，引發(fā)耳聾的致病因素主要有兩種，即一是遺傳因素、二是環(huán)境因素，約60%的耳聾患者為遺傳性耳聾。根據(jù)經(jīng)典的孟德爾遺傳規(guī)律，新生兒攜帶的耳聾基因是由父母的遺傳所致[16]。遺傳咨詢的目的是通過家系遺傳分析和生育指導(dǎo)以減少先天性耳聾發(fā)生率和患兒出生率。本研究根據(jù)不同基因突變的特點(diǎn)進(jìn)行遺傳咨詢，對(duì)于檢出的突變攜帶者則進(jìn)行成年后的配偶選擇和優(yōu)生優(yōu)育指導(dǎo)。對(duì)于夫妻雙方均為相同基因突變攜帶者，每妊娠一次均有1/4 幾率為純合子，可進(jìn)行胚胎植入前診斷（PGD），在孕前阻斷耳聾出生缺陷，將預(yù)防關(guān)口前移，真正做到耳聾的一級(jí)預(yù)防[17]。如對(duì)于攜帶不同基因突變的夫妻，因其子代沒有成為純合子的可能，一般不建議PD 或PGD。GJB2 與SLC26A4 相關(guān)耳聾主要表現(xiàn)為常染色體隱性遺傳非綜合征性耳聾，線粒體12SrRNA 突變與SLC26A4 基因突變均為遲發(fā)性耳聾。SLC26A4 基因位于7q31，Pendrin 屬于編碼穿膜蛋白，其是常染色體隱性遺傳，以上基因的突變會(huì)引發(fā)先天性耳聾，或是遲發(fā)性耳聾，而且還會(huì)伴有前庭水管擴(kuò)大，此時(shí)建議患者積極預(yù)防頭部外傷和感冒等[18]。

線粒體12SrRNA 突變可認(rèn)為是藥物性耳聾突變mtDNA A1555G 和C1494T 突變攜帶者表現(xiàn)為對(duì)氨基糖甙類藥物敏感，是導(dǎo)致氨基糖甙類抗生素致聾和非綜合征性耳聾的重要原因之一。線粒體DNA 12S rRNA 基因突變是氨基糖甙類藥物誘導(dǎo)性耳聾的重要遺傳機(jī)制[19]，遵循母系遺傳模式。本研究發(fā)現(xiàn)5 例孕婦為線粒體12S rRNA 1555A＞G 均質(zhì)突變，突變率為0.46%，與國(guó)內(nèi)其他報(bào)道的結(jié)果較低[20]。針對(duì)攜帶線粒體基因突變的孕婦進(jìn)行了藥物性耳聾遺傳咨詢，為突變攜帶者及其母系親屬提供了詳細(xì)的用藥指導(dǎo)，禁服氨基糖甙類抗生素，以避免藥物性耳聾的發(fā)生。夏家輝院士發(fā)現(xiàn)的首個(gè)我國(guó)本土耳聾相關(guān)基因是GJB3 基因，其主要表型為語后進(jìn)行性高頻聽力感音神經(jīng)性耳聾。其致病機(jī)制有待于研究。本研究研究組孕婦中沒有發(fā)現(xiàn)GJB3 基因攜帶者，對(duì)照組新生兒發(fā)現(xiàn)1 例GJB3 基因攜帶者。

出生缺陷預(yù)三級(jí)預(yù)防措施包括：一級(jí)預(yù)防，指防止出生缺陷兒的發(fā)生，而耳聾的一級(jí)預(yù)防指耳聾基因普遍性篩查；二級(jí)預(yù)防，指減少出生缺陷兒的出生，而耳聾的二級(jí)預(yù)防通過對(duì)聾人群體婚配生育指導(dǎo)以及遺傳性耳聾家庭的產(chǎn)前診斷，減少耳聾的出生，也是目前耳聾預(yù)防與干預(yù)主要手段；三級(jí)預(yù)防，指出生缺陷兒及早發(fā)現(xiàn)和治療，而耳聾的三級(jí)預(yù)防是指新生兒聽力篩查。單純行聽力篩查存在自身局限，不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)和預(yù)測(cè)出生時(shí)未表現(xiàn)出聽力下降的新生兒耳聾攜帶者，導(dǎo)致遺漏遲發(fā)性聾、藥物性耳聾。針對(duì)一級(jí)預(yù)防，孕婦進(jìn)行耳聾基因檢測(cè)，如夫婦均攜帶同一耳聾基因突變，給予遺傳咨詢及生育指導(dǎo)，包括胚胎植入前診斷、接受捐贈(zèng)配子、產(chǎn)前基因診斷等。還可以告知胎兒將來婚配對(duì)象進(jìn)行相應(yīng)耳聾基因的檢測(cè)，避免其后代出現(xiàn)耳聾患兒。如果為線粒體遺傳耳聾基因突變攜帶者，遺傳咨詢中需充分告知其母系遺傳方式及其與藥物誘導(dǎo)性耳聾的關(guān)系，并給予用藥指導(dǎo)。

本研究中有35 例新生兒為攜帶者，對(duì)照組有39 例新生兒為攜帶者，兩組新生兒聽力篩查均正常。研究認(rèn)為對(duì)孕婦及新生兒性耳聾基因篩查可作為發(fā)現(xiàn)一種新生耳聾的篩查工具，對(duì)孕婦及新生兒攜帶遲發(fā)性耳聾基因進(jìn)行分析病因，給予預(yù)防指導(dǎo)，可降低遲發(fā)性耳聾發(fā)生，篩查結(jié)果陰性可解讀為在本篩查范圍內(nèi)未發(fā)現(xiàn)相關(guān)致聾基因的變異[21]。

綜上所述，通過聽力正常的孕婦及其新生兒行耳聾基因檢測(cè)，攜帶者配偶行耳聾基因測(cè)序，必要時(shí)行羊水穿刺產(chǎn)前診斷，可避免雙方均為同一耳聾突變基因攜帶者的夫婦生育聾兒，及早地發(fā)現(xiàn)藥物性耳聾敏感個(gè)體、遲發(fā)性遺傳性耳聾個(gè)體。建立適合貴港地區(qū)遺傳性耳聾一級(jí)預(yù)防模式，通過遺傳咨詢和生育指導(dǎo)、早期干預(yù)和康復(fù)，降低貴港地區(qū)遺傳性耳聾的發(fā)生率和患兒出生率可有效預(yù)防耳聾發(fā)生。