張 燕，于官正，張 鈺，涂 星，3，黃 琪，邊卓陽，陳亞君

（1.長江大學(xué)附屬荊州醫(yī)院腫瘤科，湖北 荊州 434023；2.湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部，湖北 恩施 445000；3.湖北民族大學(xué)武陵山中藥材檢驗檢測中心，湖北 恩施 445000）

線粒體自噬（mitochondrial autophagy）是一種選擇性自噬，通過自噬選擇性地去除或降解受損線粒體的過程，其對維持細胞功能具有重要作用[1]。有研究發(fā)現(xiàn)[2]，線粒體自噬與腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多種臨床疾病的發(fā)病機制有關(guān)，通過對線粒體自噬進行干預(yù)，可能會具有治療作用。二氫楊梅素（dihydromyrucetin，DMY）是一種多酚羥基二氫黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、維持血糖穩(wěn)態(tài)、改善認知障礙等藥理作用，對神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病有治療或保護作用[3]。研究表明[4，5]，DMY 可通過激活自噬預(yù)防糖尿病心肌病、改善肝纖維化等。但DMY 是否可以通過多靶點、多通路調(diào)節(jié)線粒體自噬尚不清楚。故，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，探討DMY 對線粒體自噬的作用機制，為其提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 化合物靶點的預(yù)測和疾病靶點的篩選 通過PubChem 數(shù)據(jù)庫檢索“Dihydromyricetin”的SMILES號，將其輸入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫，以“Homo sapiens”為設(shè)置條件，進行化合物靶點的預(yù)測，刪除預(yù)測結(jié)果中的重復(fù)靶點，并以“Probability”值＞0 為篩選條件，篩選后的靶點為最終的靶點。以“mitophagy”為檢索詞在GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org）和NCBI 數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行疾病靶點的篩選，刪除重復(fù)值，合并2個疾病數(shù)據(jù)庫的靶點。

1.2 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò) 利用R 4.0.2 軟件對得到化合物與疾病靶點取交集得到化合物疾病的共有靶點并繪制韋恩圖；將共有靶點輸入String 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)模型，最小相互作用閾值設(shè)定“custom value”（＞0.40），得到PPI 網(wǎng)絡(luò)；并對PPI 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)進行網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析。

1.3 GO 功能和KEGG 通路富集分析及構(gòu)建“化合物-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖 運用R 4.1.3 軟件及“org.Hs.eg.db”“enrichplot”“ggplot2”等安裝包對共有靶點進行GO 功能與KEGG 富集通路分析，設(shè)置P＜0.05；并使用在線作圖平臺微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）對其進行可視化處理。使用Cytoscape3.7.2 軟件對共有靶點和KEGG 通路富集的結(jié)果進行“化合物-靶點-信號通路”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建。

1.4 分子對接 將DMY 與15 個作用靶點進行分子對接驗證，通過PubChem 數(shù)據(jù)庫、Chem Bio3D Ultra 14.0 軟件獲得DMY 的3D 結(jié)構(gòu)；利用PDB 數(shù)據(jù)庫下載15 個靶點蛋白，利用PyMOL 2.4.0 軟件和Auto Dock Tools 1.5.6、Autodock Vina 軟件對作用靶點和DMY 進行常規(guī)處理及分子對接。

2 結(jié)果

2.1 化合物預(yù)測和疾病靶點的篩選的結(jié)果 在Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫靶點預(yù)測得到化合物100 個靶點，經(jīng)篩選后最終得到70 個靶點。GeneCards 數(shù)據(jù)庫1903 個靶點，NCBI 數(shù)據(jù)庫569 個靶點，最終疾病靶點為2248 個靶點。

2.2 PPI 網(wǎng)絡(luò)結(jié)果 化合物靶點與疾病的靶點取交集后得到15 個共有靶點，通過在String 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的PPI 網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，共有15 個節(jié)點，32 條邊，其中每個節(jié)點表示蛋白，每條邊表示不同蛋白之間的相互作用，見圖1。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析Degree值排名的結(jié)果可知HIF1A、KDR、APP 等排名較前，見表1。

表1 PPI 網(wǎng)絡(luò)靶點的拓撲分析

圖1 化合物疾病交集圖與PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 GO 功能和KEGG 通路富集分析及“化合物-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖 GO 功能富集分析主要包括生物過程、細胞組成和分子功能。在生物過程方面，共富集916 個結(jié)果，主要包括對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、金屬離子的反應(yīng)等；在細胞組成方面，共富集39 個結(jié)果，主要為膜筏、核點、膠質(zhì)細胞反應(yīng)等；在分子功能方面，共富集72 個結(jié)果，主要為蛋白磷酸酶結(jié)合、跨膜受體蛋白絡(luò)氨酸激酶活性等；排名前15 的GO 功能結(jié)果見圖2。KEGG 富集通路共富集40 條通路結(jié)果，主要為癌癥蛋白聚糖、癌癥、MAPK 等信號通路，排名前10 的KEGG 富集通路結(jié)果見圖3。通過“化合物-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖可知，不同靶點與通路之間有著相互作用，圖中各連線表示靶點與通路直接的聯(lián)系，靶點越大表示其富集的通路越多，DMY 與線粒體自噬存在多靶點、多通路的相互作用關(guān)系，見圖4。

圖2 GO 功能富集分析

圖4 “化合物-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 分子對接結(jié)果 將DMY 與15 個作用靶點進行分子對接驗證，結(jié)果表明DMY 均能與15 個靶點結(jié)合，其中與FGFR1 結(jié)合效果最佳，與PPARG 的結(jié)合效果次之，見表2、圖5。

表2 DMY 與15 個作用靶點對接結(jié)合能（kcal/mol）

圖5 分子對接圖

3 討論

本研究PPI 網(wǎng)絡(luò)的拓撲分析結(jié)果顯示，HIF1A、KDR、APP 等靶點關(guān)聯(lián)度較高。有研究發(fā)現(xiàn)[6，7]，DMY可介導(dǎo)HIF1A 的表達降低，而HIF1A 是HIF-1 的活性亞基，HIF-1 可以通過多種方面控制線粒體的活性，是缺氧誘導(dǎo)的線粒體自噬的中樞調(diào)劑。KDR也稱血管內(nèi)皮生長因子受體-2（VEGFA-2），屬于血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFA）的一種，DMY 在影響胃癌細胞VEGFA 表達的同時可抑制KDR 在血管內(nèi)皮細胞中的表達[8，9]。此外，KDR 與可溶性蛋白聚糖相互作用，引起乳腺癌細胞線粒體自噬[10]。APP與Tau 對線粒體自噬具有協(xié)同作用，而DMY 可影響APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶力[11，12]。由此可知，HIF1A、KDR、APP 等靶點與DMY 和線粒體自噬密切相關(guān)。

本研究中GO 功能富集和KEGG 富集通路結(jié)果顯示，DMY 與線粒體自噬的生物過程主要富集于對氧化應(yīng)激、金屬離子等的反應(yīng)，分子功能主要富集為蛋白磷酸酶結(jié)合、跨膜受體蛋白絡(luò)氨酸激酶活性等；DMY 與線粒體自噬富集于癌癥蛋白聚糖、癌癥、MAPK 等40 條信號通路上。有研究發(fā)現(xiàn)[13，14]，氧化應(yīng)激與線粒體自噬具有相互作用，氧化應(yīng)激受損可加強線粒體的自噬程度，而線粒體自噬在一定程度上能調(diào)節(jié)抗氧化的水平，而DMY 可通過調(diào)節(jié)細胞凋亡的線粒體而保護內(nèi)皮細胞，使其不受氧化應(yīng)激。另有研究表明[15，16]，腦出血時，周圍組織的氧化應(yīng)激和離子紊亂會影響活性氧含量、線粒體膜電位，從而導(dǎo)致線粒體外膜去極化，引起PINK1/Parkin 通路誘導(dǎo)的線粒體自噬；而DMY 可以與銅、鋅等多種金屬離子發(fā)生反應(yīng)，增強DMY 抑菌殺菌、抗氧化的作用。另外，MAPKA/AERK/CREB 信號通路可調(diào)節(jié)MFN2 相關(guān)的線粒體自噬[17]；MAPK 通路中的JNK信號通路參與調(diào)控多種細胞活動，其中JNK 蛋白激酶中的JNK2 可誘導(dǎo)線粒體自噬，保護組織器官的損傷[18]；p38MAPK/STAT3 信號通路可通過抑制線粒體自噬改善胰島素分泌[19，20]。

綜上所述，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)對DMY 與線粒體自噬的機制進行探討，預(yù)測得到DMY 可能通過作用于HIF1A、KDR、APP 等多個靶點，調(diào)控癌癥蛋白聚糖、癌癥、MAPK 等多信號通路，改善對氧化應(yīng)激、金屬離子等的反應(yīng)，從而參與線粒體自噬。