馮 笛,張凡利,金尚忠

(中國計量大學 光學與電子科技學院,浙江 杭州 310018)

葡萄糖是自然界分布最廣且最重要的一種單糖,也是活細胞的直接能量來源。人體中葡萄糖含量不足會導致低血糖,嚴重時或致記憶力衰退、誘發(fā)癲癇、影響大腦活動致使昏迷等,但可通過改善飲食條件在短期內獲得補充。而葡萄糖含量過多則會引發(fā)糖尿病及其并發(fā)癥等。據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)統(tǒng)計,2021年全球糖尿病人數(shù)約為5.37億(20～79歲),其中中國就有約1.4億。糖尿病可引起約100多種并發(fā)癥,如心肌梗死、視網(wǎng)膜病變、糖尿病足等。據(jù)統(tǒng)計,近年來死于糖尿病及其并發(fā)癥的人數(shù)已超過死于艾滋病、結核病和瘧疾等人數(shù)的總和。而治療糖尿病最重要的也是第一步便是監(jiān)測血糖水平,這將極大地提高患者的生活質量,并有助于患者了解自身狀況及預防并發(fā)癥。

1 葡萄糖檢測方法概述

1.1 酶促方法

目前檢測葡萄糖的臨床方法是血糖檢測,血液樣本被提供在含有氧化酶的條帶或底物上,一般是血糖試紙,然后通過測量酶底物的電學或光學變化來監(jiān)測反應通量。這種方法是侵入性的,其不僅造成了生理上的損傷和心理負擔,而且血檢可能造成疾病傳播、保存追溯時效短、需要專業(yè)的醫(yī)護人員操作等。尿糖檢測雖然無損,但可能會造成假陽性和假陰性的結果。目前家用式自測血糖儀的成熟使得血糖監(jiān)測更加方便,但也存在一些缺點,如修飾有氧化酶的試紙壽命一般為兩年,環(huán)境壓力、溫度、氧化等會導致其壽命進一步縮短,且不洗手操作會進一步降低測量準確性。另外,在自行測試規(guī)范且試紙質量沒問題的情況下,大量不符合標準的血糖儀被生產(chǎn)出來并投入使用導致檢測結果的精度很差。

1.2 非酶促方法

基于酶促反應的葡萄糖檢測雖然對葡萄糖是特異性的,但是需要定期更換底物和酶等原料。非酶促葡萄糖檢測也是研究的焦點,因為它們增加了檢測的穩(wěn)定性和檢測精度并降低了維護成本[1-3],并有可能無創(chuàng)地檢測葡萄糖[4]。非酶促葡萄糖檢測可分為兩種:基于人工酶的電化學檢測和物理檢測。人工酶與電化學檢測相結合類似于酶促方法,但使用專門的電極表面來代替酶,主要是通過葡萄糖分子和電極之間的電子轉移的直流電測量來檢測葡萄糖濃度[4-6]。物理檢測葡萄糖是基于檢測葡萄糖分子的特定性質,通常是用頻率分辨技術和光譜學來完成的。頻率分辨技術如阻抗和太赫茲光譜等,這些技術監(jiān)測樣品對調制電場的響應[7]。光譜學方法包括紅外、熒光和拉曼光譜。光譜學檢測是由于光與分子的相互作用對其化學結構非常特定,入射到樣品上的光可能被吸收、透射、反射或散射。

1.3 光譜學方法

熒光光譜是通過光激發(fā)分子來監(jiān)測可見光的發(fā)射,然而葡萄糖分子不具有熒光特性,因此須和熒光分子結合來檢測。在和葡萄糖的相互作用下熒光分子的發(fā)射波長會改變,通過信號的變化檢測葡萄糖的濃度[8-10]。紅外光譜研究分子振動對紅外波段范圍內輻射的吸收,分子吸收的波長對應于分子化學鍵特定振動和旋轉的能量。葡萄糖的紅外光譜檢測具有一些困難和挑戰(zhàn),因為水的吸收峰掩蓋了葡萄糖分子的信號[7,11-12]。拉曼光譜是通過用激光激發(fā)樣品并檢測拉曼散射光來完成的。雖然拉曼信號比紅外弱,但水在拉曼光譜中沒有突出的特征,紅外是在透射中進行的,需要在紅外波長范圍內透明的基底,而拉曼光譜測量散射光,因此可以在任何表面上進行,這就使得可以使用增強拉曼信號的專用基底,也就是表面增強拉曼光譜(surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS)技術。SERS在此所用到的增強機理主要是表面等離激元共振(SPR)[13],它的解釋是處于貴金屬納米粒子之間的局域光電場中(即“熱點”)的物質,其拉曼信號會被增強約105～106倍。

1.4 SERS檢測葡萄糖的方案

SERS由于其高靈敏和指紋識別的特點,在克服了拉曼光譜缺陷的基礎上已被廣泛應用在生物醫(yī)學[14-15]、食品安全[16-17]、環(huán)境監(jiān)測[18-19]等領域?；赟ERS檢測葡萄糖總體來說有四種方案,已有眾多科研工作者做出了努力。第一,制備增強因子很高的基底,使得葡萄糖分子的振動信息可直接被極大增強,所測信號也是葡萄糖分子本身的SERS信號[20]。第二,增加葡萄糖分子與基底結合的親和力[21]。這兩種方案都是針對葡萄糖分子拉曼散射截面小而做出的應對方法,雖然也取得了一定的成果,但在實際應用中依然存在局限性。第三,應用基于硼酸的識別分子功能化表面,葡萄糖可逆地形成硼酸酯,并被捕獲在表面上。這樣,硼酸分子既可以用作葡萄糖識別結構,也可以用作拉曼活性分子[22]。第四,基于信號分子的酶促反應[23-25],葡萄糖與葡萄糖氧化酶(GOx)反應產(chǎn)生的H2O2會刻蝕修飾有信號分子的銀納米粒子,進而導致信號分子的SERS信號降低,葡萄糖的摩爾濃度與信號分子的SERS信號呈現(xiàn)反比。這種方案也是目前基于SERS檢測葡萄糖的主流方案,本文也基于此開發(fā)了一種銀立方體(Ag cube)基底和酶促反應相結合的汗液中葡萄糖快檢的方法,檢測時間約為7 min,檢測限為0.5 mmol/L。

2 材料與方法

2.1 材料

人工汗液購自上海源葉生物科技有限公司;GOx購自北京索萊寶科技有限公司;葡萄糖、PVP(55 000)、1,5-戊二醇、CuCl2、AgNO3購自中國國藥集團化學試劑有限公司;去離子水(18.25 MΩ·cm)。

2.2 Ag cube的合成

溶液a:CuCl2溶液,稱取18 mg的CuCl2溶于50 mL的1,5-戊二醇;溶液b:AgNO3溶液,稱取0.4 g的AgNO3溶于含1 mL溶液a和9 mL的1,5-戊二醇中;溶液c:PVP溶液,稱取0.2 g的PVP(Mw=55 000)溶于10 mL的戊二醇中。溶液b和溶液c需要在冰浴中超聲溶解4 h以上,直至完全溶解,超聲過程中保持冰浴,每隔15 min取出攪拌一下。其中溶液a可配于離心管中,溶液b和c用25 mL錐形瓶配制。

Ag cube制備:首先取干凈烘干的圓底燒瓶加入20 mL的1,5-戊二醇,在193 ℃中恒溫10 min;然后取兩只10 mL注射器,吸入適量的溶液b和溶液c,套上200 μL槍頭和聚四氟管,放在雙通道注射泵上;以500 μL/min的速率開始向恒溫好的戊二醇中滴加溶液b和c;觀察到溶液顏色由無色→淡黃→深黃→暗紅→紅色上面出現(xiàn)灰綠色,根據(jù)灰綠色占液面總面積來判斷粒徑大小(本文平均粒徑為98 nm左右),到所需粒徑大小后,取出反應瓶,冰浴使反應迅速停止,整個滴加過程需要計時。

2.3 Ag cube上修飾信號分子4-MBA

取200 μL Ag cube膠體并加入800 μL無水乙醇,超聲使其分散均勻,然后6 000 r/min離心8 min;吸取上層清液,并加入1 000 μL無水乙醇如此離心清洗2次,然后用無水乙醇重新定容至1 000 μL;加入100 μL濃度為1 mmol/L的4-MBA(4-MBA配制在無水乙醇中),放置在金屬輪盤上旋轉孵育12 h;孵育結束后,6 000 r/min離心8 min,吸取上層清液,然后用1 000 μL去離子水清洗一次,并再次用水定容至1 000 μL,放置到4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.4 儀器

使用了日立電子掃描顯微鏡(SEM, HITACHI S-4800, Japan)和便攜式拉曼光譜儀(NTR 785 RP2)。

2.5 葡萄糖檢測原理

基于SERS結合酶促反應檢測葡萄糖的原理見圖1,圖中立方體代表Ag cube,其上修飾有信號分子4-MBA(4-巰基苯甲酸,C7H6O2S)。Ag cube的棱角較多,粒子之間產(chǎn)生的熱點多,當Ag cube膠體與含有葡萄糖的溶液混合并有GOx加入時,會有式(1)所示的反應發(fā)生,葡萄糖在GOx的作用下產(chǎn)生葡萄糖酸和H2O2,隨后會發(fā)生式(2)所示的反應,H2O2刻蝕Ag cube產(chǎn)生Ag+。使得棱角分明的Ag cube會在H2O2的刻蝕下變得相對圓滑甚至H2O2足夠多的情況下,Ag cube會完全消失。這意味著Ag cube上修飾的4-MBA的SERS信號也會因為熱點變少而減弱。也即當GOx足量時,葡萄糖越多,4-MBA的SERS信號越低,二者呈反比,可通過4-MBA的信號間接反映葡萄糖的含量。4-MBA的SERS特征峰為1 077 cm-1(與芳香環(huán)呼吸、對稱C—H面內彎曲和C—S拉伸有關)和1 587 cm-1(由環(huán)C—C拉伸和不對稱C—H面內彎曲引起)[26]。

圖1 基于SERS快速檢測葡萄糖的示意圖Figure 1 Schematic diagram of rapid glucose detection based on SERS

(1)

(2)

2.6 葡萄糖溶液的配制

首先配制100 mmol/L的葡萄糖水溶液,然后繼續(xù)用水逐級稀釋至10、5、2.5、1、0.5、0.25、0.1、0.05 mmol/L備用。用人工汗液稀釋100 mmol/L的葡萄糖水溶液得到10 mmol/L的葡萄糖溶液,然后繼續(xù)用人工汗液逐級稀釋至5、2.5、1、0.5、0.25、0.1、0.05 mmol/L備用。

3 結果和討論

3.1 預實驗

基于檢測葡萄糖的原理,需證明上述等式的成立,即4-MBA的SERS信號的降低是由葡萄糖和GOx之間反應而產(chǎn)生H2O2刻蝕Ag cube所引起的。設計了對照實驗:空白1是200 μL水加入30 μL的Ag cube膠體和50 μL的1 mg/mL的GOx,空白2是200 μL的10 mmol/L的葡萄糖溶液加入30 μL的Ag cube膠體和50 μL的水。而對照實驗是200 μL的10 mmol/L的葡萄糖溶液加入30 μL的Ag cube膠體和50 μL的1 mg/mL的GOx。分別在40 min內每隔10 min觀察4-MBA的1 587 cm-1處峰面積的變化,如圖2(所有峰面積均通過積分獲得)?？瞻?和2在40 min內沒有發(fā)生較大變化,而對照實驗其SERS信號在不斷降低。說明4-MBA的SERS信號的降低是由葡萄糖和GOx的同時存在并發(fā)生反應產(chǎn)生H2O2刻蝕Ag cube引起的。另外,對被刻蝕前后的Ag cube的形貌進行了SEM表征,如圖3,反應后的Ag cube確實有被明顯刻蝕的現(xiàn)象。

圖2 葡萄糖和GOx是否發(fā)生反應的驗證實驗Figure 2 Validation experiment for glucose and GOx reaction

圖3 Ag cube被刻蝕前后的SEM圖Figure 3 SEM diagram of the Ag cube before and after it is etched

3.2 檢測條件優(yōu)化

在預實驗中,葡萄糖和GOx之間反應的持續(xù)時間較長,因為這是一種需要酶參與的酶促反應,所以考慮加快此反應,使其在短時間內反應完全。加快式(1)所示的反應可從GOx的作用條件出發(fā),因為GOx的氧化能力是通過活性單位U來定義的,1 U代表在37 ℃,pH=5.7的條件下,1 min形成1 μmol H2O2所需的酶量。首先考慮高濃度GOx是否可加快反應。其次,從GOx的作用條件出發(fā),如溫度,pH等。最后,Ag cube膠體的體積也很重要,體積太大,式(1)產(chǎn)生的H2O2不足以引起4-MBA信號的明顯變化,體積太小,采集光譜時又需增加過多的積分時間。

首先,探究了GOx濃度增加時體系反應至穩(wěn)定所需的時間,因為減少其濃度時必定需要更多的時間。在預實驗中,所用GOx的濃度為1 mg/mL,反應至40 min時4-MBA的SERS信號基本穩(wěn)定不變。而GOx的濃度增加至5 mg/mL時,反應穩(wěn)定的時間減少至10 min,如圖4(a)(所有與圖4對應的光譜圖如圖5),表明增加濃度可以加快反應,但在考慮成本的情況下并沒有繼續(xù)探究更高濃度GOx的情況。

圖4 優(yōu)化檢測條件Figure 4 Optimize detection conditions

圖5 與圖4相對應的SERS光譜圖Figure 5 SERS spectrum corresponding to Figure 4

其次,驗證了將溫度加熱至37 ℃時和不加熱時的區(qū)別。雖然GOx在37～50 ℃時都具有熱穩(wěn)定性,但最佳溫度是37 ℃,且此溫度與人體的體溫最接近,所以沒有探究其他溫度。如圖4(b),設計了空白和10 mmol/L葡萄糖溶液分別在室溫和37 ℃加熱3 min下的實驗。可以看出,37 ℃加熱情況下,4-MBA的SERS信號在3 min后明顯下降了很多,而不加熱的情況下僅有相對較弱的下降,所以后續(xù)實驗都將采取37 ℃加熱。然后探究了體系pH的影響,通過添加緩沖液(檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液)調節(jié)pH,發(fā)現(xiàn)添加緩沖液會造成Ag cube團聚,以致4-MBA的SERS信號不穩(wěn)定。因為緩沖液中存在很多鹽離子,使Ag cube的團聚不可控,引起了4-MBA的SERS信號忽高忽低,毫無規(guī)律,如圖4(c)。經(jīng)調研,GOx在pH為4.5～6.5時均可保持相對穩(wěn)定,所以后續(xù)實驗不再加入緩沖液調節(jié)pH,因為水的pH在6.5左右,也可維持GOx的穩(wěn)定。

最后探究了Ag cube的體積。根據(jù)以上條件優(yōu)化中的經(jīng)驗,探索了Ag cube的體積分別為12.5、25、50、100 μL的情況。如圖4(d),隨著Ag cube的體積的增加,4-MBA的信號無論是空白還是濃度為10 mmol/L的葡萄糖溶液都是增加的,這是符合規(guī)律的,計算空白光譜和10 mmol/L葡萄糖溶液的特征峰面積的比值,比值越大,說明葡萄糖和GOx產(chǎn)生的H2O2取得了最佳的刻蝕效果(因為產(chǎn)生的H2O2量是固定的)。所以,最佳的Ag cube體積為25 μL。

3.3 葡糖糖水溶液的檢測限

上述優(yōu)化過程中均采用溶膠法,即直接采集整個反應溶液的SERS光譜,但檢測限(LOD)卻并不理想。后嘗試芯片法進行測試,吸取3 μL溶膠反應液滴到渡有金膜的硅片(簡稱芯片)上,但直接采集液滴的SERS光譜與溶膠法一樣效果不佳。所以,考慮將3 μL的液滴烘干,以此規(guī)避掉液體的影響。實驗證明LOD大大降低,同時也對優(yōu)化條件進行了微調,微調后的條件及順序如下:200 μL不同濃度的葡糖糖水溶液、20 μL的Ag cube、30 μL的GOx(5 mg/mL),充分混勻后在金屬加熱平臺中38 ℃加熱3 min,然后吸取3 μL反應溶液滴加到芯片上,將芯片放置到50 ℃加熱臺上烘干,需要6 min。最后,積分2 s采集已烘干芯片的SERS光譜。加上操作步驟需9～10 min,為節(jié)省時間,嘗試不用金屬加熱平臺加熱3 min,直接混勻便吸取3 μL滴加到50 ℃加熱臺上烘干,取得了相同的實驗效果,7 min即可完成檢測。如圖6,誤差棒由3次平行實驗獲得,光譜圖右側為與之相對應的葡萄糖的摩爾濃度,葡萄糖水溶液的LOD為0.1 mmol/L。對葡萄糖的對數(shù)濃度和1 077 cm-1的峰面積做了線性擬合,如圖7(小圖為葡萄糖原始濃度與1 077 cm-1峰面積的濃度曲線),R2為0.95,線性效果良好。

圖6 葡萄糖水溶液的檢測限Figure 6 LOD for aqueous glucose solutions

圖7 葡萄糖水溶液的對數(shù)濃度與4-MBA 1 077 cm-1處SERS峰面積的擬合曲線Figure 7 Fitting curve of the logarithmic concentration of glucose aqueous solution to the SERS peak area at 1 077 cm-1 of 4-MBA

3.4 葡萄糖在人工汗液中的檢測限

在關于pH優(yōu)化中便提到,鹽類物質會引起Ag cube的團聚不可控,汗液中同樣存在大量鹽類物質,若不對汗液進行前處理,則無法得到理想的結果。在加熱烘干后,金膜上會出現(xiàn)白色析出物,這正是汗液中存在的大量鹽類物質。從快速檢測的目標出發(fā),汗液的前處理不能是復雜且耗時的,首先想到也是最簡單的方法是稀釋汗液。

在此,把加標后葡萄糖濃度為10 mmol/L的汗液和水分別按照1∶1、1∶2、1∶3和1∶4的比例進行稀釋,按照優(yōu)化的條件和步驟進行測試,結果如圖8,當汗液和水的比例為1∶3和1∶4時獲得了良好效果,不僅誤差較小,而且空白光譜和10 mmol/L葡萄糖的汗液有較好的區(qū)分。但汗液與水的比例為1∶3時是最優(yōu)的,因為稀釋倍數(shù)越多,原始汗液中的葡萄糖也被稀釋越多,產(chǎn)生的H2O2就越少,空白光譜和汗液光譜就越難區(qū)分。

圖8 人工汗液的稀釋倍數(shù)探究Figure 8 Exploration of dilution factor of artificial sweat

在此基礎上,葡萄糖濃度則相應被稀釋了4倍,但只關注葡萄糖原始濃度。如圖9,汗液中葡萄糖的LOD為0.5 mmol/L,而葡萄糖水溶液的LOD為0.1 mmol/L,因為汗液中的葡萄糖被稀釋至原來的4倍。人體正常的血糖濃度空腹時為3.9～6.1 mmol/L,餐后2 h為4.4～7.8 mmol/L,而糖尿病患者的這一數(shù)值要高得多,一般空腹時大于7.1 mmol/L,餐后2 h大于11.1 mmol/L。而人體汗液中的葡萄糖含量很低,約為血糖濃度的1%～2%(對于糖尿病患者,空腹時則大于0.071 mmol/L,餐后2 h大于0.11 mmol/L),或為0.06～0.2 mmol/L,兩者的差距不大[27]。本文的方法僅能檢測到0.5 mmol/L,相差約2.5～8.3倍,距離汗液中葡萄糖的濃度范圍相差不到1個數(shù)量級,原因是還有很多條件未優(yōu)化,如信號分子4-MBA與Ag cube的孵育時間、Ag cube的粒徑大小、汗液稀釋倍數(shù)的詳細優(yōu)化等。

圖9 葡萄糖在人工汗液中的檢測限Figure 9 LOD of glucose detection in artificial sweat

4 結 語

本文基于SERS并利用葡萄糖和GOx之間的反應產(chǎn)生H2O2刻蝕Ag cube引起4-MBA SERS信號的變化來間接檢測汗液中的葡萄糖。首先驗證了葡萄糖和GOx之間反應的可靠性。其次優(yōu)化了GOx的濃度、環(huán)境溫度、體系pH以及Ag cube膠體的體積對測試靈敏度的影響。得到了葡萄糖水溶液的LOD為0.1 mmol/L,檢測時間為7 min。最后,對汗液進行了稀釋操作,汗液中葡萄糖的LOD為0.5 mmol/L,距離汗液中葡萄糖濃度還相差不到1個數(shù)量級,但糖尿病患者往往汗液中葡萄糖濃度較高,所以此方法是初步成功的。這為糖尿病患者提供了一種快速無損的葡萄糖檢測方式。