崔宏恩,馮 速,葉人元,劉 陽,方 帥,朱茂林,樊曉琳

(1.江蘇省計量科學(xué)研究院,江蘇 南京 210023;2.南京諾唯贊生物科技股份有限公司,江蘇 南京 210000)

脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(Lp-PLA2)是磷脂酶A2超家族成員,由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或T細(xì)胞分泌,Lp-PLA2由441個氨基酸殘基組成,相對分子質(zhì)量為45.4 ku。Lp-PLA2進(jìn)入血液循環(huán)后主要與低密度脂蛋白結(jié)合,可產(chǎn)生促炎分子如溶血磷脂酰膽堿和氧化游離脂肪酸[1-3]。Lp-PLA2是血管內(nèi)皮炎癥的特異性指標(biāo),其在血液中的含量能夠反映動脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度,能夠獨(dú)立預(yù)測經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(PCI)術(shù)后冠心病及不良心血管事件(MACE)的風(fēng)險,從而降低心腦血管患者或高危人群突發(fā)心梗/腦梗等嚴(yán)重不良事件的發(fā)生概率[4-7]。

目前測定Lp-PLA2的方法有很多種,可因無統(tǒng)一的校準(zhǔn)品,所以各種方法測定的結(jié)果沒有統(tǒng)一的判斷標(biāo)準(zhǔn),對臨床應(yīng)用造成一定的影響[8]。根據(jù)ISO17511:2020要求[9],為了保證Lp-PLA2測定結(jié)果的準(zhǔn)確可比,必須建立可溯源的Lp-PLA2純品含量測定方法。目前,純蛋白的定量方法主要有氨基酸分析、質(zhì)量平衡、定量核磁和同位素稀釋質(zhì)譜法[10-11]。氨基酸分析涉及的多種分析方法在生物化學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、食品科學(xué)、化工等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[12]。本文通過對基于柱前衍生的氨基酸分析方法進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)[13-14],以可溯源到SI單位的氨基酸混合溶液國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn),以滿足臨床檢驗(yàn)的需求。

本文首先采用SDS-PAGE和質(zhì)譜對Lp-PLA2純品進(jìn)行純度表征、相對分子質(zhì)量測定和蛋白質(zhì)鑒定,然后對Lp-PLA2酸水解、柱前衍生化和色譜條件等進(jìn)行優(yōu)化,建立起Lp-PLA2純品蛋白含量的柱前衍生超高效液相色譜(UPLC)測定方法。另外,以高效液相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜(HPLC-IDMS)方法(目前公認(rèn)用于蛋白含量測定的基準(zhǔn)方法)測定結(jié)果作為參照進(jìn)行對比,考察所建立柱前衍生UPLC方法的方法學(xué)參數(shù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

超高效液相色譜儀(Acquity,美國Waters公司),配自動進(jìn)樣器和紫外檢測器;超高效液相色譜儀(EASY-nLC 1200,美國Thermo公司);質(zhì)譜儀(Orbitrap Fusion Lumos Tribrid,美國Thermo公司);電泳儀(美國Bio-Rad公司);天平(ME235S,分度值0.01 mg,德國Satorius公司);常溫高速離心機(jī)(pico7,美國Thermo公司);pH計(FE28,美國METTLER TOLEDO公司)移液器(10 μL,100 μL,200 μL,1 000 μL,美國Thermo公司);超純水系統(tǒng)(GOKU-BI,廈門銳思捷水純化技術(shù)有限公司);集熱式恒溫加熱攪拌器(DF-101S,上海予華儀器有限公司);超聲波清洗機(jī)(XO-5200DTS—10L-300W,南京先歐儀器制造有限公司);循環(huán)水真空泵(SHZ-D(III),上海予華儀器有限公司)。

1.2 試劑

氨基酸混合溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW(E)100062,中國計量科學(xué)研究院);6-氨基喹啉基-N-琥珀酰-亞胺基甲酸酯(AQC)衍生劑(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);三氟乙酸(色譜純,美國Sigma-Aldirich公司);甲酸(色譜純,德國Fluka公司);乙腈(色譜純,美國Sigma-Aldirich公司);蛋白質(zhì)電泳預(yù)制膠(12%,常州天地人和生物科技有限公司);10×SDS緩沖溶液(南京諾唯贊生物科技股份有限公司);彩虹預(yù)染寬分子量蛋白Marker(14-99 ku,日本TAKARA公司);胰蛋白酶(美國Promega公司);二硫蘇糖醇(DTT,美國Sigma-Aldirich公司);碘乙酰胺(瑞典Amersham公司);碳酸氫銨(IAM,美國Sigma-Aldirich公司);天冬酰胺粉末、谷氨酰胺粉末、色氨酸粉末、半胱氨酸粉末(美國Sigma-Aldirich公司);無水乙酸鈉(色譜純,美國Sigma-Aldirich公司);三乙胺(色譜純,南京化學(xué)工業(yè)公司);乙二胺四乙酸二鈉(色譜純,美國Sigma-Aldirich公司);硼酸(色譜純,美國Sigma-Aldirich公司);三氯乙酸(色譜純,北京國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);醋酸(色譜純,上海滬試試劑有限公司);氫氧化鈉(色譜純,北京國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);鹽酸(色譜純,南京化學(xué)工業(yè)公司);甲醇(色譜純,美國TEDIA公司);γ-氨基丁酸(色譜純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);10 kd過濾離心管(德國Satorius公司),其余試劑均為分析純。

2 Lp-PLA2基本性質(zhì)表征

2.1 SDS-PAGE純度測定

將Lp-PLA2樣品(以南京諾唯贊生物科技有限公司提供的人源重組Lp-PLA2純品為原料分裝于合適的管中)與5×loading buffer(含β-巰基乙醇)在一個1.5 mL離心管中按4∶1的體積比混合?；靹蚝笊w緊管蓋。在電磁爐沸水中煮沸5 min,完全冷卻后瞬時離心5 s。用10 μL移液器吸取樣品進(jìn)行上樣,在相應(yīng)加樣孔加入5 μL相對分子質(zhì)量蛋白Marker。將電壓調(diào)至80～100 V,待樣品中溴酚藍(lán)指示帶電泳至分離膠位置(約200 min);再以160～200 V電壓將溴酚藍(lán)指示帶電泳至距玻板最下方約5 mm處停止電泳,時間約30 min。分析結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)染色1 h時,加脫色液(水、甲醇和冰醋酸以5∶4∶1的比例配制)過夜脫色。

2.2 相對分子質(zhì)量測定和蛋白質(zhì)鑒定

2.2.1 樣本前處理

取離心后的Lp-PLA2上清樣品加入到10 kd超濾離心管中,10 000 r/min離心20 min;而后加入5 mmol/L DTT常溫反應(yīng)25 min;加入0.5 mol/L IAM至終濃度為14 mmol/L,避光反應(yīng)30 min后再次10 000 r/min離心20 min;加入100 μL的50 mmol/L碳酸氫銨后10 000 r/min離心20 min;更換新的套管,濾膜上加入含有1 μg胰酶的100 μL的50 mmol/L碳酸氫銨,37 ℃酶解16～18 h。過夜酶解的肽段離心加酸終止酶解,用C18柱除鹽后真空冷凍干燥。

2.2.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析[15]

取肽段粉末,使用體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸復(fù)溶后使用EASY-nLC 1200超高效液相儀進(jìn)行洗脫分析。流動相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液;流動相B為含0.1%甲酸的乙腈溶液。洗脫梯度:3%～5%B,5 s;5%～15%B,40 min;15%～28%B,34 min 50 s;28%～38%B,12 min;38%B～100%B,5 s;100%B,8 min;流速300 nL/min。肽段經(jīng)洗脫電離后串聯(lián)至Orbitrap Fusion Lumos Tribrid質(zhì)譜進(jìn)行分析。離子源電壓設(shè)置為2.2 kV,肽段母離子及其二級碎片都使用高分辨的Orbitrap進(jìn)行檢測和分析。一級質(zhì)譜掃描范圍設(shè)置為350～1 500m/z,掃描分辨率設(shè)置為60 000;二級掃描分辨率設(shè)置為15 000。數(shù)據(jù)采集模式使用數(shù)據(jù)依賴型掃描DDA,HCD碰撞池使用30%的碎裂能量進(jìn)行碎裂,串聯(lián)質(zhì)譜掃描的動態(tài)排除時間設(shè)置為30 s,相對分子質(zhì)量平行測定6次。

2.2.3 數(shù)據(jù)庫檢索

二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用Proteome Discoverer(v2.4)進(jìn)行檢索。檢索參數(shù)設(shè)置:數(shù)據(jù)庫使用Uniprot-homo-sapiens-proteome_UP000005640和uniprot_mouse_proteome_UP000000589(2021.04),酶切方式設(shè)置為Trypsin/P;漏切位點(diǎn)數(shù)設(shè)為2;肽段最小長度設(shè)置為6個氨基酸殘基;將半胱氨酸烷基化設(shè)置為固定修飾,將甲硫氨酸的氧化,蛋白N端的乙酰化作為可變修飾。

3 柱前衍生-UPLC測定Lp-PLA2蛋白含量[16]

3.1 Lp-PLA2樣品的水解

向待測Lp-PLA2樣品加入6 mol/L的鹽酸,使用氮吹儀排盡空氣后密封,在(110.0±0.5)℃的烘箱中進(jìn)行水解,通過對水解時間進(jìn)行優(yōu)化后,選取96 h作為該樣品最優(yōu)水解時間,取出平衡至室溫后通過氮?dú)獯蹈善渲械柠}酸,然后加入1 000 μL 0.01 mol/L的鹽酸復(fù)溶。

3.2 配制內(nèi)標(biāo)工作液

經(jīng)過優(yōu)化,選擇γ-氨基丁酸作為內(nèi)標(biāo),以確保樣品峰附近沒有雜質(zhì)峰的出現(xiàn),不會對樣品峰形成干擾,且和樣品分離完全,保留時間相差不大。首先,稱取10 g三氯乙酸,溶解于100 mL超純水中形成10%三氯乙酸溶液。然后,稱取2.062 4 mgγ-氨基丁酸,使用100 mL10%三氯乙酸溶液溶解成200 μmol/Lγ-氨基丁酸溶液,即內(nèi)標(biāo)工作液。

3.3 配制混合標(biāo)準(zhǔn)工作液

首先,分別使用0.1 mol/L鹽酸將天冬酰胺、谷氨酰胺、色氨酸、半胱氨酸配制成10 mmol/L單標(biāo)儲備液(通過優(yōu)化,配制單標(biāo)儲備液,是為了便于觀察其他氨基酸是否會干擾17種氨基酸)置于2～8 ℃保存,有效期3個月。然后,吸取17種氨基酸混合溶液國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及配置的4種單標(biāo)儲備液,用超純水稀釋成0.5 mmol/L的21種混標(biāo)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作液500 μL置于2 ℃～8 ℃保存,有效期1周。將21種混標(biāo)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋成氨基酸濃度分別為0.02 mmol/L,0.05 mmol/L,0.08 mmol/L,0.10 mmol/L,0.30 mmol/L,0.50 mmol/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

3.4 水解樣品的衍生化

首先,分別吸取各待測Lp-PLA2水解樣品、混合標(biāo)準(zhǔn)工作液200 μL至1.5 mL離心管中。其次,吸取內(nèi)標(biāo)工作液200 μL至以上各離心管中。再次,將各離心管于8 000～10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min。最后,吸取各離心管離心后的上清液10 μL、70 μL硼酸緩沖液、20 μL AQC衍生溶液(經(jīng)過比較和優(yōu)化,以AQC作為柱前衍生劑),于55 ℃水浴10 min。溶液過0.22 μm濾膜后入進(jìn)樣小瓶待測。

3.5 UPLC分析

經(jīng)優(yōu)化,確定如下色譜條件:色譜柱YMC-Triart C18 250×4.6 mm S-5 μm,12 nm,流動相A為17 mmol/L三乙胺(pH=5.65)+140 mmol/L乙酸鈉+1 mg/L乙二胺四乙酸二鈉溶液;流動相B為乙腈,柱溫為30 ℃,進(jìn)樣體積為5 μL,檢測波長為248 nm,流速為1.0 mL/min。UPLC流動相梯度洗脫表如表1。

表1 UPLC流動相梯度洗脫表

采用UPLC依次對配制的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和Lp-PLA2樣品溶液進(jìn)行檢測,記錄UPLC信號強(qiáng)度,利用混標(biāo)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作液建立氨基酸濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算Lp-PLA2樣品中各氨基酸濃度。

3.6 結(jié)果計算

根據(jù)如下公式計算待測蛋白的質(zhì)量濃度:

ρR=cA×MR/n。

(1)

其中:ρR為待測蛋白樣品的質(zhì)量濃度,mg/mL;cA為所選擇氨基酸的物質(zhì)的量濃度,mmol/L;MR為待測蛋白樣品的相對分子質(zhì)量;n為待測樣品每個分子中所選擇氨基酸的個數(shù)。

所選擇氨基酸為天冬氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、絲氨酸、酪氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、賴氨酸、丙氨酸、組氨酸、胱氨酸、精氨酸、纈氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸中的任一種或任幾種,所選擇氨基酸為任幾種時,待測樣品中蛋白的質(zhì)量濃度為每種氨基酸計算出的待測樣品中蛋白的質(zhì)量濃度的平均值。計算時選擇的氨基酸種類越多,計算蛋白含量的平均值誤差就越小,實(shí)際可以根據(jù)情況進(jìn)一步選擇17種氨基酸中分離洗脫情況比較好的氨基酸種類進(jìn)行計算。

4 結(jié)果與討論

4.1 Lp-PLA2基本性質(zhì)的表征

4.1.1 SDS-PAGE測定結(jié)果

純品Lp-PLA2的SDS-PAGE電泳測定結(jié)果見圖1,Lp-PLA2條帶位于45.4 ku附近,與構(gòu)建的蛋白相對分子質(zhì)量理論值48.615 35 ku和文獻(xiàn)[1]、[2]報道均一致。

圖1 純品Lp-PLA2的SDS-PAGE電泳純度測定結(jié)果Figure 1 SDS-PAGE electrophoresis purity determination results of pure Lp-PLA2

4.1.2 相對分子質(zhì)量測定和蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果

純品Lp-PLA2的相對分子質(zhì)量測定結(jié)果和酶切后的質(zhì)譜圖分別見圖2和圖3。結(jié)合圖2和圖3,由于Lp-PLA2相對分子質(zhì)量相對較大,離子化效率較差,不易去卷積,未得出完整相對分子質(zhì)量,后續(xù)含量計算時以構(gòu)建的蛋白相對分子質(zhì)量理論值48.615 35 ku為準(zhǔn)。圖3中可見酶切出的肽段,采用Proteome Discoverer(v2.4)軟件在Uniprot-homo-sapiens-proteome_UP000005640和uniprot_mouse_proteome_UP000000589(2021.04)數(shù)據(jù)庫中使用酶切后的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定,結(jié)果表明,所鑒定肽段來自于Lp-PLA2,得分為323.31。

圖2 純品Lp-PLA2的相對分子質(zhì)量測定結(jié)果Figure 2 Relative molecular weight determination of pure Lp-PLA2

圖3 純品Lp-PLA2酶切后的質(zhì)譜圖Figure 3 Mass spectrum after enzymatic digestion of pure Lp-PLA2

4.2 柱前衍生UPLC法評價[10]

本研究以可溯源到SI單位的GBW(E)100062氨基酸混合溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn),建立了Lp-PLA2純品蛋白含量的柱前衍生UPLC測定方法。首先,對柱前衍生UPLC法測定純品Lp-PLA2結(jié)果的不確定度進(jìn)行評定。實(shí)驗(yàn)采用了絲氨酸(Ser)、丙氨酸(Ala)、異亮氨酸(Ile)和賴氨酸(Lys)對蛋白質(zhì)含量分別進(jìn)行測定,并取其平均值,各氨基酸濃度的計算式表示為

cA=Ax×c0/A0。

(2)

式(2)中:cA為待測蛋白樣品中所選擇氨基酸的物質(zhì)的量濃度,mmol/L;Ax為待測蛋白樣品中所選擇氨基酸的色譜峰面積,μV·s;c0為標(biāo)準(zhǔn)工作液中所選擇氨基酸的物質(zhì)的量濃度,mmol/L;A0為標(biāo)準(zhǔn)工作液中所選擇氨基酸的色譜峰面積,μV·s。

因此應(yīng)分別計算各個氨基酸對蛋白質(zhì)定量結(jié)果的不確定度,以Ser為例,測量不確定度的主要來源為稱量、定容、色譜峰面積、水解效率、方法重復(fù)性和氨基酸混合溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[10]。根據(jù)天平的檢定證書及規(guī)程JJG 1036-2022確定稱量的不確定度[17],稱量10 g三氯乙酸、2.062 4 mgγ-氨基丁酸量、氨基酸混合溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(250 mg)及配置的4種單標(biāo)儲備液(25 mg)時的最大允許誤差均為0.015 mg,按照均勻分布,計算得到稱量引入的相對不確定度分量分別為

um=

0.426%。

配制內(nèi)標(biāo)工作液和混合標(biāo)準(zhǔn)工作液定容過程中,使用100 mL單標(biāo)線A級容量瓶2次,10 mL單標(biāo)線A級容量瓶4次,根據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[18],100 mL單標(biāo)線A級容量瓶的最大允許誤差為±0.10 mL,10 mL單標(biāo)線A級容量瓶的最大允許誤差為±0.020 mL,按照三角分布;實(shí)驗(yàn)室溫度為(20±5)℃,水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃,按照均勻分布,則由定容引入的相對不確定度分量uV為

uV=

0.184%。

根據(jù)儀器說明書和積分儀的一般性能指標(biāo)分析,目前用于儀器色譜峰面積積分處理的最大誤差為0.2%～1%,取1%[19],按照均勻分布,則色譜峰面積引入的相對不確定度分量uAx/A0為

按照不確定度A類評定方法評價該方法重復(fù)性引入的不確定度分量,6次重復(fù)測定結(jié)果的RSD為2.48%,因此,測定結(jié)果平均值的重復(fù)性相對不確定度分量ur為

根據(jù)GBW(E)100062氨基酸混合溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書,其中Ser的標(biāo)準(zhǔn)值為0.994 mmol/L,U=0.03 mmol/L(k=2),所以由Ser標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對不確定度分量uSer為

水解效率引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ue均按照1%估算[10],則采用Ser測定蛋白質(zhì)含量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)合成相對不確定度為

uc,Ser=

同樣地,采用Ala、Ile和Lys測定蛋白質(zhì)含量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)合成相對不確定度分別為

uc,Ala=2.28%,uc,Ile=1.98%,uc,Lys=1.98%。

取k=2,最后結(jié)果的擴(kuò)展不確定度為

U=2uc=

方法的擴(kuò)展不確定度為

uk=0.118 3 mg/mL×U=0.002 6 mg/mL。

采用優(yōu)化建立的柱前衍生UPLC方法測定同一Lp-PLA2樣品,重復(fù)測定6次,所得結(jié)果的平均值為0.118 3 mg/mL,RSD為2.48%,可見所建方法重復(fù)性良好。采用優(yōu)化建立的柱前衍生UPLC方法測定6個Lp-PLA2樣品,每個樣品重復(fù)測定3次,所得結(jié)果的平均值為0.118 1 mg/mL,RSD為2.41%,可見所建方法再現(xiàn)性良好。

4.3 與純品Lp-PLA2含量HPLC-IDMS測定結(jié)果的對比分析

取6個純品Lp-PLA2樣品,委托中國計量科學(xué)研究院采用HPLC-IDMS對每個樣品重復(fù)測定3次,實(shí)驗(yàn)采用了纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)和苯丙氨酸(Phe)對蛋白質(zhì)含量分別進(jìn)行測定,并取其平均值。經(jīng)計算,HPLC-IDMS測定的純品Lp-PLA2含量為0.119 4 mg/mL,RSD為4.52%。同時,參照柱前衍生UPLC法不確定度評定思路(不確定度的主要來源為稱量、水解效率、方法重復(fù)性和氨基酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))計算的HPLC-IDMS方法的擴(kuò)展不確定度為1.7%(k=2)。與HPLC-IDMS測定結(jié)果相比純品Lp-PLA2的柱前衍生UPLC法測定結(jié)果具有-0.93%的相對偏差,在柱前衍生UPLC法測定結(jié)果的不確定度范圍內(nèi)。同時,柱前衍生UPLC法與HPLC-IDMS法之間的歸一化偏差( En)值為0.33,說明柱前衍生UPLC法對純品Lp-PLA2的測定結(jié)果相對準(zhǔn)確可靠,以其作為一種補(bǔ)充方法用于純品Lp-PLA2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定量是可行的。

4.4 柱前衍生UPLC方法的檢出限與定量限評價

柱前衍生UPLC方法的檢出限和定量限為

其中:DLOD為檢出限,mg/mL;DLOQ為定量限,mg/mL;cA為標(biāo)準(zhǔn)曲線最小濃度樣品中所選擇氨基酸的物質(zhì)的量濃度,mmol/L;MR為待測蛋白樣品的相對分子質(zhì)量;n為待測樣品每個分子中所選擇氨基酸的個數(shù);N為噪音;S為檢測器靈敏度。

經(jīng)過計算,Lp-PLA2的柱前衍生UPLC法的檢出限與定量限分別為1.96×10-2mg/mL和6.55×10-2mg/mL。

5 結(jié) 語

本文主要建立了純品Lp-PLA2含量的柱前衍生UPLC測定方法,經(jīng)過方法學(xué)參數(shù)考察和與HPLC-IDMS測定結(jié)果的比較表明,所建立的柱前衍生UPLC方法溯源清晰、準(zhǔn)確度高,相比HPLC-IDMS方法成本更低,更便于推廣應(yīng)用,可作為一種補(bǔ)充驗(yàn)證方法用于純品Lp-PLA2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值,在建立我國Lp-PLA2測定結(jié)果的量值溯源傳遞體系、保證相關(guān)試劑盒生產(chǎn)和臨床診斷中Lp-PLA2測定結(jié)果的準(zhǔn)確可比具有重要意義。