于鵬杰，才保加，朱生茂，蒲永強

（青海大學附屬醫(yī)院胃腸腫瘤外科，西寧 810000）

胃癌在全球最常見的癌癥中排名第5位，每年可致數(shù)十萬人死亡［1］。隨著消化道內(nèi)鏡技術(shù)的發(fā)展，胃癌患者的生存率得到顯著提高［2］。然而，化療和 （或） 放療對轉(zhuǎn)移性胃癌的治療效果并不理想，胃癌轉(zhuǎn)移是導致患者高死亡率的主要原因［3］。因此，探究胃癌轉(zhuǎn)移的潛在機制具有重要的臨床意義。越來越多的證據(jù)表明長鏈非編碼RNA （long non-coding RNA，lncRNA） 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。LINC00662是一種lncRNA，已有研究［4］表明LINC00662在結(jié)腸癌細胞中高表達，并促進細胞的增殖與轉(zhuǎn)移。miR-199a-5p在宮頸癌細胞中低表達，過表達miR-199a-5p可抑制宮頸癌細胞增殖、遷移與侵襲［5］。絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶1 （mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1，MAP3K1） 作為MAP3K家族成員之一，其表達下調(diào)可抑制食管癌細胞增殖和侵襲［6］。生物信息學分析顯示，LINC00662與miR-199a-5p存在結(jié)合位點，miR-199a-5p與MAP3K1存在結(jié)合位點，但LINC00662能否通過調(diào)控miR-199a-5p/MAP3K1來影響胃癌侵襲與轉(zhuǎn)移尚不明確。因此，本研究探討LINC00662對胃癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移的影響，以及其對miR-199a-5p、MAP3K1的調(diào)控機制，旨在為明確胃癌轉(zhuǎn)移的分子機制提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本收集及細胞來源

收集2018年6月至2020年6月期間我院確診的105例胃癌患者癌組織以及對應的癌旁組織 （距離癌組織3 cm），將所有收集的樣本于液氮中冷凍后-80℃保存。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。人胃癌SGC-7901細胞購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

miR-199a-5p模擬物 （miR-199a-5p） 及其陰性對照 （miR-NC）、miR-199a-5p抑制物 （anti-miR-199a-5p）及其陰性對照 （anti-miR-NC）、LINC00662 siRNA （si-LINC00662） 及其陰性對照 （si-NC） 均購自廣州基迪奧生物科技公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自上?；鄯f生物科技有限公司；pcDNA3.1載體購自美國ThermoFisher公司；胎牛血清 （FBS）、RPMI 1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；反轉(zhuǎn)錄及熒光定量試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；Trizol試劑、BCA試劑盒、ECL化學發(fā)光試劑盒購自美國Invitrogen公司；MAP3K1、基質(zhì)金屬蛋白酶 （matrix metalloproteinases，MMP） -2、MMP-9、神經(jīng)型鈣黏蛋白（neural cadherin，N-cadherin）、GAPDH兔多克隆抗體（anti-MAP3K1、anti-MMP-2、anti-MMP-9、anti-N-cadherin、anti-GAPDH）、辣根過氧化物酶 （HRP） 標記的羊抗兔二抗均購自武漢艾美捷科技有限公司；熒光定量PCR儀購自美國應用生物系統(tǒng)公司。

1.3 細胞培養(yǎng)及分組

將胃癌細胞SGC-7901置于含有10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔1 d換1次培養(yǎng)液，進行常規(guī)傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的SGC-7901細胞，利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒分別將si-NC、si-LINC00662、si-LINC00662與anti-miR-NC、si-LINC00662與anti-miR-199a-5p、si-LINC00662與miR-NC、si-LINC00662與miR-199a-5p、miR-NC、miR-199a-5p、pcDNA3.1、pcDNA3.1-LINC00662、anti-miR-NC、anti-miR-199a-5p轉(zhuǎn)染于SGC-7901細胞，并分別設定為si-NC組、si-LINC00662組、si-LINC00662+anti-miR-NC組、si-LINC00662+anti-miR-199a-5p組、si-LINC00662+miR-NC組、si-LINC00662+miR-199a-5p組、miR-NC組、miR-199a-5p組、空載體組、LINC00662過表達組、anti-miR-NC組、anti-miR-199a-5p組，另取未轉(zhuǎn)染的SGC-7901細胞設定為空白組，細胞轉(zhuǎn)染48 h后用于后續(xù)實驗。

1.4 實時定量PCR檢測SGC-7901細胞中LINC00662、miR-199a-5p、MAP3K1 mRNA的表達

使用TRIzol試劑從胃癌組織和癌旁組織中提取總RNA。RNA的濃度和純度用紫外分光光度計測定。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并根據(jù)熒光定量試劑盒的操作說明書進行PCR擴增反應，U6和GAPDH分別作為miR-199a-5p、LINC00662與MAP3K1內(nèi)參，以2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。所用引物包括：miR-199a-5p，正向5’-CCGGGAT CCGCAAACTCAGCTTTAC-3’，反向5’-CGGAATTCG TGGCGACCGTGATACC-3’；U6，正向5’-GTACAAA ATACGTGACGTAGAAAG-3，反向5’-GGTCDTTCGTC CTTTCCAC-3’；LINC00662，正向5’-AGGACAGAAT CTCCGTGGAC-3’，反向5’-TTGATCTTTTAGATTTC TGTCACACTC-3’；MAP3K1，正向5’-AACAACCGT ATAGAGAAGACA-3’，反向5’-TGAGCCTGATAACA AGAAGA-3’；GADPH，正向5’-GGAGCGAGATCCC TCCAAAAT-3’，反向5’-GGCTGTTGTCATACTTCTC ATGG-3’。

1.5 Transwell實驗檢測細胞侵襲與遷移

1.5.1 細胞侵襲：將基質(zhì)膠涂于Transwell小室中，待自然干燥后收集對數(shù)生長期的SGC-7901細胞用胰蛋白酶消化，用PBS洗滌并重懸于無血清RPMI 1640培養(yǎng)基中，并將細胞密度調(diào)整為1×105/mL。取200 μL細胞懸浮液接種在上室中，將500 μL含有10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基加入到下室中，然后將細胞在含有5% CO2的培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)48 h。侵入下室的細胞用95%乙醇固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，PBS去除未染色的細胞。倒置顯微鏡下觀察，隨機選取5個視野的細胞進行計數(shù)。

1.5.2 細胞遷移：Transwell小室中不涂基質(zhì)膠。收集對數(shù)生長期的SGC-7901細胞用胰蛋白酶消化，用PBS洗滌并重懸于無血清RPMI 1640培養(yǎng)基中，并將細胞密度調(diào)整為1×105/mL。其他步驟同1.5.1。

1.6 劃痕實驗檢測細胞遷移

將各組細胞接種到6孔板中并在培養(yǎng)箱中孵育，當其匯合度約達到100%時用無菌的200 μL槍頭尖端垂直水平劃線，然后利用PBS洗滌除去漂浮的細胞并在無血清培養(yǎng)基中孵育。使用倒置顯微鏡觀察細胞在0、24 h時遷移情況并拍照。劃痕愈合率（%） = （1～24 h的劃痕面積/0 h的劃痕面積） ×100。

1.7 Western blotting檢測細胞中MAP3K1、MMP-2、MMP-9、N-cadherin表達

將各組細胞用PBS洗滌2次后，置于預冷的RIPA裂解緩沖液中裂解并提取總蛋白。在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺 （SDS/PAGE） 凝膠上分離蛋白質(zhì)，電印跡到聚偏二氟乙烯膜上，將膜用5%脫脂牛奶封閉1 h后加入一抗anti-MAP3K1、anti-MMP-2、anti-MMP-9、anti-N-cadherin、anti-GAPDH于4 ℃下孵育過夜，第2天用TBST洗滌3次后，加入HRP標記的羊抗兔二抗于室溫下孵育2 h，使用ECL發(fā)光試劑盒檢測蛋白質(zhì)的顯色情況，利用Image-J軟件分析蛋白質(zhì)的灰度值。

1.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>

使用Starbase網(wǎng)站 （http：//starbase.sysu.edu.cn/）預測LINC00662與miR-199a-5p、miR-199a-5p與MAP3K1的結(jié)合位點。分別構(gòu)建LINC00662、MAP3K1 3’-UTR區(qū)的野生型 （WT） 和突變型 （MUT） 質(zhì)粒，記為WT-LINC00662、MUT-LINC00662、WT-MAP3K1、MUT-MAP3K1，利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒分別將WT-LINC00662、MUT-LINC00662、WT-MAP3K1、MUT-MAP3K1與miR-NC、miR-199a-5p共轉(zhuǎn)染于SGC-7901細胞，轉(zhuǎn)染后24 h收獲細胞，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測雙熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用x-±s表示。2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩組間比較采用SNK-q檢驗，P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LINC00662、miR-199a-5p、MAP3K1在胃癌組織中的表達

與癌旁組織比較，胃癌組織中LINC00662、MAP3K1mRNA表達水平顯著升高，miR-199a-5p表達水平顯著降低 （均P< 0.001），見表1。

2.2 LINC00662抑制對胃癌SGC-7901細胞侵襲、遷移的影響

結(jié)果顯示，與空白組 （1.03±0.12） 和si-NC組 （1.05±0.14） 比較，si-LINC00662組 （0.35±0.06） SGC-7901細胞中LINC00662表達水平顯著降低 （均P< 0.05）。與空白組和si-NC組比較，si-LINC00662組SGC-7901細胞侵襲、遷移細胞數(shù)目顯著減少，劃痕愈合率顯著降低，MMP-2、MMP-9、N-cadherin、MAP3K1蛋白表達顯著降低 （P< 0.05），見圖1。

圖1 LINC00662抑制對胃癌SGC-7901細胞侵襲、遷移的影響Fig. 1 Effect of LINC00662 inhibition on the invasion and migration of gastric cancer SGC-7901 cells

2.3 各轉(zhuǎn)染組SGC-7901細胞中miR-199a-5p表達比較

結(jié)果顯示，空白組、si-NC組、si-LINC00662組、si-LINC00662+anti-miR-NC組、si-LINC00662+anti-miR-199a-5p 組、si-LINC00662+miR-NC 組、si-LINC00662+miR-199a-5p 組miR-199a-5p表達分別為1.02±0.14、1.03±0.15、2.21±0.24、1.03±0.13、0.39±0.05、1.06±0.12、2.89±0.32。與空白組和si-NC組比較，si-LINC00662組SGC-7901細胞中miR-199a-5p表達顯著升高 （P< 0.05）；與si-LINC00662組和si-LINC00662+anti-miR-NC組比較，si-LINC00662+anti-miR-199a-5p組SGC-7901細胞中miR-199a-5p表達顯著降低 （P< 0.05）；與si-LINC 00662組和si-LINC00662+miR-NC組比較，si-LINC00662+miR-199a-5p組SGC-7901細胞中miR-199a-5p表達顯著升高 （均P< 0.05）。

2.4 抑制miR-199a-5p可減弱LINC00662抑制對胃癌SGC-7901細胞侵襲、遷移的影響（圖2）

與si-LINC00662組和si-LINC00662+anti-miR-NC組比較，si-LINC00662+anti-miR -199a-5p組SGC-7901細胞中MAP3K1蛋白表達顯著升高，侵襲、遷移細胞數(shù)目顯著升高，劃痕愈合率顯著升高，MMP-2、MMP-9、N-cadherin蛋白表達顯著升高 （P< 0.05），見圖2。

圖2 抑制miR-199a-5p可減弱LINC00662抑制對胃癌SGC-7901細胞侵襲、遷移的影響Fig.2 Inhibition of miR-199a-5p could attenuate the effect of LINC00662 inhibition on the invasion and migration of gastric cancer SGC-7901 cells

2.5 上調(diào)miR-199a-5p表達可增強LINC00662抑制對胃癌SGC-7901細胞侵襲、遷移的影響

與si-LINC00662組和si-LINC00662+miR-NC組比較，si-LINC00662+miR-199a-5p組SGC-7901細胞中MAP3K1蛋白表達顯著降低，侵襲、遷移細胞數(shù)目顯著降低，劃痕愈合率顯著降低，MMP-2、MMP-9、N-cadherin蛋白表達顯著降低 （P< 0.05），見圖3。

圖3 上調(diào)miR-199a-5p表達可增強LINC00662抑制對胃癌SGC-7901細胞侵襲、遷移的影響Fig.3 Upregulation of miR-199a-5p expression could enhance the effect of LINC00662 inhibitory on the invasion and migration of gastric cancer SGC-7901 cells

2.6 LINC00662與miR-199a-5p、miR-199a-5p與MAP3K1靶向關(guān)系的驗證

結(jié)果顯示，LINC00662與miR-199a-5p存在結(jié)合位點，miR-199a-5p與MAP3K1存在結(jié)合位點，見圖4。與miR-NC組比較，miR-199a-5p組WT-LINC00662胃癌SGC-7901細胞的熒光素酶相對活性降低 （P<0.05），而miR-199a-5p組MUT-LINC00662胃癌SGC-7901細胞的熒光素酶相對活性無統(tǒng)計學差異 （P>0.05），見表2。與miR-NC組比較，miR-199a-5p組WTMAP3K1胃癌SGC-7901細胞的熒光素酶相對活性降低 （P< 0.05），而miR-199a-5p組MUT-MAP3K1胃癌SGC-7901細胞的熒光素酶相對活性無統(tǒng)計學差異（P> 0.05），見表2。與空白組 （1.01±0.11） 和空載體組（1.04±0.12） 比較，LINC00662過表達組 （0.41±0.05）中miR-199a-5p表達水平顯著降低 （均P< 0.05）。與空白組和miR-NC組比較，miR-199a-5p組中MAP3K1蛋白表達水平顯著降低 （P< 0.05）；與空白組和antimiR-NC組比較，anti-miR-199a-5p組中MAP3K1蛋白表達顯著升高 （P< 0.05），見圖5。

圖4 Starbase網(wǎng)站預測LINC00662與miR-199a-5p、miR-199a-5p與MAP3K1的結(jié)合位點Fig.4 Binding sites of LINC00662 to miR-199a-5p and those of miR-199a-5p to MAP3K1 were predicted using Starbase website

圖5 Western blotting檢測各組細胞中MAP3K1蛋白表達Fig.5 Expression of MAP3K1 protein in each group by Western blotting

表2 miR-NC組和miR-199a-5p組熒光素酶活性比較 （，n = 6）Tab.2 Comparison of luciferase activity between miR-NC and miR-199a-5p groups （，n = 6）

表2 miR-NC組和miR-199a-5p組熒光素酶活性比較 （，n = 6）Tab.2 Comparison of luciferase activity between miR-NC and miR-199a-5p groups （，n = 6）

GroupWT-LINC00662MUT-LINC00662WT-MAP3K1MUT-MAP3K1 miR-NC group1.05±0.121.06±0.111.01±0.101.04±0.12 miR-199a-5p group0.36±0.071.02±0.100.29±0.051.03±0.11 t 12.1660.65915.7740.150 P<0.0010.525<0.0010.883

3 討論

盡管目前胃癌的診治已取得突破性進展，但胃癌患者的5年生存率依然很低［7］。由于胃癌的死亡率與胃癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此，迫切需要尋找腫瘤轉(zhuǎn)移新的生物標志物，以便靶向治療來提高患者生存率。

研究［8］證實，lncRNA在調(diào)控多種癌細胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。相關(guān)研究表明，LINC00662在前列腺癌組織及細胞中呈相對高表達，敲低其表達可抑制前列腺癌細胞增殖、侵襲和遷移，并促進其凋亡［9］；LINC00662在肝癌組織中上調(diào)并與肝癌患者腫瘤大小、侵襲和較差的存活率相關(guān)［10］；LINC00662過表達通過激活ERK信號通路促進結(jié)腸癌增殖、侵襲和遷移［11］。本研究結(jié)果顯示，LINC00662在胃癌組織中高表達，下調(diào)LINC00662表達可抑制胃癌SGC-7901細胞的侵襲與遷移，提示LINC00662在胃癌中發(fā)揮著促癌基因的作用。相關(guān)研究指出MMP-2和MMP-9是MMPs家族中與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切的兩個成員，其可以通過降解細胞外基質(zhì)中的Ⅳ型膠原酶促進腫瘤轉(zhuǎn)移［12］；N-cadherin是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要標志分子，其在腫瘤細胞中高表達可導致上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進而促進細胞遷移和侵襲［13］。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)LINC00662表達可抑制胃癌SGC-7901細胞中MMP-2、MMP-9、N-cadherin蛋白表達，提示沉默LINC00662可能通過下調(diào)MMP-2、MMP-9、N-cadherin表達抑制SGC-7901細胞的侵襲與遷移。

miR-199a-5p在多種腫瘤細胞中異常表達，參與調(diào)控腫瘤細胞的增殖代謝、侵襲轉(zhuǎn)移等過程［14］。研究顯示，過表達miR-199a-5p能夠下調(diào)DDR1表達，抑制人腦膠質(zhì)瘤細胞增殖和遷移［15］；miR-199a-5p在非小細胞肺癌組織中低表達，其表達上調(diào)可抑制非小細胞肺癌細胞的增殖［16］；miR-199a-5p在喉癌組織中的表達明顯低于癌旁組織，過表達miR-199a-5p可顯著抑制喉癌細胞的增殖、侵襲和遷移，同時誘導細胞凋亡［17］。本研究結(jié)果顯示，miR-199a-5p在胃癌組織中低表達，抑制miR-199a-5p可減弱抑制LINC00662對胃癌SGC-7901細胞侵襲、遷移的影響，上調(diào)miR-199a-5p表達可增強抑制LINC00662對胃癌SGC-7901細胞侵襲、遷移的影響，提示抑制LINC00662可能通過上調(diào)miR-199a-5p的表達抑制SGC-7901細胞侵襲、遷移。MAP3K1是廣泛存在于人體內(nèi)的一種重要激酶，具有調(diào)控細胞遷移的作用［18］。有研究表明，過表達miR-196b通過下調(diào)MAP3K1來抑制人絨毛膜癌細胞的增殖、遷移和侵襲［19］；miR-451可以通過抑制MAP3K1來抑制食管癌細胞增殖［20］。本研究結(jié)果顯示，MAP3K1mRNA在胃癌組織中高表達，沉默LINC00662后胃癌SGC-7901細胞中miR-199a-5p表達上調(diào)，MAP3K1蛋白表達下調(diào)，提示抑制LINC00662可能通過調(diào)控miR-199a-5p/MAP3K1來抑制胃癌細胞的侵襲與遷移。同時本研究還證實了LINC00662可靶向負調(diào)控miR-199a-5p的表達，miR-199a-5p可靶向負調(diào)控MAP3K1的表達，提示抑制LINC00662可通過靶向上調(diào)miR-199a-5p的表達進而間接下調(diào)MAP3K1的表達來發(fā)揮對胃癌細胞侵襲與遷移的抑制作用。

綜上所述，抑制LINC00662可通過調(diào)控miR-199a-5p/MAP3K1抑制胃癌細胞侵襲與遷移。本研究為胃癌的早期診斷及靶向治療提供了參考依據(jù)。