沈 韜 張海濤 顧旭華 金 律

川崎?。↘awasaki disease，KD）是一種好發(fā)于5 歲以下嬰幼兒及兒童的自身免疫性疾病，以全身性中小血管炎為主要病理特征［1］。冠狀動脈是KD 最常見的受累血管，KD 導(dǎo)致的冠狀動脈病變（coronary artery lesion，CAL）是患兒死亡的首要原因，也是目前兒童后天性心臟病的主要病因［2-3］。在臨床實(shí)踐中，KD 的早診斷、早治療對減少CAL 的發(fā)生具有重要意義，但目前KD 的診斷主要依靠臨床癥狀，缺乏特異性實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。因此，尋找KD 特異性的診斷標(biāo)志物是KD 相關(guān)研究的熱點(diǎn)之一。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和微小RNA（microRNA，miR）是在體內(nèi)發(fā)揮復(fù)雜生物學(xué)作用的非編碼RNA，lncRNA 能夠吸附miR 并抑制miR 對下游靶基因的調(diào)控作用，lncRNA 靶向miR 不僅是多種疾病發(fā)病機(jī)制的研究靶點(diǎn)，異常表達(dá)的lncRNA及miR 也能釋放進(jìn)入血液循環(huán)并成為診斷疾病、評估病情的標(biāo)志物。一項(xiàng)KD 相關(guān)的臨床研究通過基因芯片技術(shù)證實(shí)，KD 患兒外周血中存在LncRNA LINC00999-miR-6780 軸、LncRNA PSORS1C3-miR-216a 軸、LncRNA SNHG5-miR-132/miR-92 軸表達(dá)的變化［4］。目前，lncRNAs 及miRs 用于KD 診斷及病情評估尚缺乏足夠的臨床研究證據(jù)。因此，本研究將通過熒光定量PCR 的技術(shù)對KD 患兒外周血中上述幾種lncRNAs 及miRs 表達(dá)的變化進(jìn)行驗(yàn)證，旨在篩選能夠用于KD 診斷及病情評估的標(biāo)志物，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016 年1 月至2020 年12 月在蘇州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院兒科確診的62 例KD 患兒作為研究的KD 組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①結(jié)合病史、癥狀體征、輔助檢查，符合診斷與治療專家共識［5］中KD 的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②未接受過KD 的治療；③按lncRNAs、miRs 表達(dá)的檢測，在入組后當(dāng)天或次日要求留取空腹外周靜脈血；④臨床資料完整；⑤入組后當(dāng)天或次日進(jìn)行心超檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并現(xiàn)癥感染的患兒；②伴有其他心血管系統(tǒng)疾??；③合并先天性畸形、遺傳代謝?。虎芙邮苓^丙種球蛋白、阿司匹林等治療。另取同期在我院進(jìn)行健康體檢的80 例健康兒童作為對照組。KD 組中男性39 例、女性23 例，年齡10 個月～7 歲、平均（3.31±0.62）歲；出生周齡36～41 周，平均（38.92±7.39）周；對照組中男性48 例、女性32 例，年齡1～8 歲、平均（3.52±0.77）歲，出生周齡36～41 周，平均（38.44±7.62）周。兩組對象一般資料的比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)后實(shí)施（倫理號：2016 倫審批第002 號）。

1.2 外周血lncRNAs、miRs 表達(dá)水平的檢測 KD 組患兒入組后晨起空腹時采集外周靜脈血5 mL，對照組兒童體檢時采集空腹外周靜脈血5 mL，采用血液RNA提取試劑盒（貨號：19241ES50，上海翌圣生物科技公司）提取外周靜脈血的總RNA，采用lncRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒（貨號：KR202，北京天根生化科技公司）對RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到lncRNA cDNA，miR cDNA第一鏈合成試劑盒（貨號：KR201，北京天根生化科技公司）對RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到miR cDNA，cDNA 放置在-20℃保存。

取cDNA 進(jìn)行熒光定量PCR 檢測。采用lncRNA熒光定量檢測試劑盒（貨號：FP402，北京天根生化科技公司）對lncRNA 進(jìn)行檢測，采用miR 熒光定量檢測試劑盒（貨號：FP401，北京天根生化科技公司），反應(yīng)體系：cDNA 10 ng、預(yù)混液 10 μL、10 μmol/L 的正向引物（序列5’-TATCGTATGCTAGCTAGCT-3’）和反向引物（5’-TATGCGTAGGTAGCTAGCT-3’）各0.5 μL、去離子水補(bǔ)足至20 μL；反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性15 min，94℃20 s、60℃ 34 s、重復(fù)40 個循環(huán)，得到反應(yīng)的循環(huán)曲線及循環(huán)閾值（Ct），以U6 為內(nèi)參、按照公式2-△△Ct計算LncRNA LINC00999、miR-6780、LncRNA PSORS1C3、miR-216a、LncRNA SNHG5、miR-132、miR-92 的表達(dá)水平。

1.3 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的檢測 KD 組患兒入組后晨起空腹時采集外周靜脈血，對照組兒童體檢時采集空腹外周靜脈血，采用血常規(guī)儀檢測白細(xì)胞計數(shù)（white blood cell，WBC）、血紅蛋白（hemoglobin，HB）、血小板計數(shù)（platelet，PLT），采用紅細(xì)胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）測定儀檢測ESR，采用全自動生化分析儀檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、肌酐（creatinine，Cr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、C 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein ，CRP）。

1.4 CAL 的評估 參照《川崎病冠狀動脈病變的臨床處理建議》［6］，采用彩色多普勒超聲診斷儀對KD 患兒進(jìn)行超聲心動圖檢查，對左冠狀動脈主干、左前降支、左回旋支、右冠狀動脈及后降支冠狀動脈進(jìn)行掃查，出現(xiàn)冠狀動脈擴(kuò)張、狹窄或冠狀動脈瘤等超聲表現(xiàn)判斷為CAL。根據(jù)評估結(jié)果將KD 患兒分為CAL 組和無CAL（non-CAL，NCAL）組。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0 軟件錄入數(shù)據(jù)，計量資料以表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson 檢驗(yàn)。分別以《兒童風(fēng)濕性疾病相關(guān)巨噬細(xì)胞活化綜合征診斷與治療專家共識之五--川崎病篇》中KD 的診斷標(biāo)準(zhǔn)和《川崎病冠狀動脈病變的臨床處理建議》中KD 合并CAL 的診斷標(biāo)準(zhǔn)為金標(biāo)準(zhǔn)，采用Prism 軟件通過繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線對LncRNA SNHG5、miR-132 診斷KD 及KD 合并CAL 的效能進(jìn)行探討。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組對象外周血lncRNAs 及miRs 表達(dá)水平的比較 KD 組外周血中LncRNA SNHG5 的表達(dá)水平高于對照組，miR-132 的表達(dá)水平低于對照組（均P<0.05）；兩組外周血中LncRNA LINC00999、LncRNA PSORS1C3、miR-6780、miR-216a、miR-92 的表達(dá)水平比較均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 KD組與對照組外周血lncRNAs及miRs表達(dá)水平的比較

2.2 KD 組中LncRNA SNHG5、miR-132表達(dá)水平的相關(guān)性 KD 組患兒外周血中LncRNA SNHG5 的表達(dá)水平與miR-132 的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.527，P<0.001）。

2.3 LncRNA SNHG5、miR-132表達(dá)水平對KD 的診斷價值 以專家共識中KD 的診斷標(biāo)準(zhǔn)作為金標(biāo)準(zhǔn)，分析外周血LncRNA SNHG5、miR-132 表達(dá)水平對KD 的診斷價值。在Prism 軟件中錄入數(shù)據(jù)并進(jìn)行定義，1 定義為符合KD 診斷、0 定義為健康兒童，得到ROC 曲線見圖2，兩項(xiàng)指標(biāo)均對KD 具有診斷價值，見表2。

圖1 KD 組中LncRNA SNHG5、miR-132 表達(dá)水平相關(guān)性的散點(diǎn)圖

表2 外周血LncRNA SNHG5、miR-132表達(dá)水平診斷KD的效能

2.4 KD 組中LncRNA SNHG5、miR-132表達(dá)水平與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性 KD 組中LncRNA SNHG5 的表達(dá)水平與CRP、ESR 呈正相關(guān)，miR-132 的表達(dá)水平與CRP、ESR 呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）；LncRNA SNHG5、miR-132 表達(dá)水平與WBC、HB、PLT、ALT、AST、TC、TG、Cr、BUN 無相關(guān)性（P>0.05）。見表3。

表3 KD組中LncRNA SNHG5、miR-132表達(dá)水平與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性

2.5 KD 組中CAL 與NCAL 患兒LncRNA SNHG5、miR-132 表達(dá)水平的比較 KD 組CAL 患兒外周血中LncRNA SNHG5 的表達(dá)水平高于NCAL 患兒，miR-132的表達(dá)水平低于NCAL 患兒，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表4。

表4 KD組中CAL與NCAL患兒LncRNA SNHG5、miR-132表達(dá)水平的比較

2.6 LncRNA SNHG5、miR-132 表達(dá)水平對KD 患兒CAL 的診斷價值 參照《川崎病冠狀動脈病變的臨床處理建議》［6］中CAL 的標(biāo)準(zhǔn)作為金標(biāo)準(zhǔn)，分析外周血LncRNA SNHG5、miR-132 表達(dá)水平對KD 患兒CAL的診斷價值。在Prism 軟件中錄入數(shù)據(jù)并進(jìn)行定義，1定義為符合CAL 診斷、0 定義為不符合CAL 診斷，得到ROC 曲線見圖3，兩項(xiàng)指標(biāo)均對KD 患兒CAL 具有診斷價值，診斷效能見表5。

圖3 外周血LncRNA SNHG5、miR-132表達(dá)水平診斷KD患兒CAL的ROC曲線

表5 外周血LncRNA SNHG5、miR-132表達(dá)水平診斷KD患兒CAL的效能

3 討論

KD 是一類急性發(fā)熱性出疹性疾病，以全身免疫系統(tǒng)活化及血管內(nèi)皮系統(tǒng)損害為特征，可累及動靜脈及毛細(xì)血管并造成心血管系統(tǒng)并發(fā)癥［7-8］。KD 的發(fā)病機(jī)制至今仍不十分明確，雖然在急性期會出現(xiàn)WBC、CRP、ESR 等指標(biāo)升高，但上述指標(biāo)用于KD 診斷的缺乏特異性，目前臨床上診斷KD 仍主要依靠臨床表現(xiàn)，不典型病例容易出現(xiàn)誤診漏診。因此，尋找KD 診斷標(biāo)志物具有迫切的臨床需求。

LncRNAs 及miRs 是參與基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的非編碼RNA，LncRNAs 能夠通過類似“分子海綿”的作用吸附miRs、抑制miRs 對下游靶基因的負(fù)性調(diào)控作用，最終形成lncRNA-miR-靶基因軸并在不同疾病的病理生理過程中發(fā)揮生物學(xué)作用。同時，在疾病發(fā)病過程中異常表達(dá)的lncRNAs 及miRs 會造成外周循環(huán)中相應(yīng)分子表達(dá)的變化，進(jìn)而可以作用診斷疾病及評估病情的標(biāo)志物［9-12］。本研究在Guo 等的研究基礎(chǔ)上對KD 患兒外周血中LncRNA LINC00999-miR-6780軸 、LncRNA PSORS1C3-miR-216a 軸 、LncRNA SNHG5-miR-132/miR-92 軸的表達(dá)進(jìn)行了熒光定量PCR 的驗(yàn)證，lncRNAs 及miRs 表達(dá)變化的趨勢與微陣列數(shù)據(jù)庫分析的結(jié)果吻合，但只有LncRNA SNHG5 及miR-132 表達(dá)水平在KD 患兒與健康兒童的比較中有統(tǒng)計學(xué)差異，因此本文將繼續(xù)探索LncRNA SNHG5 及miR-132 在KD 發(fā)病中的作用。

已有國內(nèi)外相關(guān)的臨床研究使用外周血LncRNA SNHG5 及miR-132 疾病的診斷，包括LncRNA SNHG5用于胃癌［13］、非小細(xì)胞肺癌［14］的診斷及miR-132 用于膿毒癥心肌病［15］、動脈粥樣硬化［16］、非酒精性脂肪肝［17］的診斷?；贙D 患兒外周血中LncRNA SNHG5 及miR-132 表達(dá)的微陣列檢測結(jié)果及熒光定量PCR 檢測結(jié)果，本研究將上述兩種分子用于KD 的診斷，經(jīng)ROC曲線分析證實(shí)外周血LncRNA SNHG5 及miR-132 均對KD 具有診斷價值，且診斷效能理想、LncRNA SNHG5 診斷的靈敏性和特異性均超過85%，通過擴(kuò)大研究的樣本量可能有助于找到LncRNA SNHG5 診斷KD 更理想的截斷值，進(jìn)而提高診斷的靈敏度和特異性。

LncRNA SNHG5 對miR-132 具有靶向調(diào)控作用，相關(guān)研究分別在慢性阻塞性肺疾病、結(jié)直腸癌、宮頸癌模型中證實(shí)，LncRNA SNHG5 與miR-132 具有靶向調(diào)控關(guān)系［18-20］。本研究在KD 患兒中通過相關(guān)性分析證實(shí)：LncRNA SNHG5 與miR-132 的表達(dá)具有負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示在KD 的發(fā)病過程中LncRNA SNHG5 可能靶向miR-132 并發(fā)揮作用。目前關(guān)于miR-132 生物學(xué)作用的研究認(rèn)為靶向PTEN、NF-κB、p38/JNK 等促炎、促凋亡基因是其主要的生物學(xué)效應(yīng)，高表達(dá)的miR-132 能夠通過抗炎、抗凋亡作用減輕不同病理因素引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷［18，21-23］。廣泛的血管內(nèi)皮系統(tǒng)損害是KD 的重要特征，本研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)KD 患兒外周血中LncRNA SNHG5 表達(dá)增加及miR-132 表達(dá)降低且具有負(fù)相關(guān)的結(jié)果提示高表達(dá)的LncRNA SNHG5 可能通過抑制miR-132、削弱其抗炎及抗凋亡作用，進(jìn)而造成KD 的發(fā)病?；诖送茰y，本研究收集了KD 患兒的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)并進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示：LncRNA SNHG5 與CRP、ESR 呈正相關(guān)，miR-132 與CRP、ESR呈負(fù)相關(guān)。CRP 和ESR 是評價KD 病情的非特異性指標(biāo)，水平升高反映了病情活動及炎癥激活，上述相關(guān)性分析的結(jié)果提示LncRNA SNHG5 及miR-132 表達(dá)的變化與KD 病情的進(jìn)展相關(guān)。

全身性中小血管炎是KD 主要的病理特征，其中CAL 是KD 最常見的血管并發(fā)癥，也是影響預(yù)后、增加心血管疾病發(fā)生風(fēng)險的主要原因。在KD 的早診斷、早治療中，準(zhǔn)確評估CAL 是重要一環(huán)。超聲心動圖是目前評估KD 患兒的CAL 的主要輔助檢查手段［24-25］，但因?yàn)榛純耗挲g較小、對檢查的配合度較低，部分患兒需要使用基礎(chǔ)麻醉才能完成檢查，使得該項(xiàng)檢查在KD 患兒中的應(yīng)用受到限制。本研究使用LncRNA SNHG5 及miR-132 作為標(biāo)志物進(jìn)行KD 患兒CAL 的診斷，與NCAL 的KD 患兒比較，合并CAL 的KD 患兒外周血LncRNA SNHG5 表達(dá)水平增加、miR-132 表達(dá)水平降低，且兩項(xiàng)標(biāo)志物均對KD 患兒的CAL 具有診斷價值，雖然診斷的靈敏性和特異性均不足80%，但仍然可以為今后使用LncRNA SNHG5、miR-132 兩項(xiàng)標(biāo)志物進(jìn)行KD 合并CAL 的診斷提供依據(jù)。

綜上所述，在KD 的發(fā)病過程中存在多種lncRNAs及miRs 表達(dá)的變化，其中LncRNA SNHG5 表達(dá)水平顯著增加、miR-132 表達(dá)水平顯著降低且具有負(fù)相關(guān)關(guān)系；LncRNA SNHG5 和miR-132 不僅對KD 具有診斷價值，還對KD 合并CAL 具有診斷價值，是未來用于診斷KD 及KD 合并CAL 的潛在標(biāo)志物。同時，KD 患兒LncRNA SNHG5 及miR-132 的表達(dá)水平還與CRP、ESR 存在相關(guān)性，提示LncRNA SNHG5/miR-132 軸的變化與KD 病情活動及炎癥激活有關(guān)，這也為今后研究KD 的發(fā)病機(jī)制提供了新思路。