葉和江 王巧云 田學(xué)敏 王保健

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）為常見呼吸系統(tǒng)疾病，目前40 歲以上人群的COPD 患病率已達15%左右［1］。氣道炎癥反應(yīng)是COPD 發(fā)生、發(fā)展的重要機制，可引發(fā)炎癥性損害并伴隨免疫系統(tǒng)的激活［2］。研究發(fā)現(xiàn)，有氧運動可抑制煙霧暴露小鼠肺組織的炎癥因子表達，抑制氣道上皮增生，但運動改善COPD 慢性炎癥的具體機制仍不明確［3-4］。趨化素（chemerin，CHEM）/趨化因子受體-1（CMKLR1）與COPD 有密切關(guān)聯(lián)，通過募集氣道內(nèi)白細胞而發(fā)揮促炎作用，與COPD 預(yù)后密切相關(guān)［5］。運動被認為可促進肺功能的改善［6］，且推測運動對COPD 肺功能的影響可能與CHEM/CMKLR1 有關(guān)。本研究以斯?jié)娎鄹?多雷（Sprague Dawley，SD）大鼠進行研究，探究有氧運動改善COPD 肺功能的初步機制，旨在為臨床COPD 的運動療法提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級雄性SD 大鼠（新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心），共30 只，動物毛色光澤，無受損、斷尾現(xiàn)象，食水攝入正常，自由飲水和進食。

1.1.2 實驗儀器 自制靜式被動吸煙箱（1 m×1 m×0.8 m）；肺功能檢測系統(tǒng)（BH-AX-MAPG，廣州紅象醫(yī)療科技有限公司）；石蠟包埋機（HS-B7126-B，沈陽恒松科技有限公司）與切片機（RM2235，德國Leica）；光學(xué)顯微鏡（BX53F，日本OLYMPUS）；小型垂直電泳槽與小型Trans-Blot 轉(zhuǎn)印槽（美國伯樂公司）；組織勻漿器（S-18KS，北京萊普特科學(xué)儀器有限公司）；高速臺式離心機（LC-LX-H165A，上海力辰儀器科技有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（GHP-9080，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；全波長酶標儀（美國Thermo scientific）。

1.1.3 實驗試劑 二甲苯、無水乙醇、蘇木素和伊紅染色液（均為上海生工生物工程）；水合氯醛（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；中性樹膠、RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒、一抗及二抗稀釋液、GAPDH/β-actin 內(nèi)參、HRP 標記二抗（均為北京深藍云生物科技有限公司）；CHEM、CMKLR1、CXCL8/IL-8、TNF-α、IL-1β、IL-6 抗體（美國abcam）。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立COPD 大鼠模型 通過香煙暴露構(gòu)建COPD 模型：將SD 大鼠置于被動吸煙箱，用抽吸電機對20 只香煙（大前門牌）自動吸煙并將煙霧注入吸煙箱使大鼠被動吸煙，吸煙箱氧氣濃度控制>18%，一氧化碳濃度保持在（345±35） ppm，煙熏刺激16 周。模型判定：以大鼠肺組織HE 染色呈COPD 特征（炎癥細胞浸潤、氣道狹窄及粘液增多）為COPD 大鼠模型制備成功［7］。

1.2.2 有氧運動 將30 只COPD 大鼠隨機分為對照組和運動組，運動組予以跑臺運動：采取中等強度的有氧運動（13.3 m/min），第1 周進行適應(yīng)性訓(xùn)練，每天10 min，每周3 d；第2～9 周為正式訓(xùn)練，每天40 min，3天/周，共9 周；對照組不干預(yù)。

1.2.3 動物取材 稱量大鼠體重并記錄結(jié)果。腹腔注射10%水合氯醛溶液，5 min 后檢測肺功能。處死大鼠，取右肺組織，清洗后剪成2 部分，分別用于蘇木精－伊紅染色和Western-blot 檢測。

1.2.4 肺功能檢測 暴露大鼠頸部皮膚，消毒，于氣管軟骨環(huán)下方剪一小口行氣管插管，氣管插管末端連接肺功能檢測系統(tǒng)，操作電腦軟件獲取第1 秒用力呼氣量（forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1）、用力呼氣量（forced vital capacity，F(xiàn)VC）、最大呼氣中段流速（maximal mid-expiratory flow，MMEF）、呼氣峰流速（peak expiratory flow，PEF）等參數(shù)。

1.2.5 肺組織蘇木精－伊紅染色 ①石蠟包埋：用鑷子固定組織，持手術(shù)刀垂直切斷組織，后放入流水過夜。按75%（45 min）、85%（45 min）、95%（10 min）、100%（5 min）酒精的順序進行梯度脫水。依次加入無水乙醇＋二甲苯（20 min）、二甲苯Ⅰ（10 min）、二甲苯Ⅱ（10 min）進行透明。浸蠟后于包埋器內(nèi)注入高熔點石蠟，用鑷子將組織移到包埋器內(nèi)中間位置。待石蠟?zāi)毯笕コ衿鳎糜?℃下保存。②染色：切除邊緣余蠟后切片，乙醇梯度脫水，蘇木精染液染4 min，流動水清洗；85%酒精、95%酒精脫水各5 min，伊紅染液中染色5 min，最后乙醇梯度脫水后中性樹膠封片。

1.2.6 Western blot 法檢測蛋白表達 ①制備組織蛋白上清液：剪碎組織，加入酶抑制劑三聯(lián)裝，按每20 mg 組織加100 μL 裂解液的比例加入裂解液。離心機12 000 r/min 離心5 min 留取上清液。②上清液蛋白濃度：BCA 蛋白定量試劑盒制成工作液待用；稀釋BSA 標準品成8 個濃度梯度。每管加上清液100 μL 后加2 mL 工作液，孵育0.5 h后檢測562 nm 處光密度值。制作標準曲線，計算樣品總蛋白濃度。③肺組織的各蛋白表達：灌膠、電泳后轉(zhuǎn)印蛋白，BSA 中封閉PVDF 膜2 h，洗膜；加稀釋的CHEM、CMKLR1、白細胞介素8（interleukin 8，IL-8）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF)-α、IL-1β、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）和GAPDH，孵育過夜。與HRP 標記的二抗反應(yīng)，孵育，顯影、定影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad 8.0 進行統(tǒng)計，正態(tài)分布計量資料用表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 蘇木精－伊紅染色結(jié)果 對照組的肺組織可見炎癥細胞浸潤，氣道黏液增加，為慢性支氣管炎特征；肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，間隔破裂融合為肺大皰，為肺氣腫特征，見圖1（A）。運動組的肺組織可見支氣管周圍炎癥浸潤與黏液分泌、黏膜增生減少，管壁變薄，肺泡結(jié)構(gòu)破壞減輕，見圖1（B）。

圖1 大鼠肺組織蘇木精－伊紅染色（×200）

2.2 肺功能指標比較 運動組大鼠MMEF、PEF 高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；兩組FEV1、FVC差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 兩組大鼠肺功能指標比較（）

表1 兩組大鼠肺功能指標比較（）

注：FEV1為第1s用力呼氣量；FVC為用力呼氣量；MMEF為最大呼氣中段流速；PEF為呼氣峰流速。

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2.3 大鼠肺組織CHEM、CMKLR1 蛋白表達水平比較 運動組大鼠肺組織CHEM 蛋白表達高于對照組，CMKLR1 表達低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖2、表2。

表2 大鼠肺組織CHEM、CMKLR1蛋白表達水平比較（）

表2 大鼠肺組織CHEM、CMKLR1蛋白表達水平比較（）

注：CHEM為趨化素；CMKLR1為趨化因子受體-1。

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圖2 兩組大鼠肺組織CHEM、CMKLR1的蛋白免疫印跡

2.4 大鼠肺組織炎癥因子蛋白表達水平水平比較運動組大鼠肺組織IL-1β、IL-8 蛋白表達低于對照組（P<0.05）；運動組大鼠肺組織IL-6 和TNF-α 蛋白表達與對照組比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖3、表3。

表3 大鼠肺組織IL-8、TNF-α、IL-1β及IL-6蛋白表達水平比較（）

表3 大鼠肺組織IL-8、TNF-α、IL-1β及IL-6蛋白表達水平比較（）

注：IL-8為白細胞介素-8；TNF-α為腫瘤壞死因子-α；IL-1β為白細胞介素-1β；IL-6為白細胞介素-6。

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圖3 兩組大鼠肺組織IL-8、TNF-α、IL-1β、IL-6 的蛋白免疫印跡

3 討論

3.1 有氧運動對COPD 大鼠肺組織炎癥因子的影響本研究結(jié)果顯示，運動組大鼠肺組織IL-1β、IL-8 蛋白表達低于對照組（P<0.05），提示有氧運動可抑制COPD 大鼠肺組織的IL-1β、IL-8 蛋白表達。香煙煙霧是有效的促炎劑，其中的有毒顆?？纱┻^肺泡-毛細血管界面并進入全身血流循環(huán)，激活促炎細胞因子產(chǎn)生IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 等炎性因子［8-9］。COPD 涉及許多不同類型的炎性細胞，包括IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 等，肺組織IL-1β、IL-8 等分泌的增加會釋放更多的炎性介質(zhì)，形成復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)作用，共同誘發(fā)并加重COPD 慢性炎癥［10-11］。研究表明，C57BL/6J 小鼠香煙暴露后進行耐力運動干預(yù)可降低血漿中炎癥細胞因子，發(fā)揮明顯抗炎作用［12］，與本研究結(jié)論一致。有氧運動可減輕由煙暴露引起的促炎反應(yīng)和全身循環(huán)中細胞浸潤［13］，提示有氧運動可減輕COPD 小鼠的肺部炎癥和重塑反應(yīng)。分析原因，有氧運動可大幅提高氣道氣流，緩解細小支氣管的浸潤，促進氣道舒張與阻力減小，提高肺組織彈性，緩解肺氣腫與肺組織的炎性介質(zhì)沉積，對肺組織的炎癥反應(yīng)發(fā)揮抑制作用，進而減少了肺組織IL-1β、IL-8 分泌與表達［14］。此外，有氧運動可減少機體循環(huán)中炎癥細胞因子，減輕全身及局部炎癥。

3.2 有氧運動對COPD 大鼠肺功能的影響 本研究結(jié)果顯示，運動組大鼠MMEF、PEF 高于對照組（P<0.05），提示有氧運動可在一定程度上改善COPD 大鼠肺功能。國外研究認為，運動療法可作為COPD 的非藥物干預(yù)手段，通過抑制炎癥反應(yīng)來改善肺功能［15］，與本研究結(jié)論一致。分析原因，有氧運動可緩解胸膜與肺泡壓力，減小呼吸道阻力，延緩支氣管周纖維化及氣道壁增厚，使肺功能得以改善［16-17］。此外，有氧運動對肺組織炎癥反應(yīng)的抑制作用也是改善肺功能的途徑之一，隨著有氧運動對炎癥的抑制，肺組織中炎性介質(zhì)的沉積減少，氣道壁增厚與管腔變窄也能得到改善，進而增強肺部呼吸功能。有氧運動還能減輕機體應(yīng)激，緩解因應(yīng)激引起的肺功能障礙［18-19］。

3.3 有氧運動對CHEM/CMKLR1 的調(diào)控作用 本研究結(jié)果顯示，運動組大鼠肺組織中CHEM 蛋白表達高于對照組，CMKLR1 表達低于對照組（P<0.05），提示有氧運動可促進大鼠肺組織CHEM 蛋白表達并抑制CMKLR1 表達。CHEM/CMKLR1 被認為是有氧運動調(diào)控炎癥反應(yīng)的通路之一，其中CHEM 主要通過內(nèi)吞噬作用減少中性粒細胞炎癥并抑制炎性細胞因子釋放，發(fā)揮抗炎作用；而其受體CMKLR1 則可使樹突細胞和巨噬細胞遷移，募集炎癥因子、促進炎癥發(fā)展，發(fā)揮促炎作用［20-21］。因此CHEM/CMKLR1 的平衡是調(diào)控炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵，當CHEM 表達上調(diào)而CMKLR1 表達下調(diào)時，抗炎作用占主導(dǎo)；CHEM 表達下調(diào)而CMKLR1 表達上調(diào)時，促炎作用占主導(dǎo)［22-23］。有氧運動對COPD 大鼠肺組織CHEM 表達的促進作用及對CMKLR1 表達的下調(diào)作用，考慮與有氧運動減少了氣道CHEM 蛋白消耗，從而減弱了CMKLR1 趨化作用有關(guān)，在較大程度上避免了促炎細胞因子及炎性細胞在肺部大量積聚，是有氧運動調(diào)節(jié)COPD 炎癥反應(yīng)的信號通路之一［24-25］。

本研究不足之處：①CHEM/CMKLR1 通路只是有氧運動調(diào)控肺部炎癥的其中一個信號通路，尚有其他涉及的信號通路及作用機制仍有待發(fā)現(xiàn)與探討；②本次僅初步確認了CHEM/CMKLR1 參與有氧運動調(diào)控大鼠肺組織炎癥反應(yīng)的過程，但具體的調(diào)控過程仍有待在分子生物學(xué)水平上進行探討；③有氧運動的類型較多，運動方式及運動時間、運動量對COPD 的影響也有待進一步分析，從而為COPD 患者的有氧運動輔助治療方案提供參考。

綜上所述，有氧運動可通過對CHEM/CMKLR1 表達的影響抑制炎癥反應(yīng)，改善COPD 大鼠的肺功能。