何 陽,陸俊鴻,許崇搖,黃曉亮,韋 學(xué),李映新*

(1.賀州市人民醫(yī)院藥學(xué)部,廣西賀州 542899;2.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,廣西南寧 530021)

黑老虎[Kadsuracoccinea(Lem.)A.C.Smith]屬于木蘭科南五味子屬藤本植物,在我國西南地區(qū)海拔1 500～2 000 m林中有分布,以根和藤入藥,其味辛、稍苦,性溫,有祛風(fēng)活絡(luò)、調(diào)氣止痛的藥用功效[1]。黑老虎的果實(shí)碩大,為聚合漿果,成熟后果皮為紫紅色,形如荔枝,其果肉酸甜爽口且富含氨基酸、礦物質(zhì)、多糖、維生素等營養(yǎng)物質(zhì),且具有提高免疫力、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌失調(diào)的功效[2],苗人稱黑老虎為布福娜,寓意為健康長壽之果。近年來黑老虎的經(jīng)濟(jì)價(jià)值日益得到重視,我國很多地區(qū)開始人工種植黑老虎,除開其根、藤的藥用價(jià)值外,黑老虎果實(shí)也作為兼具食用及保健功能為一體的新型水果得到人們的喜愛。黑老虎果實(shí)為30～70個(gè)小漿果組成,果肉被厚重的果皮包裹,雖然整個(gè)果實(shí)體形碩大,但其果肉占果實(shí)體積比重不到50%,因此對(duì)黑老虎果皮開展研究,可促進(jìn)對(duì)黑老虎果實(shí)的綜合開發(fā)利用。廣西桂林的龍勝、資源等地有許多黑老虎專業(yè)種植基地,黑老虎果皮資源非常豐富。研究表明,黑老虎果皮主要含蛋白質(zhì)、多糖、纖維素、黃酮、多酚等成分,其提取物具有抑制酪氨酸酶的作用,并作為美白護(hù)膚品的原料具有極大的應(yīng)用前景[3-5]。黃酮是很多提取物中主要的活性物質(zhì),該研究采用超聲波輔助法提取桂林產(chǎn)黑老虎果皮總黃酮,通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝,并測(cè)定其對(duì)DPPH、ABTS+自由基的清除能力。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1試材。新鮮、成熟的黑老虎果實(shí)于2021年10月份購自廣西桂林種植基地,經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)生藥教研室朱丹教授鑒定為木蘭科南五味子屬藤本植物黑老虎[Kadsuracoccinea(Lem.)A.C.Smith]的果實(shí)。將黑老虎果皮分離并洗凈,經(jīng)60 ℃烘干,粉碎過篩(100目),密閉及干燥陰涼處保存。

1.1.2試劑。蘆丁對(duì)照品(10080-201608),中國藥品生物制品鑒定所;2,2’-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS),上海源葉生物科技有限公司;1,1-二苯基-三硝基苯肼(DPPH),上海源葉生物科技有限公司;抗壞血酸(含量>99.5%,批號(hào)20190408),成都科隆化工試劑廠;其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3主要儀器。KQ-500超聲清洗儀(昆山超聲儀器有限公司);ME-204型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);UV-1240型紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司);Spectramax Plus384連續(xù)波長酶標(biāo)儀(美國MD公司);TDL-5A低速臺(tái)式離心機(jī)(上海菲恰爾分析儀器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法[6]繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱取10.0 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL棕 色容量瓶中,加50%乙醇溶解并定容到刻度,即得200 μg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精確量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL于5 mL容量瓶中,各加5%亞硝酸鈉 0.15 mL,搖勻,靜置6 min,加入10%硝酸鋁0.15 mL,搖勻,靜置6 min,加4%氫氧化鈉2 mL,再加水置刻度,搖勻,靜置15 min,以等體積的溶劑代替樣品溶液作為調(diào)零管,在500 nm處測(cè)定吸光度。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行對(duì)照。以平均吸光度為縱坐標(biāo)、蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程為Y=7.893 1X+0.000 3(R2=0.999 1),說明蘆丁質(zhì)量濃度在8～64 μg/mL與吸光度有較好的線性相關(guān)性。

1.2.2黑老虎果皮總黃酮的含量測(cè)定。準(zhǔn)確稱取0.5 g黑老虎果皮粗粉,按照一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇、料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間在超聲功率為250 W條件下進(jìn)行超聲提取,提取液以3 000 r/min離心10 min去除殘?jiān)?取上清液0.5 mL,按照“1.2.1”的步驟進(jìn)行操作。將吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,計(jì)算提取液中總黃酮濃度。按照以下公式計(jì)算總黃酮的提取率:

總黃酮提取率(mg/g)=CX/M

(1)

式中:M為黑老虎果皮的質(zhì)量(g);X為將吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線算出的總黃酮濃度(mg/mL);C為容量系數(shù),C=Vm×V0/Vn,其中,Vm為顯色反應(yīng)體系的容積(mL),V0為提取液的體積(mL),Vn為從提取液中量取用于顯色反應(yīng)的體積(mL)。

1.2.3單因素試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取0.5 g 黑老虎果皮粗粉,固定超聲功率為250 W,分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(20%、30%、40%、50%、60%、70%)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)、超聲時(shí)間(20、30、40、50、60、70 min)、超聲溫度(20、30、40、50、60、70 ℃)對(duì)提取率的影響。以其中一個(gè)因素水平作為自變量,其他因素水平為控制變量,在不同條件下進(jìn)行超聲提取,提取液按照“1.2.2”處理,計(jì)算黑老虎果皮總黃酮的提取率。

1.2.4正交試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,以乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)、超聲時(shí)間(C)、超聲溫度(D)作為考察因素,選取每個(gè)因素的3個(gè)影響顯著的水平,設(shè)計(jì) L9(34)正交試驗(yàn),用總黃酮提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo),選取最佳提取工藝參數(shù)。

1.2.5黑老虎果皮總黃酮抗氧化能力測(cè)定。

1.2.5.1對(duì)DPPH自由基的清除率測(cè)定。根據(jù)正交試驗(yàn)優(yōu)化的工藝參數(shù)提取得到樣品,凍干后用40%乙醇配制成1 mg/mL 的樣品溶液。參照文獻(xiàn)方法[6-8],準(zhǔn)確量取50.00～800.00 μL的一系列體積的樣品溶液于試管中,加入40 μg/mL的DPPH無水乙醇溶液2.0 mL,加入無水乙醇使反應(yīng)體系總體積均為4 mL,搖勻,室溫下避光放置 30 min,調(diào)零管以等量無水乙醇代替DPPH,測(cè)定517 nm下吸光度(A1);另以等體積40%乙醇替換樣品液與DPPH反應(yīng)并測(cè)定吸光度(A0),以無水乙醇做空白調(diào)零。通過公式(2)計(jì)算DPPH自由基清除率。以抗壞血酸為陽性對(duì)照,同法測(cè)定抗壞血酸對(duì)DPPH的清除率,并計(jì)算黑老虎果皮總黃酮對(duì)DPPH自由基清除能力的抗壞血酸當(dāng)量(AEAC),AEAC=IC50(VC)/IC50(總黃酮)×103。每個(gè)濃度均設(shè)3組平行對(duì)照,取平均吸光度計(jì)算。

DPPH自由基清除率=(1-A1/A0)×100%

(2)

1.2.5.2對(duì)ABTS+自由基的清除率測(cè)定[9]。根據(jù)正交試驗(yàn)優(yōu)化的工藝參數(shù)提取得到樣品,凍干后用40%乙醇配制成1 mg/mL 的樣品溶液。將ABTS水溶液儲(chǔ)備液(7.4 mmol/L)和過硫酸鉀水溶液儲(chǔ)備液(2.6 mmol/L)等體積混合,于室溫避光放置12～16 h制成ABTS+自由基工作液。將ABTS+自由基工作液用PBS(0.01 mol/L,pH 7.4)稀釋,以PBS(0.01 mol/L,pH 7.4)調(diào)零,測(cè)定734 nm處吸光度,吸光度在0.70±0.02時(shí)可使用。準(zhǔn)確量取0～50.00 μL的一系列體積的樣品溶液于96孔板中,每孔加入200 μL ABTS+自由基工作液,再加入40%乙醇使反應(yīng)體系總體積為250 μL,混勻并避光反應(yīng)5 min后,采用酶標(biāo)儀測(cè)定734 nm下的吸光度(A),另設(shè)以等量40%乙醇替代樣品,測(cè)定吸光度(A0),通過公式計(jì)算ABTS+自由基清除率。以抗壞血酸為陽性對(duì)照,同法測(cè)定抗壞血酸對(duì)ABTS+自由基的清除率,并計(jì)算黑老虎總黃酮對(duì)ABTS+自由基清除能力的抗壞血酸當(dāng)量(AEAC)。每個(gè)濃度均設(shè)3組平行對(duì)照,取平均吸光度計(jì)算。

ABTS+自由基清除率=(A0-A)/A0×100%

(3)

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黑老虎果皮總黃酮提取率的影響。從圖1可以看出,黑老虎果皮總黃酮提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而增加,到乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí),提取率達(dá)到最高,之后即使提高乙醇體積分?jǐn)?shù)也不能增加提取率,反而逐漸降低,可能是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)改變引起溶劑極性發(fā)生改變,黑老虎果皮總黃酮溶出減少,同時(shí)醇溶性物質(zhì)的溶解性增加,降低了總黃酮的提取率。因此,選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、50%、60%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黑老虎果皮總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on the extraction rate of total flavonoids from Kadsura coccinea pericarp

2.1.2料液比對(duì)黑老虎果皮總黃酮提取率的影響。由圖2可知,黑老虎果皮總黃酮提取率隨著提取溶劑體積增加而增加,在料液比為1∶40達(dá)到最大,之后增加提取溶劑體積反而使提取率略微下降,可能是其他成分物質(zhì)更多溶出的緣故。因此,料液比選擇1∶30、1∶40、1∶50進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖2 料液比對(duì)黑老虎果皮總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids from Kadsura coccinea pericarp

2.1.3超聲時(shí)間對(duì)黑老虎果皮總黃酮提取率的影響。由圖3可知,超聲提取20～50 min,黑老虎果皮總黃酮提取率隨著超聲時(shí)間增加而緩慢增加,提取50 min的提取率最高,之后增加超聲時(shí)間反而使提取率降低。因此,超聲時(shí)間選擇40、50、60 min進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.4超聲溫度對(duì)黑老虎果皮總黃酮提取率的影響。由圖4可知,隨著超聲溫度增加,黑老虎果皮總黃酮提取率也增加,在50 ℃時(shí)提取率最大,之后,提高超聲溫度,提取率反而下降,可能是溫度達(dá)到一定后,其他類物質(zhì)的溶出也增加,減少了總黃酮的比重。因此,超聲溫度選擇40、50、60 ℃進(jìn)行正

圖4 超聲溫度對(duì)黑老虎果皮總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate of total flavonoids from Kadsura coccinea pericarp

交試驗(yàn)。

2.2 正交試驗(yàn)從表1可以看出,黑老虎果皮總黃酮最優(yōu)提取方案為A1B2C3D3,即乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、料液比1∶40、超聲時(shí)間60 min、超聲溫度60 ℃。各個(gè)因素對(duì)總黃酮提取率的影響從大到小依次為A>D>C>B,即乙醇體積分?jǐn)?shù)>超聲溫度>超聲時(shí)間>料液比,由方差分析(表2)可知,乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)的F值大于F臨界值,對(duì)總黃酮提取率具有顯著影響。按正交結(jié)果所得的最優(yōu)提取條件做6次平行提取,得到總黃酮平均提取率為(22.48±0.40)mg/g,RSD為1.78%。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果分析

表2 正交試驗(yàn)方差分析

2.3 抗氧化試驗(yàn)

2.3.1黑老虎果皮總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除能力。從圖5可以看出,黑老虎果皮總黃酮和抗壞血酸(VC)對(duì)DPPH自由基的清除率與質(zhì)量濃度均呈正相關(guān),經(jīng)計(jì)算得到IC50分別為204.57、8.84 μg/mL,黑老虎果皮總黃酮對(duì)DPPH自由基清除能力的抗壞血酸當(dāng)量(AEAC)為43.21 mg/g,即1 g黑老虎果皮總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除能力相當(dāng)于43.21 mg 抗壞血酸。

圖5 黑老虎果皮總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.5 Scavenging rate of total flavonoids from Kadsura coccinea pericarp on DPPH free radicals

2.3.2黑老虎果皮總黃酮對(duì)ABTS+自由基的清除能力。從圖6可以看出,黑老虎果皮總黃酮和抗壞血酸(VC)對(duì)ABTS+自由基的清除率有劑量依賴性,經(jīng)計(jì)算得到IC50分別為116.03、15.02 μg/mL,黑老虎果皮總黃酮對(duì)ABTS+自由基清除能力的抗壞血酸當(dāng)量(AEAC)為129.45 mg/g,即1 g黑老虎果皮總黃酮對(duì)ABTS+自由基的清除能力相當(dāng)于129.45 mg抗壞血酸。

圖6 黑老虎果皮總黃酮對(duì)ABTS+自由基的清除率Fig.6 Scavenging rate of total flavonoids from Kadsura coccinea pericarp on ABTS+ free radicals

3 討論與結(jié)論

總黃酮是很多植物中一類重要的次生代謝產(chǎn)物,具有多種生理活性,黑老虎果皮中總黃酮含量較高,且研究表明,總黃酮具有抗氧化和抗酪氨酸酶的功效[10-11],是很多植物提取物中發(fā)揮美白、抗炎、抗衰老作用的主要活性成分,因此,對(duì)黑老虎果皮總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化以提高總黃酮在黑老虎果皮提取物中的含量,可更好地提高黑老虎果皮提取物美白護(hù)膚的作用效果。

該研究采用超聲輔助提取法進(jìn)行提取,該法具有節(jié)能、環(huán)保、效率高的優(yōu)點(diǎn),特別適合熱不穩(wěn)定性物質(zhì)的提取。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上通過正交試驗(yàn)對(duì)桂林產(chǎn)黑老虎果皮總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,得到最優(yōu)提取條件為用40%乙醇以料液比1∶40在60 ℃下超聲60 min,其中乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率具有顯著的影響,按照最優(yōu)提取條件做6次平行提取,得到總黃酮平均提取率為(22.48±0.40)mg/g,RSD為1.78%,說明該方法重復(fù)性好,工藝可行性高。