馮柳俊,陳志強(qiáng)*,陳志彪,羅立津,王 健

1.福建省濕潤(rùn)山地生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室—省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,福建福州 350007;2.福建師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院,福建福州 350007;3.福建省微生物研究所環(huán)境微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,福建福州 350007)

干旱脅迫是降雨量不足或土壤水分不足的結(jié)果,是限制植物生長(zhǎng)的最主要環(huán)境脅迫之一。干旱脅迫可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生各種生理生化反應(yīng),極大地限制了植物的生長(zhǎng)[1-2]。已有研究表明,干旱脅迫破壞了活性氧(ROS)的合成和清除之間的平衡,如超氧陰離子自由基(O2-·)和過(guò)氧化氫(H2O2)等。過(guò)量的ROS可破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能[3],導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化和丙二醛(MDA)的積累,DNA和細(xì)胞蛋白質(zhì)的氧化損傷,以及細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)的泄漏,相對(duì)電導(dǎo)率(REC)的上升[3]。植物的抗氧化防御系統(tǒng)促進(jìn)超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶的調(diào)節(jié),降低活性氧的有害影響。SOD能夠歧化O2-·,是植物抗氧化的第一道防線;POD和CAT能夠分解H2O2,是植物抵御氧化損害的另一重要保護(hù)措施[4]。除了抗氧化防御系統(tǒng)外,滲透調(diào)節(jié)在植物抵抗干旱脅迫中同樣發(fā)揮著關(guān)鍵作用,脯氨酸(Pro)在其中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[5]。Pro的積累能夠降低細(xì)胞內(nèi)的滲透勢(shì),增加細(xì)胞液的濃度,并提高細(xì)胞從外部吸收水分的能力,保持植物細(xì)胞的膨脹壓力。因此,植物能夠通過(guò)調(diào)節(jié)自身的抗逆生理活動(dòng),增強(qiáng)自身對(duì)干旱脅迫環(huán)境的適應(yīng)。

南方紅壤侵蝕區(qū)是我國(guó)僅次于黃土高原的第二大典型水土流失區(qū)。該區(qū)域土壤母巖主要為花崗巖,極易受到雨水飛濺和地表水流的侵蝕,尤其是在裸露的土地上;加上該區(qū)域降水時(shí)空分布不均、多暴雨、地勢(shì)起伏等地理特征,水土流失嚴(yán)重。同時(shí),人類不合理利用自然資源,進(jìn)一步加劇了生態(tài)的破壞,極大制約了該區(qū)域的社會(huì)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展[6]。植物在南方紅壤侵蝕區(qū)水土保持和生態(tài)修復(fù)中起著關(guān)鍵作用[7]。芒萁[Dicranopterispedata(Thunb.) Berhn.]為多年生里白科蕨類植物,常見于我國(guó)南方低山丘陵地區(qū)以及日本、越南、印度等國(guó)家,其耐酸且耐貧瘠,在生態(tài)破壞和退化過(guò)程中最后退出,而在生態(tài)恢復(fù)過(guò)程中最先進(jìn)入生態(tài)系統(tǒng)[8]。因此,芒萁是南方紅壤侵蝕區(qū)重要的水土保持植物,其生長(zhǎng)和覆蓋對(duì)南方紅壤侵蝕區(qū)具有重要意義。由于季節(jié)性降水分布不均且多暴雨,夏秋尤其是秋季氣溫高而蒸發(fā)量大;暴雨后紅壤易板結(jié),滲透性減弱,降水多形成地表徑流而不補(bǔ)充地下水;紅壤黏粒比例高,比表面積大,牢牢吸附水分子,從而制約了植物對(duì)土壤水分的吸收;人類活動(dòng)對(duì)土壤結(jié)構(gòu)的破壞,紅壤蓄水能力下降[9]等,南方紅壤侵蝕區(qū)雖然降水較多,但季節(jié)性土壤干旱現(xiàn)象常見。前人研究表明,土壤水分是限制芒萁生長(zhǎng)的主要因素[6]。然而,目前有關(guān)芒萁的相關(guān)研究主要集中在生長(zhǎng)特性、培育、化感作用、生態(tài)化學(xué)計(jì)量學(xué)、生態(tài)恢復(fù)、分布、植物修復(fù)和藥用價(jià)值,鮮有關(guān)于芒萁如何抵御季節(jié)性土壤干旱脅迫的報(bào)道。因此,研究芒萁的抗旱性是利用芒萁治理南方紅壤侵蝕區(qū)水土流失和生態(tài)破壞的關(guān)鍵之一。筆者設(shè)計(jì)PEG 6 000模擬不同程度的干旱脅迫試驗(yàn),通過(guò)分析干旱脅迫下芒萁的生理特性及增強(qiáng)芒萁抵御干旱脅迫能力的主要因子,探討芒萁的抗旱機(jī)制,以期為利用芒萁治理南方紅壤侵蝕區(qū)水土流失和生態(tài)修復(fù)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 干旱脅迫處理在福建師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院采用盆栽方式種植60株生長(zhǎng)狀況相似的芒萁幼苗(43 cm×19 cm×14 cm),每株幼苗保留15 cm的地下莖和足夠的細(xì)根,以確保存活。該試驗(yàn)所用土壤來(lái)自典型的紅壤侵蝕區(qū)福建省長(zhǎng)汀縣河田鎮(zhèn)。土壤經(jīng)風(fēng)干、過(guò)篩、充分混合后裝入盆中,土壤養(yǎng)分情況:碳含量為5.50 g/kg,氮含量為0.60 g/kg,磷含量為0.16 g/kg,速效磷含量為1.73 mg/kg,銨態(tài)氮含量為16.16 mg/kg,硝態(tài)氮含量為5.79 mg/kg,速效氮含量為21.95 mg/kg,pH為4.68。每個(gè)花盆裝7 kg土壤,每盆移栽1株幼苗。培養(yǎng)90 d后,選擇45株生長(zhǎng)狀況較好且相似的植株,在福建省微生物研究所環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行PEG 6 000模擬干旱脅迫試驗(yàn)。將芒萁轉(zhuǎn)移到透明玻璃盆(25 cm×10 cm×10 cm)中,置于光照培養(yǎng)箱內(nèi),晝夜光照時(shí)間和溫度設(shè)置分別為18 h/8 h和25 ℃/20 ℃。設(shè)計(jì)不同濃度的PEG 6 000(10%、20%、30%和40%)和對(duì)照(不含PEG 6 000的純水)對(duì)45株芒萁植株進(jìn)行處理,每種措施3個(gè)重復(fù)。10%、20%、30%和40%濃度PEG 6 000處理組和對(duì)照組分別命名為P10、P20、P30、P40和CK。干旱脅迫后,剪下葉片樣品用液氮速凍,并儲(chǔ)存在冰箱-80 ℃下待測(cè)。

1.2 樣品處理試驗(yàn)方法參照《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》[10-11]。采用氮藍(lán)四唑法檢測(cè)SOD,采用愈創(chuàng)木酚法檢測(cè)POD,采用紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)CAT,采用磺基水楊酸法檢測(cè)Pro,采用電導(dǎo)儀檢測(cè)REC,采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA。

1.3 數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)由MS EXCEL 2010收集和整理;采用IBM SPSS Statistics 22.0(IBM Corp.,Armonk,NY,USA)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析;采用單因素方差分析(One-way ANOVA)統(tǒng)計(jì)顯著性差異水平;在顯著性水平P<0.05時(shí),使用最小顯著性差異檢驗(yàn)組間平均值的差異;采用Pearson相關(guān)分析法對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析,并采用主成分分析法評(píng)價(jià)不同PEG 6 000 濃度下芒萁的抗旱性;采用Origin 9.0制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 REC和MDA含量比較隨著PEG 6 000濃度的升高,芒萁葉片MDA和REC逐漸增大。P10、P20、P30和P40處理的MDA含量和REC均顯著高于CK(P<0.05)。P10、P20、P30和P40處理MDA含量分別是CK的1.39、1.64、1.62和1.60倍,REC分別比CK高61.93%、66.56%、69.27%和73.25%。然而,各處理間的MDA和REC均無(wú)顯著差異(圖1)。

注:不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicate significant difference among treatments(P<0.05).圖1 PEG模擬干旱脅迫下芒萁MDA含量和RECFig.1 MDA content and REC in Dicranopteris pedata subjected to drought stress induced by PEG 6 000

2.2 抗氧化酶活性比較隨著PEG 6 000濃度的升高,SOD和POD活性呈先升高后降低的趨勢(shì)。相反,CAT活性先降低后升高。與CK相比,不同濃度PEG 6 000處理顯著提高了芒萁SOD活性(P<0.05),且P20處理達(dá)到最高(1 588.11 U/g),且高于P10、P30和P40處理。P10處理POD活性[0.74 U/(g·min)]顯著高于CK(P<0.05),但P20、P30和P40處理顯著低于CK(P<0.05)。P10、P20處理CAT活性與CK無(wú)顯著差異(P<0.05);P30和P40處理顯著低于CK(P<0.05);P40處理CAT活性顯著高于P30處理(P<0.05)(圖2)。

注:不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicate significant differences among treatments(P<0.05).圖2 PEG模擬干旱脅迫下芒萁抗氧化酶活性Fig.2 Antioxidase activities of Dicranopteris pedata in response to drought stress induced by PEG 6 000

2.3 Pro含量比較隨著PEG 6000濃度的增加,芒萁葉中Pro含量先緩慢增加,然后急劇上升再下降。方差分析結(jié)果表明,P10處理Pro含量與CK無(wú)顯著差異,P20、P30和P40處理顯著高于CK和P10處理(P<0.05)。P30處理Pro濃度達(dá)到最高,為CK的4.20倍(圖3)。

注:不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicate significant differences among treatments(P<0.05).圖3 PEG模擬干旱脅迫下芒萁脯氨酸含量Fig.3 Proline levels in Dicranopteris pedata in response to drought stress induced by PEG 6 000

2.4 相關(guān)性分析由表1可知,除SOD與POD、CAT,REC與POD、CAT、MDA無(wú)相關(guān)性外,其他生理指標(biāo)間均顯著或極顯著相關(guān)(P<0.05,P<0.01)。

表1 各生理指標(biāo)相關(guān)性分析

2.5 主成分分析主成分分析結(jié)果顯示,有2個(gè)主成分的特征根大于1,其中第1個(gè)主成分的特征值為3.73,第2個(gè)主成分的特征值為1.16(表2)。前2個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到81.36%,因此前2個(gè)主成分可以解釋芒萁抗旱指標(biāo)的大部分信息。Yi代表芒萁抗旱能力的第i個(gè)綜合指數(shù),Zx1、Zx2、Zx3、Zx4、Zx5和Zx6分別表示SOD、POD、CAT、Pro、REC和MDA的標(biāo)準(zhǔn)值。主成分表達(dá)式如下:

表2 總方差解釋

Y1=0.38Zx1- 0.37Zx2- 0.38Zx3+0.46Zx4+0.43Zx5+0.42Zx6

(1)

Y2=0.55Zx1+0.36Zx2+0.51Zx3-0.32Zx4+0.40Zx5+0.22Zx6

(2)

將6項(xiàng)脅迫生理指標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,并逐一納入式(1)、(2),計(jì)算各主成分得分。然后,對(duì)主成分得分進(jìn)行加權(quán)求和,得到芒萁抗旱能力的綜合評(píng)價(jià)結(jié)果。根據(jù)芒萁的抗旱性得分,從高到低依次為P30、P40、P20、P10和CK。P20、P30和P40處理芒萁的抗旱性評(píng)分分別為0.94、1.11和1.10,遠(yuǎn)高于CK和P10處理(表3)。

表3 抗旱性綜合得分

3 討論

3.1 干旱脅迫對(duì)芒萁細(xì)胞膜的損害干旱脅迫減弱了植物的碳同化過(guò)程和光系統(tǒng) Ⅱ 復(fù)合體活性,導(dǎo)致激發(fā)能增加和能量過(guò)剩。因此,植物體內(nèi)ROS的合成和清除之間的平衡被破壞,導(dǎo)致ROS的積累和質(zhì)膜過(guò)氧化,并增加MDA含量。此外,質(zhì)膜過(guò)氧化會(huì)破壞植物細(xì)胞膜的通透性,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)的泄漏。因此,MDA和REC常被用作評(píng)價(jià)細(xì)胞膜脂質(zhì)損傷程度的指標(biāo)[12]。該研究中,隨著PEG 6 000濃度的升高,REC和MDA逐漸升高。P10、P20、P30和P40處理的芒萁REC和MDA水平顯著高于CK。這表明干旱脅迫已經(jīng)造成了芒萁體內(nèi)ROS積累,質(zhì)膜氧化導(dǎo)致MDA的大量產(chǎn)生。同時(shí),干旱脅迫破壞了質(zhì)膜的選擇性通透性,導(dǎo)致大量無(wú)機(jī)離子、氨基酸和可溶性糖等小分子的泄漏,導(dǎo)致REC的顯著提高。然而,不同PEG 6 000處理的REC值和MDA含量差異不大。這說(shuō)明遇到干旱脅迫時(shí),芒萁能夠調(diào)節(jié)生理活動(dòng),提高ROS清除能力,快速應(yīng)對(duì)干旱脅迫。即使在極嚴(yán)重干旱脅迫下,芒萁也能有效減輕脅迫的危害,該研究中P30和P40處理REC和MDA的增量無(wú)顯著性差異便是最佳證據(jù)。有學(xué)者對(duì)沙棘[13]、煙草[14]和花生[15]的研究結(jié)果表明,隨著干旱脅迫程度的提升,植物體內(nèi)MDA含量顯著增加,大麗花[16]的研究也揭示了干旱條件下MDA和REC的增加,都與該研究的結(jié)果相似。不同之處在于,盡管各處理的值都顯著高于CK組,芒萁MDA和REC的水平也不會(huì)隨著PEG 6 000濃度的升高繼續(xù)激增。可見,與普通植物相比,芒萁具有較強(qiáng)的抗旱性。

3.2 芒萁的抗氧化酶活性隨著干旱脅迫的加劇,芒萁的SOD和POD活性先升高后降低。雖然SOD活性在P20處理達(dá)到最大值,然后持續(xù)下降,但P10、P20、P30和P40處理組的酶活性仍高于CK。POD活性在P10處理達(dá)到最高水平,此后顯著下降。CAT活性隨PEG 6 000濃度的增加而降低,但在濃度為40%時(shí)有所反彈。芒萁CAT活性高于POD活性。因此,在干旱脅迫下,芒萁可以誘導(dǎo)3種抗氧化酶的表達(dá)以清除ROS。相關(guān)分析表明,SOD與REC、SOD與MDA之間存在極顯著相關(guān)(P<0.01),表明干旱脅迫后芒萁細(xì)胞膜由于O2-·的過(guò)度積累而被氧化,于是SOD活性提高,減少了對(duì)質(zhì)膜的氧化損傷。POD和CAT水平與MDA呈負(fù)相關(guān),表明POD和CAT活性影響了芒萁對(duì)干旱脅迫的反應(yīng)。當(dāng)干旱脅迫程度較低時(shí),POD和CAT共同清除H2O2。然而,在較高的干旱脅迫下,POD的合成受到限制,POD活性下降。在這種情況下,H2O2的主要清除劑為CAT。P40處理芒萁CAT活性顯著增加是有力證據(jù)。對(duì)沙棘[13]、煙草[14]、花生[15]以及大麗花[16]的研究均證明了干旱脅迫誘導(dǎo)ROS的積累,使植物體內(nèi)SOD、POD和CAT的酶活性先升高后降低的結(jié)論。該研究中,SOD和POD活性的變化與前人研究結(jié)果相似。然而,不同的是芒萁CAT活性隨干旱強(qiáng)度增強(qiáng)呈先下降后上升趨勢(shì)。番茄幼苗CAT活性[17]和薊葉[18]的研究結(jié)果表明,CAT對(duì)干旱脅迫反應(yīng)緩慢,在早期或輕度脅迫下較低,但隨著脅迫時(shí)間和脅迫水平的增加而增加,這與該研究P30和P40處理的結(jié)果相似。然而,低脅迫處理CAT活性也較高,這與前人的研究結(jié)果相矛盾。這種變化特征可能是由于干旱脅迫下,芒萁的POD活性很低,從而刺激了CAT活性以清除H2O2。因此,SOD和CAT是芒萁酶促抗氧化系統(tǒng)中ROS的主要清除劑。

3.3 Pro對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)滲透調(diào)節(jié)是植物適應(yīng)干旱和鹽脅迫等惡劣環(huán)境的一種生理活動(dòng)。植物細(xì)胞在脅迫條件下積累有機(jī)和無(wú)機(jī)物質(zhì),以降低細(xì)胞內(nèi)滲透勢(shì),試圖減少水分損失,維持膨壓,以適應(yīng)干旱惡劣環(huán)境[19]。因此,滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)植物應(yīng)對(duì)干旱脅迫至關(guān)重要。Pro是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),可以平衡植物細(xì)胞的滲透勢(shì)。該研究中,P10處理的Pro含量略有增加,然后急劇上升,并在P30處理達(dá)到峰值。因此,干旱脅迫顯著誘導(dǎo)了芒萁的滲透調(diào)節(jié)機(jī)制,降低水勢(shì),促進(jìn)水分吸收。這維持了芒萁的生理活動(dòng),如細(xì)胞膨脹和生長(zhǎng)、光合作用和氣孔功能等,并最終緩解了干旱脅迫的危害。這與前人對(duì)冬小麥[20]、毛白楊[21]、大葉槭、臭椿、黃連木[22]的研究結(jié)果相似。然而,P40處理Pro水平下降,這是由于過(guò)度干旱脅迫影響了關(guān)鍵酶二氫吡咯-5-羧酸合酶,導(dǎo)致Pro含量下降。前人研究表明,植物在過(guò)度干旱脅迫后合成Pro的能力降低,導(dǎo)致Pro水平下降[23]。如水稻抗旱性研究報(bào)道了過(guò)度應(yīng)激后Pro含量的下降[24]。值得注意的是,P30處理的Pro含量達(dá)到最大值,而CAT活性也在P30處理開始增加。因此,低干旱脅迫下CAT活性的降低與Pro的積累有關(guān),Pro可以減少ROS,尤其是H2O2,防止質(zhì)膜過(guò)氧化,此時(shí)無(wú)需高活性CAT清除ROS。此外,Pro的變化趨勢(shì)與主成分抗旱性評(píng)價(jià)得分的排序相似。主成分分析結(jié)果表明,芒萁的抗旱性得分隨著PEG 6 000濃度的增加而增加,在PEG 6 000濃度為30%時(shí)達(dá)到峰值,在PEG 6 000濃度為40%時(shí)下降,呈現(xiàn)單峰趨勢(shì)。Pro同樣顯示出單峰趨勢(shì),在30% PEG 6 000 時(shí)達(dá)到峰值,隨后下降。因此,芒萁的強(qiáng)抗旱性與Pro有密切關(guān)系。Pro與其他5個(gè)指標(biāo)均存在顯著的相關(guān)關(guān)系也證明了該結(jié)論。這一結(jié)果表明,在干旱脅迫后,芒萁合成并積累Pro,并與抗氧化酶SOD、POD和CAT協(xié)同作用,增強(qiáng)抗旱性。因此,Pro的合成和積累對(duì)芒萁干旱脅迫的響應(yīng)中極為重要。

4 結(jié)論

該研究揭示了南方紅壤侵蝕區(qū)芒萁抵御干旱脅迫的生理機(jī)制。芒萁在干旱缺水的惡劣環(huán)境中的生存與其抗逆生理特性有關(guān),包括抗氧化酶活性的快速誘導(dǎo)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累。然而,當(dāng)干旱脅迫較為嚴(yán)重時(shí),抗旱機(jī)制受到影響,抗旱能力減弱。其中,抗氧化酶SOD和CAT以及滲透調(diào)節(jié)因子Pro是芒萁抵抗干旱脅迫的關(guān)鍵生理因子。因此,作為一種優(yōu)良的水土保持植物,芒萁能夠適應(yīng)季節(jié)性土壤干旱,是其能夠在我國(guó)南方紅壤侵蝕區(qū)生態(tài)修復(fù)和水土保持方面發(fā)揮重要作用的重要原因。