程蘭蘭，陳君平，呂東來，徐軍#

解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇一醫(yī)院1病理科，2腫瘤一科，合肥 230031

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）-酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）已成為EGFR突變的晚期非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者一線治療的首選藥物，但大量患者表現(xiàn)出原發(fā)性或獲得性耐藥和腫瘤進(jìn)展。培美曲塞聯(lián)合鉑類方案化療仍是目前臨床應(yīng)對EGFR-TKI 治療失敗患者的常用治療手段，探索能有效預(yù)測二線化療療效的分子標(biāo)志物可為臨床制訂個(gè)體化治療方案提供參考。Napsin A是目前診斷肺腺癌最常用的標(biāo)志物之一，也是早期肺癌手術(shù)切除后的預(yù)后評估指標(biāo)[1-3]。研究報(bào)道，接受培美曲塞化療的NSCLC中NapsinA基因表達(dá)與胸苷酸合成酶（thymidylate synthase，TS）水平和患者預(yù)后相關(guān)[4]，TS 是培美曲塞的靶酶，其表達(dá)情況與培美曲塞的療效密切相關(guān)。本研究探討Napsin A 表達(dá)與培美曲塞聯(lián)合鉑類方案二線治療NSCLC 患者療效及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年1 月至2021 年6 月解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇一醫(yī)院收治的肺癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①組織學(xué)分型為肺腺癌；②臨床分期為ⅢB～Ⅳ期；③EGFR突變陽性且一線接受EGFR-TKI 治療后進(jìn)展；④年齡≥18 歲；⑤有耐藥后二次活檢EGFR、Kirsten 鼠肉瘤病毒癌基因同源物（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）、腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）和T790M 基因突變檢測結(jié)果，且有足夠可用的組織用于免疫組化檢測；⑥后續(xù)至少接受2 個(gè)周期培美曲塞聯(lián)合鉑類化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①肝腎功能、血常規(guī)及心電圖異常；②既往接受過培美曲塞或吉西他濱等治療。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入64 例肺腺癌患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過，所有患者均知情同意。

1.2 基因突變檢測

所有標(biāo)本用10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋。應(yīng)用FFPE 樣品DNA 分類試劑盒提取DNA，人類EGFR等多基因突變檢測試劑盒均購自廈門艾德生物醫(yī)藥有限公司，詳細(xì)操作參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 免疫組化染色及結(jié)果判定

采用BenchMark-GX 全自動免疫組化儀進(jìn)行免疫組化染色，采用EnVision 二步法。兔抗人單克隆抗體Napsin A 購自福州邁新公司，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）代替一抗作為陰性對照，用已知陽性的手術(shù)切除肺腺癌組織作為陽性對照。Napsin A 定位于細(xì)胞質(zhì)，使用半定量法來確定免疫組化評分。陽性細(xì)胞百分比評分：無陽性細(xì)胞為0 分，1%～10%為1 分，11%～50%為2 分，51%～80%為3 分，＞80%為4 分；染色強(qiáng)度評分：無染色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。兩項(xiàng)評分相乘，總分≥4 分定義為陽性，＜4 分定義為陰性。

1.4 療效評價(jià)及預(yù)后分析

根據(jù)實(shí)體瘤療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[5]評價(jià)療效，分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、疾病穩(wěn)定（SD）和疾病進(jìn)展（PD）?？陀^緩解率（objective response rate，ORR）=（CR+PR）例數(shù)/總例數(shù)×100%，疾病控制率（disease control rate，DCR）=（CR+PR+SD）例數(shù)/總例數(shù)×100%。無進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）定義為二線治療開始至疾病進(jìn)展或尚未出現(xiàn)疾病進(jìn)展的末次隨訪時(shí)間，總生存期（overall survival，OS）定義為二線治療開始至因任何原因死亡的時(shí)間或末次隨訪時(shí)間。隨訪截止時(shí)間為2022 年12 月31 日。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法；采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，生存情況的比較采用Log-rank 檢驗(yàn)；影響因素分析采用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同臨床特征肺腺癌患者肺腺癌組織中Napsin A 表達(dá)情況的比較

64 例肺腺癌患者中，EGFR少見突變8 例，其中L861Q 和S768I 共突變2 例，G719X 突變4 例，19del 和L858R 共突變2 例；19del 繼發(fā)T790M 突變8 例，L858R 繼發(fā)T790M 突變5 例。Napsin A 在肺腺癌組織中呈細(xì)顆粒狀著色，陽性表達(dá)率為73.4%（47/64）。不同性別、年齡、吸煙史、EGFR突變類型、KRAS狀態(tài)、TP53狀態(tài)及繼發(fā)T790M 突變情況的肺腺癌患者肺腺癌組織中Napsin A 表達(dá)情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；國際肺癌研究協(xié)會（International Association for the Study of Lung Cancer，IASLC）分級為Ⅰ或Ⅱ級的肺腺癌患者肺腺癌組織中Napsin A 陽性表達(dá)率明顯高于IASLC分級為Ⅲ級的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 不同臨床特征肺腺癌患者肺腺癌組織中Napsin A 表達(dá)情況的比較

2.2 近期療效分析

64 例EGFR突變肺腺癌患者接受培美曲塞聯(lián)合鉑類二線治療后，CR 0 例，PR 17 例，SD 39 例，PD 8 例，ORR 為26.6%，DCR 為87.5%。女性患者ORR 高于男性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.460，P=0.044）；Napsin A 陽性患者DCR 明顯高于Napsin A 陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.997，P=0.003）。（表2）

表2 不同臨床特征EGFR 突變肺腺癌患者接受培美曲塞聯(lián)合鉑類二線治療的近期療效

2.3 二線治療后PFS 影響因素的單因素分析和多因素分析

單因素及多因素分析結(jié)果顯示，Napsin A 陽性、聯(lián)合貝伐珠單抗治療、無繼發(fā)T790M 突變均是EGFR突變肺腺癌患者接受培美曲塞聯(lián)合鉑類二線治療后PFS 的保護(hù)因素（表3）。采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，結(jié)果顯示，64 例患者中位PFS 為5.0 個(gè)月（95%CI：4.120～5.880 個(gè)月）；Napsin A 陽性、聯(lián)合貝伐珠單抗治療、無繼發(fā)T790M 突變患者的PFS 均優(yōu)于Napsin A 陰性、未聯(lián)合貝伐珠單抗治療、繼發(fā)T790M 突變患者（P＜0.05）（圖1）。

圖1 不同臨床特征EGFR突變肺腺癌患者接受培美曲塞聯(lián)合鉑類二線治療后的PFS曲線

表3 EGFR 突變肺腺癌患者接受培美曲塞聯(lián)合鉑類二線治療后PFS 影響因素的單因素分析和多因素分析

2.4 二線治療后OS 影響因素的單因素分析和多因素分析

多因素分析結(jié)果顯示，Napsin A 陽性是EGFR突變肺腺癌患者接受培美曲塞聯(lián)合鉑類二線治療后OS 的保護(hù)因素（表4）。采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，結(jié)果顯示，64例患者中位OS為21.0個(gè)月（95%CI：15.271～26.729個(gè)月）；Napsin A陽性患者中位OS 為26.0 個(gè)月（95%CI：19.988～32.012 個(gè)月），明顯優(yōu)于Napsin A 陰性患者（中位OS 為16.0 個(gè)月，95%CI：13.485～18.515個(gè)月）（P=0.003）（圖2）。

圖2 Napsin A陽性（n=47）和Napsin A陰性（n=17）肺腺癌患者的OS曲線

表4 EGFR 突變肺腺癌患者接受培美曲塞聯(lián)合鉑類二線治療后OS 影響因素的單因素分析和多因素分析

3 討論

本研究集中探討EGFR-TKI治療進(jìn)展后的培美曲塞聯(lián)合鉑類二線治療效果，總體ORR 為26.6%，與Zhong 等[6]（30.9%）、Masuda 等[7]（23.0%）和Jiang等[8]（27.0%）報(bào)道相近；中位PFS 為5.0 個(gè)月，與Han等[9]（5.09 個(gè)月）、Masuda 等[7]（5.1 個(gè)月）的結(jié)果相近，略高于Zhong 等[6]（4.5 個(gè)月）報(bào)道；中位OS 為21.0 個(gè)月，與鄭宣軒等[10]（20.4 個(gè)月）的結(jié)果相近，但比Masuda 等[7]（17.8 個(gè)月）報(bào)道的略長。出現(xiàn)這些差異的可能原因：一是樣本量差異；二是本研究及Masuda等[7]的研究均入組了部分聯(lián)合貝伐珠單抗治療的患者，一定程度上能有效延長PFS 和OS；三是入組患者中19del突變比L858R突變的比例略高，以往研究表明19del突變患者的OS優(yōu)于L858R突變患者[11]，本研究結(jié)果也顯示19del 趨向于是患者OS的獨(dú)立保護(hù)因素，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.052）。

本研究分析了二線治療后患者PFS 和OS 的影響因素。多項(xiàng)研究表明，應(yīng)用貝伐珠單抗二線及以上治療晚期肺腺癌療效顯著，EGFR-TKI 和貝伐珠單抗有協(xié)同作用，二者有共同的c-met 上游通路[12]。鄭宣軒等[10]報(bào)道應(yīng)用貝伐珠單抗聯(lián)合化療二線及以上治療晚期NSCLC 的ORR 為32.2%，PFS 為6.4個(gè)月。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合貝伐珠單抗治療患者的ORR 為27.6%，中位PFS 為6.6 個(gè)月，均優(yōu)于未聯(lián)合貝伐珠單抗治療患者，聯(lián)合貝伐珠單抗治療是二線治療后患者PFS 的獨(dú)立保護(hù)因素。繼發(fā)T790M 突變是一代EGFR-TKI 獲得性耐藥的機(jī)制之一，相比于其他原因引起的耐藥，T790M 突變患者預(yù)后更好[13]，但如果在TKI 治療前伴發(fā)T790M 突變則臨床反應(yīng)較差[14]。本研究檢測到繼發(fā)T790M突變13 例（20.3%），遠(yuǎn)低于文獻(xiàn)報(bào)道的突變率[13]。主要原因：入組均為TKI 耐藥后接受化療的患者，不能代表整個(gè)EGFR突變?nèi)后w，另有很大一部分T790M 突變患者繼續(xù)接受二代或三代TKI 治療而非化療。結(jié)果顯示，無繼發(fā)T790M 突變患者接受二線治療后PFS 優(yōu)于繼發(fā)T790M 突變患者，繼發(fā)T790M 突變是二線治療后患者PFS 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示這部分患者二線接受化療療效有限，可以選擇二代或三代TKI 治療或其他治療。

Napsin A 是繼甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1（thyroid transcription factor-1，TTF-1）之后又一個(gè)在預(yù)后中受到關(guān)注的肺腺癌標(biāo)志物[1]，常表達(dá)于肺腺癌、卵巢透明細(xì)胞癌、腎細(xì)胞癌、甲狀腺癌等[15-16]，是判斷早期手術(shù)切除的肺腺癌患者預(yù)后的標(biāo)志物[1-3]。Lee 等[3]單因素分析顯示，TTF-1 陽性患者預(yù)后較好，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.096）；多因素分析顯示，無論TNM 分期如何，Napsin A 是一個(gè)比TTF-1 更有利于預(yù)后的獨(dú)立影響因素。研究發(fā)現(xiàn)，Napsin A 表達(dá)受TTF-1 的調(diào)控[1]，TTF-1 表達(dá)與培美曲塞化療后患者的PFS 有關(guān)[17]，但該研究有一定局限性，沒有分析OS。基于這些結(jié)果，本研究探究了Napsin A對培美曲塞聯(lián)合鉑類二線治療肺腺癌療效的預(yù)測價(jià)值。結(jié)果顯示，在EGFR突變肺腺癌中Napsin A陽性表達(dá)率為73.4%，與文獻(xiàn)報(bào)道的陽性表達(dá)率（70.0%～90.0%）相近。本研究結(jié)果顯示，Napsin A陽性患者DCR 為95.7%，顯著優(yōu)于陰性患者（64.7%）。單因素和多因素分析結(jié)果顯示，Napsin A陰性是二線治療患者PFS 和OS 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示臨床選擇Napsin A 陽性患者接受二線治療對DCR、PFS、OS 更有利，因此Napsin A 是預(yù)測培美曲塞聯(lián)合鉑類方案二線治療EGFR突變肺腺癌患者療效和預(yù)后的分子標(biāo)志物。

有關(guān)Napsin A 在培美曲塞聯(lián)合鉑類治療中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，IASLC 分級為Ⅰ或Ⅱ級的肺腺癌患者肺腺癌組織中Napsin A 陽性表達(dá)率明顯高于IASLC 分級為Ⅲ級的患者，說明腫瘤分化程度越差就越容易出現(xiàn)Napsin A表達(dá)缺失，患者預(yù)后越差。研究報(bào)道，下調(diào)Napsin A可促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）誘導(dǎo)的肺腺癌細(xì)胞增殖[17-18]。研究發(fā)現(xiàn)，Napsin A 表達(dá)水平與厄洛替尼的藥物敏感性呈正相關(guān)，Napsin A 過表達(dá)可抑制TGF-β1 和integrin 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）和由EMT 介導(dǎo)的EGFR-TKI 耐藥，而EMT 也是培美曲塞化療的耐藥機(jī)制之一[19-21]。Napsin A 在培美曲塞聯(lián)合鉑類治療中的確切作用還需進(jìn)一步探討。

本研究尚有不足之處：①病例選擇的偏倚不可避免，因?yàn)楸狙芯渴菍Ξ?dāng)時(shí)接受了EGFR檢測和培美曲塞化療患者的數(shù)據(jù)進(jìn)行的回顧性分析，而不是研究期間所有患者的結(jié)果，數(shù)量偏少。②未進(jìn)行TS 表達(dá)量的評估，因此無從判斷療效差異是否與各自的TS 水平差異有關(guān)。③根據(jù)現(xiàn)有資料，僅觀察了EGFR、KRAS、TP53和T790M 基因突變，無法排除其他驅(qū)動基因突變對結(jié)果的影響。下一步需進(jìn)行大樣本前瞻性研究驗(yàn)證結(jié)果。