張強(qiáng) 王繼紅 黃志凱 蔡偉藍(lán) 任雪晗 許嘉英

功能性消化不良(functional dyspepsia,FD)是臨床上常見(jiàn)的功能性胃腸疾病之一,全球發(fā)病率約為8%～30%[1],迄今為止尚無(wú)特異性治療方法[2]。近年來(lái)的研究表明FD的發(fā)病與胃腸動(dòng)力障礙密切相關(guān)。摩腹可改善胃腸動(dòng)力,治療FD療效確切[3-5]。前期研究表明,摩腹的頻率不同,其治療效應(yīng)亦會(huì)隨之改變,但其對(duì)胃腸動(dòng)力的作用規(guī)律和機(jī)制尚未明確[6-8]。因此,本研究嘗試從調(diào)控胃腸道平滑肌收縮的經(jīng)典通路——鈣調(diào)蛋白—肌球蛋白輕鏈激酶(caImodulin-myosin light chain kinase,CaM-MLCK)信號(hào)通路著手,觀察不同頻率摩腹對(duì)脾虛型FD家兔胃腸動(dòng)力的調(diào)控規(guī)律,分析其調(diào)控作用與CaM-MLCK信號(hào)通路的相關(guān)性,探討摩腹的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年新西蘭家兔60只,由山東康大生物科技有限公司提供[動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(魯)20160002],雌雄各半,體質(zhì)量(2.0±0.5)kg。所有家兔在廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技產(chǎn)業(yè)園動(dòng)物房飼養(yǎng),室溫條件(21±3)℃ ,相對(duì)濕度保持在(35±2)%,保持晝夜光照正常及飼養(yǎng)環(huán)境安靜。

1.2 儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)采用疆越科技研制730C型人工智能機(jī)械臂(DOBOT 魔術(shù)師/型號(hào):DT-MG-4R005-02E)、TEKSCAN壓力測(cè)試調(diào)制器(上海邑成測(cè)試設(shè)備有限公司生產(chǎn))、MFF多點(diǎn)薄膜壓力傳感器、校對(duì)器、動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)采集器、家兔固定器(上?；茖?shí)驗(yàn)器材,PVC-01)、兔解剖臺(tái)、解剖器械。試劑包括環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cMAP)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(品牌:Elabscience;貨號(hào):E-EL-0056c)、三磷酸肌醇(inositol triphosphate,IP3)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(品牌:FineTest;貨號(hào):EU3119)、P物質(zhì)(Substance P,SP)定量檢測(cè)試劑盒(ELISA)(品牌:茁彩生物;貨號(hào):ZC-52333-J)、腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)含量檢測(cè)試劑盒(品牌:索萊寶;貨號(hào):BC0305;規(guī)格:100t/96s)及總一氧化氮(nitric oxide,NO)檢測(cè)試劑盒(品牌:碧云天;貨號(hào):S0023)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后,將60只家兔隨機(jī)分為空白組、模型組、低頻摩腹治療組、高頻摩腹治療組、低頻摩腹+抑制劑組及高頻摩腹+抑制劑組,每組10只。其中空白組正常喂養(yǎng),不予造模,不施加手法干預(yù),其余5組全部造脾虛FD模型。其中模型組不施加手法干預(yù);低頻摩腹治療組的摩腹頻率為101～150次/分鐘;高頻摩腹治療組的頻率為201～250次/分鐘;低頻摩腹+抑制劑組在低頻摩腹治療的基礎(chǔ)上加予腹腔注射肌球蛋白輕鏈激酶抑制劑(ML 9 hydrochloride,ML-9);高頻摩腹+抑制劑組在高頻摩腹治療的基礎(chǔ)上加予腹腔注射ML-9。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中存在部分家兔死亡導(dǎo)致數(shù)據(jù)脫落的情況,最終采集到的數(shù)據(jù)分布為:空白組、高頻摩腹治療組、低頻摩腹+抑制劑組家兔,各8只,模型組及低頻摩腹治療組家兔各7只,高頻摩腹+抑制劑組家兔9只;納入統(tǒng)計(jì)的家兔樣本總量為47只。

1.4 動(dòng)物造模

本實(shí)驗(yàn)采用苦寒瀉下法及饑飽失常法造脾虛FD家兔模型[9]。第1～9天:將大黃35 g、厚樸27 g、枳實(shí)18 g置于裝有650 mL蒸餾水的藥鍋中浸泡30分鐘,煮沸45分鐘,用紗布及濾紙過(guò)濾藥渣,用燒瓶盛裝過(guò)濾好的藥液,用70℃的恒溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將燒瓶中的藥液濃縮至1 g/mL,共80 mL,根據(jù)家兔體重用注射器按6 mL/kg灌胃給藥,隔日一次;第10～12天:灌飼大黃番瀉葉芒硝合劑(每12 mL藥液含大黃6 g、番瀉葉3 g、芒硝1 g),根據(jù)家兔體重,按12 mL/kg給藥,灌胃頻率每日一次;第13～18天:灌飼大黃番瀉葉芒硝合劑(每18 mL藥液含大黃6 g、番瀉葉3 g、芒硝1.2 g),根據(jù)家兔體重,按18 mL/kg給藥,灌胃頻率每日一次。灌胃期間喂食飼料量減半。造模期間觀察記錄家兔精神、體重、進(jìn)食量及大便的變化和行為學(xué)改變,經(jīng)家兔行為學(xué)量表評(píng)估所示各組樣本均符合脾虛模型標(biāo)準(zhǔn),造模成功。

1.5 干預(yù)方法

人工智能機(jī)械臂端安裝擬人硅膠手指并連接控溫器,使硅膠手指保持在人體正常體溫范圍(36～37℃),兩名助手分別握持家兔前后肢,將其仰臥位束縛于操作臺(tái)上,充分暴露腹部,使機(jī)械臂指端輕落于施術(shù)穴位,在MFF多點(diǎn)薄膜壓力測(cè)試系統(tǒng)下使指端與穴位皮膚間壓力固定為100 mN,摩腹方向保持一致,設(shè)置低頻摩腹治療組及低頻摩腹+抑制劑組摩腹頻率為101～150次/分鐘,高頻摩腹治療組及高頻摩腹+抑制劑組頻率為201～250次/分鐘,每只家兔每穴推5分鐘,共計(jì)15分鐘,每日1次。低頻摩腹+抑制劑組及高頻摩腹+抑制劑組每日手法治療后均進(jìn)行腹腔注射ML-9(2 mg/kg),連續(xù)干預(yù)10天。(家兔穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》對(duì)家兔取穴方法[10],中脘穴:前腹部正中線(xiàn)上,劍狀軟骨與臍連線(xiàn)中點(diǎn)處;天樞穴:臍旁開(kāi)三厘米處。手法干預(yù)前各組家兔均已備皮并標(biāo)記穴位。)

1.6 樣本處理及指標(biāo)檢測(cè)

所有家兔于干預(yù)結(jié)束次日禁食24小時(shí)(不禁水),第三日早上用2.5 mL含有5%炭末和2%羧甲基纖維素鈉(Carboxymethylcellulose sodium,CMC-Na)的混懸液對(duì)所有家兔進(jìn)行灌胃,于灌胃結(jié)束半小時(shí)后采用空氣栓塞法處死家兔,剖開(kāi)腹腔,將家兔小腸腸管(幽門(mén)至回盲部)完整取出并測(cè)量長(zhǎng)度,此即小腸總長(zhǎng)度,測(cè)量炭末前沿距離幽門(mén)部的長(zhǎng)度,得炭末推進(jìn)長(zhǎng)度,根據(jù)小腸推進(jìn)率(%)=(炭末推進(jìn)長(zhǎng)度/小腸總長(zhǎng)度)×100%計(jì)算各組家兔的小腸推進(jìn)率。測(cè)量完小腸總長(zhǎng)度及炭末推進(jìn)率后取下家兔小腸組織及胃組織各一塊,每只家兔小腸組織取樣部位為空腸,胃組織取樣部位為胃竇。將樣本剪碎置于空白管中,按重量制成組織勻漿,取上清液保存于冰箱,用相應(yīng)試劑盒分別檢測(cè)胃組織中NO、SP、IP3、ATP、cAMP的含量和腸組織中IP3、ATP、cAMP的含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組家兔小腸推進(jìn)率的比較

與空白組相比,模型組小腸推進(jìn)率顯著降低(P<0.01)。與模型組相比,低頻摩腹治療組、低頻摩腹+抑制劑組及高頻摩腹+抑制劑組小腸推進(jìn)率顯著升高(P<0.01),高頻摩腹治療組與模型組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。低頻摩腹+抑制劑組與低頻摩腹治療組、高頻摩腹+抑制劑組與高頻摩腹治療組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組家兔小腸推進(jìn)率

2.2 各組家兔胃組織NO、SP含量的比較

胃組織NO含量的比較:與空白組相比,模型組含量顯著升高(P<0.01);與模型組相比,低頻摩腹治療組含量下降(P<0.05),其余手法干預(yù)組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);低頻摩腹+抑制劑組與低頻摩腹治療組相比、高頻摩腹+抑制劑組與高頻摩腹治療組相比,胃NO均升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組家兔胃組織NO、SP、IP3、ATP、cAMP含量比較

胃組織SP含量的比較:與空白組相比,模型組含量顯著下降(P<0.01);與模型組相比,高頻摩腹治療組與高頻摩腹+抑制劑組含量均升高(P<0.05),低頻摩腹治療組及低頻摩腹+抑制劑組含量顯著升高(P<0.01);低頻摩腹+抑制劑組與低頻摩腹治療組、高頻摩腹+抑制劑組與高頻摩腹治療組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 各組家兔胃腸組織IP3、ATP、cAMP含量的比較

胃腸組織IP3含量的比較:模型組與空白組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與模型組相比,摩腹干預(yù)后的四組小腸組織IP3含量均顯著下降(P<0.01);低頻摩腹+抑制劑組與高頻摩腹+抑制劑組胃、腸組織IP3含量均顯著下降(P<0.01)。見(jiàn)表2、表3。

表3 各組家兔小腸組織IP3、ATP、cAMP含量比較

胃腸組織ATP含量的比較:與空白組相比,模型組腸ATP含量下降(P<0.05),模型組胃ATP含量顯著下降(P<0.01);與模型組比,高頻摩腹治療組腸ATP含量升高(P<0.05)、胃ATP含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),低頻摩腹治療組胃、腸ATP含量均顯著升高(P<0.01);與低頻摩腹治療組相比,低頻摩腹+抑制劑組胃、腸ATP含量均顯著下降(P<0.01);與高頻摩腹治療組相比,高頻摩腹+抑制劑組胃ATP含量下降(P<0.05)、腸ATP含量顯著下降(P<0.01)。見(jiàn)表2、表3。

胃腸組織cAMP含量的比較:與空白組相比,模型組腸cAMP含量升高(P<0.05),胃cAMP含量顯著升高(P<0.01);與模型組相比,低頻摩腹治療組胃、腸cAMP含量均顯著下降(P<0.01),高頻摩腹治療組胃、腸cAMP含量均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),低頻摩腹+抑制劑組及高頻摩腹+抑制劑組含量胃、腸cAMP均顯著升高(P<0.01)。見(jiàn)表2、表3。

3 討論

當(dāng)胞內(nèi)Ca2+水平受信號(hào)刺激升高到一水平時(shí),鈣調(diào)蛋白(caImodulin,CaM)與Ca2+的結(jié)合體(Ca2+-CaM)將與肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase,MLCK)結(jié)合,激活CaM-MLCK信號(hào)通路(見(jiàn)圖1),使肌球蛋白輕鏈(myosin light chain,MLC)磷酸化,活化肌球蛋白ATP酶,觸發(fā)纖絲滑動(dòng),并使ATP水解供能,引起平滑肌收縮[11]。當(dāng)胞內(nèi)Ca2+濃度下降,Ca2+-CaM復(fù)合物減少或解離,引起MLC去磷酸化,則平滑肌松弛;與此同時(shí),cAMP可活化cAMP依賴(lài)性蛋白激酶A(protein kinase A,PKA),通過(guò)cAMP/PKA途徑引起平滑肌松弛[12]。IP3通過(guò)與IP3受體結(jié)合促使鈣池操縱性鈣內(nèi)流(store-operated Ca entry,SOCE)的發(fā)生,鈣池耗竭并觸發(fā)胞外Ca2+的內(nèi)流,促進(jìn)激活CaM-MLCK信號(hào)通路。NO是消化系統(tǒng)中的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),可通過(guò)環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷/蛋白激酶G(cyclic guanosine monophosphate/protein kinase G,cGMP/PKG)途徑或抑制胞內(nèi)Ca2+濃度升高而使平滑肌松弛。SP屬于興奮性神經(jīng)肽, 可直接或通過(guò)激活磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)促進(jìn)IP3的產(chǎn)生而間接使消化道平滑肌收縮;ML-9可直接抑制MLCK活性,也可通過(guò)抑制SOCE降低胞內(nèi)Ca2+濃度從而阻斷CaM-MLCK信號(hào)通路。

注: 本圖為筆者據(jù)相關(guān)研究資料繪制。

既往研究提示,部分健脾中藥方可通過(guò)影響CaM-MLCK信號(hào)通路從而影響平滑肌收縮,促進(jìn)胃腸動(dòng)力[13-15]。在推拿干預(yù)消化疾病研究方面,張瑋等[16]和石玉生等[17]通過(guò)一項(xiàng)腹部推拿干預(yù)非酒精性脂肪肝病大鼠的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)證實(shí)腹部推拿可以影響MLCK的表達(dá),調(diào)控MLCK信號(hào)通路,從而改變腸道黏膜功能。前期研究曾嘗試探索腹部一指禪推法對(duì)脾虛家兔的作用及其與MLCK信號(hào)通路的關(guān)系,但尚未發(fā)現(xiàn)確切聯(lián)系,指出一指禪推法可能通過(guò)多通路多途徑影響胃腸道功能[18-19]。

本研究在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步增加樣本量與檢測(cè)指標(biāo)。研究結(jié)果顯示,家兔經(jīng)造模后,除胃腸組織IP3外,其余檢測(cè)指標(biāo)均發(fā)生明顯變化。摩腹干預(yù)結(jié)果提示,低頻摩腹治療組、低頻摩腹+抑制劑組及高頻摩腹+抑制劑組小腸推進(jìn)率均顯著提高。低頻摩腹治療組逆轉(zhuǎn)造模所致各項(xiàng)指標(biāo)水平變化的效果顯著,其中降低胃腸cAMP含量、升高胃SP含量的效果尤佳;高頻摩腹治療組也可升高胃SP含量,但對(duì)造模后其余指標(biāo)的變化幾乎無(wú)改善作用甚至部分變化有加重趨勢(shì)。在CaM-MLCK信號(hào)通路被抑制的情況下,低頻摩腹+抑制劑組胃NO含量與胃腸cAMP含量的變化與模型組相似;低頻摩腹+抑制劑組及高頻摩腹+抑制劑組胃SP含量升高效果均與相應(yīng)單純摩腹治療組無(wú)差異。值得一提的是,在造模并未影響胃腸IP3含量的基礎(chǔ)上,低頻摩腹治療組與高頻摩腹治療組腸IP3含量下降,低頻摩腹+抑制劑組及高頻摩腹+抑制劑組的胃腸組織IP3含量呈顯著下降趨勢(shì)。

綜上所述,摩腹對(duì)胃腸動(dòng)力的影響存在頻率—效應(yīng)規(guī)律,摩腹在101～150次/分鐘頻率段時(shí)可顯著促進(jìn)胃腸動(dòng)力,當(dāng)頻率超過(guò)200次/分時(shí),摩腹對(duì)胃腸動(dòng)力無(wú)改善作用,甚至有損害趨勢(shì)。通過(guò)比較,摩腹調(diào)控胃腸動(dòng)力的機(jī)制可能如下:(1)摩腹通過(guò)降低胃腸組織中NO及cAMP的含量,抑制cAMP/PKA途徑及cGMP/PKG途徑,減少對(duì)Ca2+-CaM的競(jìng)爭(zhēng)性消耗,從而促進(jìn)上游CaM-MLCK信號(hào)通路中Ca2+、Ca2+-CaM與MLCK的結(jié)合。(2)當(dāng)CaM-MLCK信號(hào)通路被阻斷后,一方面,摩腹可通過(guò)提高家兔胃SP含量,發(fā)揮其促進(jìn)胃腸動(dòng)力的直接效應(yīng);另一方面,IP3的顯著下降提示,阻斷CaM-MLCK信號(hào)通路,可能增加IP3的消耗促使SOCE發(fā)生,從而改變胞內(nèi)Ca2+水平,激發(fā)Ca2+介導(dǎo)的其它信號(hào)通路,使胃腸動(dòng)力受到影響。其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。本研究主要從側(cè)面探討了摩腹對(duì)胃腸動(dòng)力的調(diào)控機(jī)制及與CaM-MLCK信號(hào)通路的關(guān)系,涉及指標(biāo)及相關(guān)通路范圍較大,今后的研究尚需縮窄定位,對(duì)摩腹干預(yù)下CaM-MLCK信號(hào)通路上CaM、MLCK、MLC各物質(zhì)的具體變化以及胃腸道平滑肌運(yùn)動(dòng)學(xué)改變等進(jìn)行檢驗(yàn),以期進(jìn)一步明確摩腹調(diào)控胃腸動(dòng)力的具體機(jī)制。