劉德良,季敏敏,黃超君,黃熠陽,楊興婷,鮑蕾蕾

缺血性腦卒中(CIS)是一種高發(fā)病率、高復發(fā)率、高致殘率和高致死率的腦血管疾病[1]。CIS發(fā)病機制復雜,目前研究認為其病理機制包括能量代謝障礙、炎性反應(yīng)、細胞凋亡等[2-4]。CIS屬中醫(yī)“中風”范疇,其主要病因為氣虛血瘀。疏血通注射液具有活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)功效,以水蛭、地龍為原料提取制成。臨床上對CIS的治療,疏血通注射液應(yīng)用廣泛、療效顯著,但目前疏血通注射液治療CIS的作用機制尚未明確[5-6]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學是一種提供“多靶點、多通路、多環(huán)節(jié)”的新型網(wǎng)絡(luò)模式,已被大量應(yīng)用于系統(tǒng)揭示中藥對疾病作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和效應(yīng)機制[7]。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法預(yù)測疏血通注射液治療CIS的主要活性成分、作用靶點和相關(guān)信號通路,分析疏血通注射液治療CIS的可能藥理作用,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 疏血通注射液活性成分和作用靶點的獲取 通過BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫分別搜集水蛭、地龍兩味中藥的主要化學成分,并結(jié)合已發(fā)表的中藥成分相關(guān)文獻進行補充[8-11]。利用PubChem數(shù)據(jù)庫檢索各化學成分的SMILES結(jié)構(gòu),將各化學成分的SMILES結(jié)構(gòu)上傳至SwissADME平臺進行活性篩選[12]。最后在SwissTargetPrediction平臺預(yù)測潛在靶點[13]。

1.2 CIS疾病靶點信息獲取 在GeneCards數(shù)據(jù)庫中以“Cerebral Ischemic Stroke”“CIS”為關(guān)鍵詞獲取CIS潛在靶點。在GeneCards數(shù)據(jù)庫中,靶點Score值越大表明該靶點與疾病聯(lián)系越緊密。當獲取結(jié)果靶點過多時通常篩選Score值大于中位數(shù)的靶點作為疾病的潛在靶點。

1.3 構(gòu)建“疏血通注射液—活性成分—作用靶點網(wǎng)絡(luò)” 將疏血通注射液藥物相關(guān)靶點與CIS疾病靶點利用Venny 2.1網(wǎng)站取交集,得到疏血通注射液治療CIS的作用靶點。將交集靶點及對應(yīng)的中藥成分數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.9.1軟件中,構(gòu)建藥物—成分—靶點網(wǎng)絡(luò),通過計算網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度值篩選主要活性成分。

1.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò) 將1.3項下所得到的交集靶點導入STRING 11.5數(shù)據(jù)庫,設(shè)置物種為“智人”,選擇隱藏游離靶點,獲得PPI網(wǎng)絡(luò)。保存PPI網(wǎng)絡(luò)的tsv文件,導入Cytoscape 3.9.1軟件進行可視化,通過內(nèi)置分析功能篩選核心靶點。

1.5 GO分析和KEGG富集分析 將交集靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫,物種設(shè)定為“智人”,基因修正為“official gene symbol”,分別進行GO和KEGG分析。根據(jù)P值選取GO分析排名前十的條目和KEGG富集分析排名前二十的進行可視化。

1.6 分子對接驗證 為進一步分析疏血通注射液對CIS的調(diào)控作用,將1.3項中獲取的主要活性成分,與1.4項中篩選得到的核心靶點進行分子對接驗證。首先從PubChem網(wǎng)站下載藥物主要有效成分的3D結(jié)構(gòu),通過AutoDock Tools 1.5.7優(yōu)化結(jié)構(gòu)后設(shè)置為配體并保存。然后從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫獲取關(guān)鍵靶點的3D結(jié)構(gòu),使用Pymol 2.5.0軟件對蛋白結(jié)構(gòu)進行去除水分子和自身配體,再使用AutoDock Tools 1.5.7進行加氫后設(shè)置為受體并保存。最后利用AutoDock Vina 1.2.0進行分子對接。

2 結(jié) 果

2.1 疏血通注射液活性成分和作用靶點的獲取 綜合BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果及文獻信息,將所搜集成分經(jīng)SwissADME平臺進行活性篩選后,最終獲得水蛭活性化合物17個,地龍活性化合物49個,二者共有成分22個,主要為核苷類和氨基酸類物質(zhì)。利用SwissTargetPrediction平臺將具有活性的化合物在設(shè)定篩選條件下進行靶點預(yù)測,獲得水蛭作用靶點548個,地龍作用靶點901個。經(jīng)合并重復項及刪除無對應(yīng)靶點成分后最終獲得疏血通注射液活性化合物88個和對應(yīng)靶點952個。

2.2 CIS疾病靶點信息獲取 通過檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫,初步獲得CIS疾病相關(guān)靶點3 151個。這些靶點中Score最大值為136.04,最小值為0.27,中位數(shù)為3.42,設(shè)定Score值>3.42的靶點為CIS潛在靶點,共1 575個。

2.3 “疏血通注射液—活性成分—作用靶點”網(wǎng)絡(luò) 將疏血通注射液活性成分作用靶點與CIS潛在靶點上傳到Venny 2.1網(wǎng)站取交集,得到疏血通注射液治療CIS潛在靶點351個。利用Cytoscape 3.9.1軟件繪制疏血通注射液“藥物—成分—靶點”網(wǎng)絡(luò)圖,該網(wǎng)絡(luò)包含443個節(jié)點,2 340條邊,見圖1。該網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的平均自由度為10.41,共有136個節(jié)點自由度≥11,其中61個為疏血通注射液有效成分,75個為疏血通注射液治療CIS的相關(guān)靶點。網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點自由度越大,表明該成分越重要,選取自由度值排名前10位的有效成分作為疏血通注射液主要有效成分,見表1。以拼音首字母為編碼標準,水蛭成分編號為SZ1～SZ17,地龍成分編號為DL1～DL49,共有成分編號為GY1～GY22。

圖1 疏血通注射液“藥物—成分—靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

表1 疏血通注射液主要有效成分基本信息

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 在STRING 11.5數(shù)據(jù)庫上傳2.3項得到的交集靶點進行PPI分析,并保存tsv文件導入Cytoscape 3.9.1軟件進行可視化,刪除游離主網(wǎng)絡(luò)外的靶點后得到疏血通注射液治療CIS靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖,見圖2。該PPI網(wǎng)絡(luò)節(jié)點數(shù)為291,邊數(shù)為1 314。利用CtoNCA插件中介數(shù)中心性(BC)算法計算靶點得分,BC值越大,節(jié)點越大,顏色越深,說明該靶點在網(wǎng)絡(luò)中越重要。其中排名前5位的靶點有SRC、ESR1、CTNNB1、STAT3、SIRT1。

圖2 疏血通注射液治療CIS潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO富集和KEGG通路分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫,對疏血通注射液治療CIS的潛在靶點進行GO富集和KEGG通路分析。在GO富集中,得到生物過程(BP)350條,細胞組成(CC)351條,分子功能(MF)351條。根據(jù)P值可視化分析結(jié)果中排名前10位的條目,見圖3。結(jié)果顯示BP主要涉及藥物反應(yīng)、炎性反應(yīng)、低氧反應(yīng)等;CC主要涉及質(zhì)膜、質(zhì)膜組成部分、細胞表面等;MF主要涉及蛋白結(jié)合、相同蛋白結(jié)合、酶結(jié)合等。

圖3 疏血通注射液治療CIS潛在靶點GO功能富集分析圖

KEGG通路分析共得到334條通路,根據(jù)P值對分析結(jié)果中排名前20位的條目進行可視化,見圖4。圖4中X軸表示富集倍數(shù),Y軸為富集到的通路名稱,富集結(jié)果的P值以顏色表示,基因數(shù)以氣泡大小表示。顏色越紅、氣泡越大表明富集程度越高。疏血通注射液治療CIS的信號通路包括:癌癥途徑、神經(jīng)元神經(jīng)活性配體—受體相互作用、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、鈣離子信號、CAMP信號等通路。

圖4 疏血通注射液治療CIS潛在靶點KEGG通路富集分析氣泡圖

2.6 分子對接 根據(jù)1.3項分析結(jié)果,依據(jù)度值篩選主要活性成分的同時兼顧兩種藥物,因此選擇來自地龍的DL1、DL14和來自水蛭的SZ7這3個成分與從PPI網(wǎng)絡(luò)圖中選取BC值排名前5位的靶點蛋白SRC、ESR1、SIRT1、CTNNB1、STAT3進行分子對接預(yù)測結(jié)合能,見表2。一般認為分子對接結(jié)合能<0,表明配體與受體可自由結(jié)合,結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol表明小分子配體與受體結(jié)合較好[14],結(jié)合能越低表明配體與受體之間的親和力越大,二者發(fā)生相互作用的可能性越高。結(jié)果顯示來自地龍的DL1和來至水蛭的SZ7與各個靶點親和力較好,而SRC、ESR1、STAT3與各個成分之間對接結(jié)果較好,可能在疏血通注射液治療CIS中起著重要作用。

表2 疏血通注射液主要活性成分與關(guān)鍵靶點對接結(jié)果

3 討 論

CIS主要病因是動脈供血短暫或永久缺少導致腦組織缺血缺氧,進而引起神經(jīng)損傷、炎性反應(yīng)等。疏血通注射液具有活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)功效,臨床用于瘀血阻絡(luò)所致的中風病,而氣虛血瘀是CIS的病機。補氣活血法是治療CIS重要思路。本研究預(yù)測疏血通注射液主要有效活性活性成分共10個,其中來自地龍9個即(S)-2-{[(芐氧基)羰基]氨基}-5-乙氧基-5-氧代戊酸、4-辛烷氧基苯胺、二氫辣椒素、麥角胺、4,8,12-三甲基十三碳-3,7,11-三烯酸甲酯、亞麻酸、二十二碳五烯酸、棕櫚烯酸、鄰苯二甲酸二甲氧乙酯,來自水蛭1個(水蛭素A)。鐘曉芃等[15]研究發(fā)現(xiàn)含氮化合物二氫辣椒素能激活TRPV1受體可通過cAMP/PKA信號通路,增加線粒體解偶聯(lián)蛋白表達,提高被缺血再灌注損傷降低的線粒體膜電位,減少ROS產(chǎn)生,抑制凋亡因子釋放,從而減少缺血再灌注損傷導致的神經(jīng)元細胞凋亡。麥角類生物堿麥角胺可用于治療偏頭痛,而偏頭痛是導致腦卒中發(fā)生的危險因素[16]。不飽和脂肪酸類物質(zhì)亞麻酸、二十二碳五烯酸等,具有降血脂、抗炎、抗氧化等藥理作用[17]。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),疏血通注射液可能主要通過SRC、ESR1、CTNNB1、SIRT1、STAT3 5個核心靶點發(fā)揮治療CIS的作用。PPI網(wǎng)絡(luò)中SRC的BC值最大,且分子對接結(jié)果顯示SRC與疏血通注射液主要活性成分均能穩(wěn)定結(jié)合,預(yù)測SRC是疏血通注射液治療CIS的最主要靶點。SRC酪氨酸蛋白激酶可經(jīng)過氧化還原作用,調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子、偶聯(lián)因子6、緩激肽等,進而改變血管結(jié)構(gòu)和功能,在心腦血管疾病如高血壓、腦卒中發(fā)揮主要作用[18]。ESR1即雌激素受體α,雌激素已被證明能增加腦血流量,具有抗炎作用,增強神經(jīng)元突觸處的活性,對腦組織發(fā)揮直接的神經(jīng)保護和神經(jīng)營養(yǎng)作用。徐偉等[19]研究發(fā)現(xiàn)由于腦缺血再灌注損傷后大鼠腦組織水腫,大鼠Notch信號通路被激活,調(diào)節(jié)CTNNB1與KRT1高表達以緩解大鼠腦組織水腫。已有研究發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注過程中SIRT1持續(xù)低表達,上調(diào)SIRT1能抑制腦缺血再灌注過程中炎性反應(yīng)和細胞凋亡,減輕腦缺血再灌注損傷[20]。STAT3是炎性反應(yīng)發(fā)展過程中的關(guān)鍵節(jié)點,可通過介導炎性遞質(zhì)的細胞外信號調(diào)控免疫細胞、腫瘤細胞等的生物學行為,是慢性炎性反應(yīng)促進腫瘤發(fā)生及腫瘤相關(guān)性炎癥形成過程中不可或缺的關(guān)鍵性分子[21]。

GO富集及KEGG通路分析結(jié)果表明,疏血通注射液治療CIS可能與癌癥途徑、神經(jīng)元神經(jīng)活性配體—受體相互作用、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化通路、鈣離子信號、CAMP信號等通路相關(guān),其中癌癥途徑是一條重要且復雜的通路,包含PI3K/AKT、IL-6、NF-κB、MAPK等通路。PI3K/AKT信號通路參與細胞增殖、存活和凋亡等多種生物學過程,對大腦缺氧缺血后神經(jīng)細胞凋亡具有重要調(diào)控作用,減輕缺氧/缺血再灌注損傷[22]。IL-6雖是炎性細胞因子,在CIS急性期明顯升高,但在亞急性期和慢性期又可作為神經(jīng)營養(yǎng)介質(zhì),參與腦缺血后損傷修復過程。p38MAPK是MAPK中一條關(guān)鍵信號通路,腦部缺血缺氧時可引起MAPK信號通路的激活從而促進神經(jīng)元凋亡[23]。NF-κB是p38MAPK的下游分子,p-p38MAPK可激活NF-κB,通過調(diào)節(jié)細胞凋亡相關(guān)基因表達誘導神經(jīng)元凋亡,抑制p38MAPK通路和NF-κB的激活,從而減少TNF-α、IL-1β和IL-6等細胞因子釋放,減輕腦組織損傷[24]。

綜上所述,本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法探索疏血通注射液治療CIS可能的分子機制,發(fā)現(xiàn)疏血通注射液的主要活性成分為(S)-2-{[(芐氧基)羰基]氨基}-5-乙氧基-5-氧代戊酸、水蛭素A等物質(zhì),可能通過作用于SRC、ESR1、SIRT1、CTNNB1、STAT3等靶點,在癌癥途徑、神經(jīng)元神經(jīng)活性配體—受體相互作用、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、鈣離子信號、CAMP信號等通路發(fā)揮治療CIS作用。疏血通注射液作用機制涉及多種分子、過程、通路,體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點、多通路的特點。同時本研究存在一定不足,結(jié)論得出主要基于數(shù)據(jù)庫和相關(guān)文獻,缺少動物實驗對篩選出的關(guān)鍵靶點和信號通路進行驗證和進一步研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。