趙正萍，夏永剛，張 敏，江雅琴，李鑌洋，李興紅

（1.湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長沙 410004； 2.國家林業(yè)和草原局南方天敵繁育與應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，湖南長沙 410004； 3.浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 杭州 311302； 4.順毅股份有限公司，浙江 臺(tái)州 318000）

松材線蟲病是由松材線蟲 （Bursaphelenehus xylophilus）引起的、極具危險(xiǎn)性和毀滅性的國際檢疫性林業(yè)有害生物災(zāi)害，被稱為松樹“癌癥”［1］。自1982年在我國首次發(fā)現(xiàn)以來，疫情快速擴(kuò)散，并呈西進(jìn)北擴(kuò)之勢。根據(jù)國家林業(yè)和草原局公告（2023年第7號(hào)） （2023年松材線蟲病疫區(qū)），截至2022年底，全國19個(gè)省（自治區(qū)、直轄市）737個(gè)縣（區(qū)、市）552 6個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)28.39萬個(gè)松林小班發(fā)生松材線蟲病疫情［2-3］，張家界、泰山、黃山、秦巴山區(qū)、三峽庫區(qū)等國家重要生態(tài)區(qū)均發(fā)生疫情［4］。松材線蟲病已成為威脅我國生態(tài)安全、生物安全和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的嚴(yán)重隱患。

當(dāng)前，注干施藥已成為保護(hù)生態(tài)景區(qū)名松樹和古松樹不受松材線蟲病危害的主要措施之一［5］，注干藥劑成分主要有阿維菌素、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（以下簡稱甲維鹽）、吡蟲啉等［6-14］。但單一的藥劑長期使用容易產(chǎn)生抗性，防治成本增加，防治效果欠佳。本試驗(yàn)測定和比較依維菌素和甲維鹽對松材線蟲的室內(nèi)生物活性，通過林間打孔注藥試驗(yàn)，篩選5%依維菌素微乳劑對松材線蟲病林間預(yù)防的最佳用量，以期為預(yù)防松材線蟲病的新型注干藥劑的篩選、推廣應(yīng)用提供參考。

1 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)地位于湖南省長沙市岳麓區(qū)坪塘街道栽培山小班（地理坐標(biāo)為112.838°E、28.037°N）。該地土壤為紅壤，排水條件好，林分為針闊葉混交林，其中馬尾松（Pinusmassoniana）占比為75%左右，樹齡13～15 a，長勢基本一致，平均胸徑約18 cm。2020年，長沙市岳麓區(qū)被確定為松材線蟲病疫區(qū)。

2 材料與方法

2.1 供試材料

試驗(yàn)藥劑分別為92%依維菌素原藥、71%甲維鹽原藥、5%依維菌素微乳劑和2.2%甲維鹽微乳劑，藥劑由順毅股份有限公司生產(chǎn)和提供。

供試靶標(biāo)為松材線蟲2齡幼蟲，室內(nèi)用灰葡萄孢菌培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（23±1）℃。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 依維菌素和甲維鹽對松材線蟲的室內(nèi)活性測定

依據(jù)《農(nóng)藥室內(nèi)生物測定試驗(yàn)準(zhǔn)則 殺線蟲劑 第1部分：抑制植物病原線蟲試驗(yàn) 浸蟲法》［15］開展本試驗(yàn)。具體方法為：用分析天平稱取一定質(zhì)量的92%依維菌素原藥、71%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽原藥，分別用二甲基亞砜溶解配制成1%母液，然后用含0.1%吐溫的蒸餾水配成預(yù)設(shè)濃度備用。依維菌素濃度分別為0.125、0.25、0.50、1.0、2.0 mg·L-1；甲維鹽濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg·L-1。采用浸蟲法，在96孔板內(nèi)同時(shí)加入10μL上述濃度的供試藥劑和90 μL線蟲懸浮液（3 000條·mL-1），混合后于（23±1）℃培養(yǎng)48 h，在顯微鏡下檢查線蟲的存活情況，觸碰仍不能彎曲運(yùn)動(dòng)的計(jì)為死亡。以上試驗(yàn)重復(fù)3次。

統(tǒng)計(jì)各個(gè)處理的活蟲數(shù)和死蟲數(shù)，計(jì)算各處理的校正死亡率，使用DPSV18.10數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，求出毒力回歸方程、LC50值、95%置信區(qū)間。

2.2.2 林間預(yù)防試驗(yàn)

（1）試驗(yàn)區(qū)設(shè)置

試驗(yàn)區(qū)共設(shè)5個(gè)處理，分別標(biāo)為A、B、C、D、E，每個(gè)處理為30棵馬尾松，設(shè)4個(gè)重復(fù)，按隨機(jī)區(qū)組排列。供試松樹均首次實(shí)施注干藥劑。林間試驗(yàn)藥劑處理方式及用量見表1。

表1 林間試驗(yàn)藥劑用量Tab.1 Dosage of trunk injection on pine w ilt disease

試驗(yàn)前，對項(xiàng)目區(qū)松材線蟲病發(fā)生情況進(jìn)行本底調(diào)查，然后嚴(yán)格按照國家林業(yè)和草原局印發(fā)的《松材線蟲病防治技術(shù)方案（2021年版）》對小班內(nèi)所有已經(jīng)枯死的松樹進(jìn)行清除。2021年12月10日，用電鉆在樹干基部距離地面20 cm處，斜向下45°打孔，孔直徑0.4～0.5 cm，孔深5～8 cm，每孔注射藥量最多為40 mL。擰斷藥劑瓶瓶尖，將瓶體插入孔中，按瓶子底部預(yù)留打孔點(diǎn)鉆孔通氣，3 d后待瓶中藥劑全部流入樹體后拔除空瓶并堵住插孔。

（2）效果調(diào)查

2022年12月2日，對試驗(yàn)區(qū)所有馬尾松逐株進(jìn)行調(diào)查，對明顯枯死和有枝條枯黃的全部進(jìn)行取樣檢測，鑒定其是否由松材線蟲引起，排除干旱和其他致死原因。處理前病死數(shù)量參照該小班2021年冬季松材線蟲病自然病死率（18.00%），即30株樹中因松材線蟲病平均死亡5.40株。調(diào)查統(tǒng)計(jì)藥劑處理前后馬尾松病死樹情況及防治效果，計(jì)算公式為：病死樹減退率＝（處理前病死樹數(shù)量-處理后病死樹數(shù)量）／處理前病死樹數(shù)量×100%；防治效果＝（處理區(qū)病死樹減退率-空白對照區(qū)病死樹減退率）／（1-空白對照區(qū)病死樹減退率）×100%。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2010和SPSS 24.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)分析，采用鄧肯氏新復(fù)極差法對各處理防治效果進(jìn)行多重比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 依維菌素和甲維鹽對松材線蟲的室內(nèi)活性比較

兩種藥劑對松材線蟲的室內(nèi)活性測定結(jié)果見表2。依維菌素濃度為 2.0、1.0、0.50、0.25、0.125 mg·L-1時(shí)，松材線蟲2齡幼蟲校正死亡率分別為 87.69%、61.05%、46.32%、15.63%、6.25%；甲維鹽濃度為8.0、4.0、2.0、1.0、0.5 mg·L-1時(shí)，松材線蟲2齡幼蟲校正死亡率分別為 70.53%、62.96%、46.15%、41.41% 和39.66%。松材線蟲的死亡率均隨著依維菌素濃度和甲維鹽濃度的升高而增加。濃度-死亡率回歸分析顯示，依維菌素的回歸方程為y＝5.428 6+2.218 4 x，甲維鹽的回歸方程為y＝4.843 8+0.714 7 x。依維菌素和甲維鹽對松材線蟲的LC50分別為0.640 9 mg·L-1和1.654 1 mg·L-1，表明依維菌素的活性顯著高于甲維鹽的活性。

表2 依維菌素和甲維鹽對松材線蟲的室內(nèi)活性測定結(jié)果Tab.2 Indoor activity of ivermectin and emamectin against Bursaphelenehus xylophilus

3.2 林間預(yù)防效果

兩種藥劑注干施用對松材線蟲病的預(yù)防效果見表3。一年后的試驗(yàn)調(diào)查可知：不同劑量5%依維菌素微乳劑和2.2%甲維鹽微乳劑均對松材線蟲病具有一定的預(yù)防效果。A、B、C和D處理的平均病死樹減退率分別為 86.11%、95.37%、100.00%、86.11%，C處理的減退率最高。A、B、C和D處理對松材線蟲的預(yù)防效果分別為92.11%、97.37%、100.00%和92.11%，各處理效果大小為C＞B＞A＝D。其中，C處理效果最好，顯著高于A處理和D處理，而C處理與B處理之間差異不顯著，因此5%依維菌素微乳劑的用量以1.5～2.0 mL·cm-1胸徑較為適宜。

表3 注干藥劑對林間松材線蟲病預(yù)防效果Tab.3 Effect of trunk-injection agent against pine w ilt disease in field

4 結(jié)論與討論

依維菌素是阿維菌素的衍生物，也是一種新型廣譜、高效、低毒的大環(huán)內(nèi)酯類抗寄生蟲藥。研究表明，依維菌素比阿維菌素結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定、毒副作用更小、使用更安全且殺蟲效果更好［16-17］，已廣泛用于牛、羊、馬、豬等家畜的胃腸道線蟲、肺線蟲和體外寄生蟲的驅(qū)殺［18-19］，但尚未有用于松材線蟲病預(yù)防的研究報(bào)道。本研究通過室內(nèi)活性測定和林間打孔注藥的方式，驗(yàn)證了依維菌素對松材線蟲病的預(yù)防效果。處理48 h后依維菌素對松材線蟲2齡幼蟲的LC50為0.640 9 mg·L-1，5%依維菌素微乳劑林間打孔注藥對松材線蟲病預(yù)防效果最高可達(dá)100%，建議在使用5%依維菌素微乳劑打孔注藥預(yù)防松材線蟲病時(shí)，制劑用量以 1.5 ～2.0 mL·cm-1胸徑為宜，選擇在松材線蟲病預(yù)防期或侵染初期的冬季使用。

目前，松材線蟲病的防治工作困難大，疫情仍有可能進(jìn)一步擴(kuò)散，究其原因：一是主要寄主植物馬尾松在南方各地種植面積較大；二是傳播松材線蟲病的主要媒介昆蟲松褐天牛 （Monochamus alternatus）在松林均有分布，且部分縣市區(qū)的蟲口密度較大；三是部分群眾防疫意識(shí)淡薄，人為攜帶病原傳播風(fēng)險(xiǎn)較大；四是目前能徹底除治松材線蟲病的防控技術(shù)和特效藥劑少，特別是防治用的化學(xué)藥劑，40年來重復(fù)使用，存在有效成分單一、藥量不斷加大、持效期較短、環(huán)境污染較重、防治效率低、成本較高等嚴(yán)重問題［20］。

當(dāng)前，注干施藥已成為名松樹和古松樹不受松材線蟲病危害的主要措施之一，防治松材線蟲病的注干藥劑成分主要為阿維菌素、甲維鹽、吡蟲啉等。其主要機(jī)理是將此類內(nèi)吸性藥劑注入松樹木質(zhì)部后傳輸?shù)綐潴w其他部位，使松樹保持一定時(shí)期的毒效，當(dāng)松材線蟲或天牛幼蟲在樹體內(nèi)取食時(shí)，藥劑隨之進(jìn)入害蟲體內(nèi)使其中毒死亡。本研究是在室內(nèi)生物活性測定的基礎(chǔ)上進(jìn)行林間藥效試驗(yàn)，試驗(yàn)過程中也未發(fā)現(xiàn)其對馬尾松產(chǎn)生藥害。試驗(yàn)結(jié)果表明，一定量的5%依維菌素微乳劑對松材線蟲病具有良好的預(yù)防效果，可以作為替代阿維菌素、甲維鹽、吡蟲啉類打孔注藥劑的新型藥劑。值得說明的是，本次研究只進(jìn)行了小面積的試驗(yàn)，至于對施藥后藥劑在樹體不同部位的分布情況以及對松材線蟲病防治的持久性，還有待進(jìn)一步深入研究。