李培旺，李昌珠，趙夢瑞，張愛華，黎繼烈，曹慧芳，2

（1.湖南省林業(yè)科學(xué)院省部共建木本油料資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙 410004； 2.長沙環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410000； 3.中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410004）

油桐（Vernicia fordii）是重要的工業(yè)木本油料植物之一。中國是油桐的主要栽培區(qū)，油桐籽產(chǎn)量居世界第一［1］。油桐籽主要用于榨取桐油，加工后的剩余物以油桐粕為主。油桐粕中含有36% ～45%的蛋白質(zhì)、1%～2%的鉀、1%～3%的磷等營養(yǎng)成分，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白質(zhì)和有機(jī)肥原料，利用潛力巨大［2］。由于油桐粕中含有新二萜類酯、皂苷等對人畜有害的天然毒性成分，導(dǎo)致其利用受到限制，長期以來只能作有機(jī)肥還田使用［3-4］。鄭威等［5］研究發(fā)現(xiàn)油桐粕有機(jī)-無機(jī)復(fù)混肥肥效高，有機(jī)質(zhì)、氮、五氧化二磷、氧化鉀分別為77.6%、4%～6%、1.8%～2.7%、1.2%～1.3%。趙夢瑞等［6］研究發(fā)現(xiàn)桐粕肥料具有改良土壤理化性質(zhì)、促進(jìn)植物生長和防蟲抗病等作用。雖然，我國油桐粕肥料化是從唐、宋時(shí)期開始，歷史悠久［7］，但油桐粕肥料化的傳統(tǒng)方法主要以自然堆漚為主，發(fā)酵時(shí)間長，蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)降解程度低，產(chǎn)品功能單一，品質(zhì)難以控制［8-9］。因此，通過多功能微生物將桐粕中蛋白質(zhì)高效降解成易吸收的小分子氨基酸，開發(fā)出多功能生物有機(jī)肥，是解決目前油桐粕肥料化問題的有效方法，且此方法的關(guān)鍵在于可以獲得兼具高產(chǎn)蛋白酶、拮抗病原菌和促生長特性的微生物菌種資源。目前，關(guān)于油桐粕高效降解的微生物菌種資源較少，方亭亭等［10］篩選出三株，分別為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、白色短小桿菌（Curtobacterium albidum）和肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus），但未對分解桐籽餅粕能力、促生長及拮抗特性進(jìn)行深入研究，無法滿足油桐粕生產(chǎn)多功能生物肥料的需要。本研究擬采用菌落形態(tài)、生理生化和16S rRNA分析等方法對從油桐餅粕中篩選出的蛋白質(zhì)降解菌株LYT-1進(jìn)行鑒定，并對該菌的促生長特性和抑制其他植物病原菌的抑菌譜進(jìn)行測定，以期為油桐粕生產(chǎn)多功能生物有機(jī)肥以及其他植物病害的防治提供生物資源。

1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地為省部共建木本油料資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，位于湖南省長沙市湖南省林業(yè)科學(xué)院內(nèi)。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

菌株LYT-1由湖南省林業(yè)科學(xué)院和中南林業(yè)科技大學(xué)從湖南國盛生物能源股份有限公司提供的油桐粕中分離所得。油茶炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、亞麻立枯病菌 （Rhizoctonia solani）、黃瓜枯萎病菌 （Fusarium oxysporum sp.cucumebrium Owen）、油菜菌核病菌（Sclerotinia scleratiorum）、亞麻炭疽病菌 （Colletotrichum linicolum）5種供試菌株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所提供。培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）［10］、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、解磷培養(yǎng)基（NBRIP）、油桐粕發(fā)酵培養(yǎng)基。

2.2 研究方法

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

病害拮抗試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：用直徑5 mm的打孔器打取油茶炭疽病菌、亞麻立枯病菌、油菜菌核病菌、亞麻炭疽病菌和黃瓜枯萎病菌菌餅分別種于裝有PDA培養(yǎng)基板的平中心，在距離中心點(diǎn)2.5 cm處等距離點(diǎn)種LYT-1菌，以單獨(dú)接種5種病原菌為對照，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，待對照組菌落長滿全皿時(shí)，測量每個(gè)病原菌的抑菌圈直徑，每個(gè)處理重復(fù)3次。

2.2.2 指標(biāo)測定與方法

（1）菌落形態(tài)觀察

LYT-1菌形態(tài)學(xué)鑒定方法如下：將菌種接種到NA培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)1 d后，觀察菌落表面形態(tài)、生長形狀、透明度等。

（2）生理生化指標(biāo)測定

革蘭氏染色、接觸酶測定、氧化酶測定、硝酸鹽還原測定、檸檬酸鹽利用、甲基紅測定、V-P試驗(yàn)、淀粉水解測定、產(chǎn)硫化氫測定、丙二酸鹽利用、明膠液化實(shí)驗(yàn)、卵磷脂酶活性測定等試驗(yàn)方法均參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［11］。

（3）16S rRNA分子鑒定

將菌株用NA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，10 000 r·min-1離心收集菌體，用試劑盒提取總基因組DNA，采用細(xì)菌通用引物 16SF （5＇-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3＇）和16SR（5＇-AGGTTACCTTGT TACGACTT-3＇）擴(kuò)增LYT-1菌16S rRNA基因片段。PCR產(chǎn)物委托北京上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，獲得序列在GenBank中進(jìn)行BLAST同源性比較分析，采用MEGA 6.0軟件Neighborjoining方法構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，確定該菌株分類的地位。

（4）蛋白質(zhì)降解能力檢測

將菌株LYT-1接種至液體的NA培養(yǎng)基，30℃、180 r·min-1培養(yǎng)至對數(shù)期（OD6001.0左右）后，以1% （v／v）接種比率將菌液接種至桐粕發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、180 r·min-1培養(yǎng)，每隔24 h取樣進(jìn)行氨基態(tài)氮的測定［12］。

（5）產(chǎn)IAA（吲哚乙酸）檢測

將LYT-1接種到不含L-色氨酸和含0.5 mmol·L-1L-色氨酸的液體培養(yǎng)基（TSB）中，以空白液體培養(yǎng)基（TSB）為對照，置于30℃搖床培養(yǎng)，48 h后各取菌懸液2 mL，10 000 r·min-1離心10min，取上清液，按2mL·mL-1添加Salkowski試劑，室溫避光靜置30 min后，觀察上清液顏色，顏色變成粉色者表示能夠產(chǎn)IAA。

（6）產(chǎn)氨能力檢測

將菌株LYT-1接種到裝有蛋白胨培養(yǎng)液的試管中，30℃震蕩培養(yǎng)3 d，每個(gè)試管滴加5滴納氏試劑，如培養(yǎng)液中出黃褐色沉淀者表示能夠產(chǎn)生氨。

（7）解磷能力檢測

在2%瓊脂的解磷培養(yǎng)基（NBRIP）上接種菌株LYT-1，在30℃下培養(yǎng)3 d后，觀察菌落周圍無色透明圈，以檢測該菌溶解磷的能力。

2.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Origin 2018軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌株LYT-1形態(tài)學(xué)鑒定

油桐粕蛋白質(zhì)降解菌LYT-1在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）培養(yǎng)24 h后形成圓形或橢圓形菌落，表面粗糙，污白色不透明（見圖1-A）。用顯微鏡觀察革蘭氏染色后的菌株LYT-1，發(fā)現(xiàn)菌體為直桿狀，兩端鈍圓，呈紫色（見圖1-B），確定為革蘭氏陽性菌。經(jīng)芽孢染色顯微觀察發(fā)現(xiàn)有芽孢產(chǎn)生（見圖1-C），符合芽孢桿菌屬 （Bacillus）特征。

3.2 菌株LYT-1生理生化特征

LYT-1菌株的生理生化特征測定結(jié)果如表1所示。該菌株能夠降解無機(jī)磷和纖維素，明膠液化和硝酸鹽還原反應(yīng)結(jié)果呈陽性，但檸檬酸利用和丙二酸利用為陰性。

3.3 菌株LYT-1的16S rRNA的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

對菌株LYT-1的16S rRNA基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得1 327 bp的目標(biāo)條帶，將測序結(jié)果在GenBank上進(jìn)行BLAST比對分析，并以同源性較高的序列作為參考，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示。經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育樹分析，菌株LYT-1（NCBI登錄號為KY626046）與枯草芽孢桿菌（NCBI登錄號為KP696781.1）聚為一支，相似度達(dá)到99%，確定LYT-1菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

圖2 菌株LYT-1菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain LYT-1

3.4 菌株LYT-1的蛋白質(zhì)降解能力

為了證實(shí)菌株LYT-1具有降解桐粕蛋白質(zhì)的性能，對菌株LYT-1發(fā)酵桐粕過程中氨基態(tài)氮的含量進(jìn)行了檢測，結(jié)果如圖3所示。

圖3 菌株LYT-1發(fā)酵桐粕過程中的氨基態(tài)氮含量的變化Fig.3 Changes of am ino nitrogen content in tung cake fermented by strain LYT-1

菌株LYT-1發(fā)酵過程中產(chǎn)生較高含量的氨基態(tài)氮，發(fā)酵10 d后，溶液中的氨基態(tài)氮含量可達(dá)44.1 mg·g-1，表明該菌具有較強(qiáng)的降解桐粕粗蛋白成氨基酸的能力。

3.5 菌株LYT-1促生長特性

對菌株LYT-1進(jìn)行促生潛力測量，結(jié)果如圖4所示。菌株LYT-1在NBRIP培養(yǎng)基上有明顯的透明圈（見圖4A），表明其具備解磷能力。在與Salkowski’s比色液結(jié)合后，菌株LYT-1的菌液未呈現(xiàn)出顏色變化 （見圖4B），表明其沒有分泌IAA。加納氏試劑后，菌株LYT-1蛋白胨培養(yǎng)液未呈現(xiàn)黃褐色沉淀（見圖4C），表明其沒有產(chǎn)氨。

圖4 菌株LYT-1的解磷（A）、產(chǎn)IAA（B）和產(chǎn)氨（C）的特性Fig.4 Characteristics of strain LYT-1 for phosphorus（A），IAA（B）and ammonia（C）production

3.6 菌株LYT-1拮抗特性

菌株LYT-1對5種供試病原菌的抑制效果表現(xiàn)程度均不相同（見圖5和表2）。圖5、表2結(jié)果顯示，菌株LYT-1對油菜菌核病原菌無抑制效果，而對亞麻立枯病菌、亞麻炭疽病菌、黃瓜枯萎病菌及油茶炭疽病菌具有較強(qiáng)的抑制作用，其中對黃瓜枯萎病菌和亞麻炭疽病菌抑制效果最顯著，抑菌圈直徑分別為21.6 mm和18.6 mm；對油茶炭疽病菌的抑制作用較弱，抑菌圈直徑為8.2 mm；表明其具有較廣譜的抑菌能力，開發(fā)潛力較大。

表2 菌株LYT-1對植物病原真菌的拮抗作用Tab.2 Antagonistic effect of LYT-1 against the phytopathogens

圖5 菌株LYT-1對5種病原真菌的抑菌作用Fig.5 Antagonistic effect of strain LYT-1 against the phytopathogens

4 結(jié)論與討論

油桐粕肥料化是油桐資源高值化利用的有效途徑之一。利用具有促生長和生防功能的菌株發(fā)酵生產(chǎn)出的生物有機(jī)肥既可以改良土壤、供肥和保水等，又有促進(jìn)植物生長和抑制有害病菌生長的作用［13］。多功能微生物資源的獲得成為了生產(chǎn)高品質(zhì)生物有機(jī)肥的關(guān)鍵?？莶菅挎邨U菌的生長過程可高效產(chǎn)生脂肪酶、蛋白酶、黑芥子酶和淀粉酶等生物酶，在芽孢形成過程中又可產(chǎn)生多種抗生素［14-17］。熊川等［18］通過16S rRNA基因序列獲得了高效降解菜籽餅粕中硫苷C1的菌株，該菌株可以高效分泌黑芥子酶。蔡學(xué)清等［19］通過對辣椒內(nèi)生枯草芽孢桿菌Bs-2的研究發(fā)現(xiàn)，Bs-2對辣椒苗的促生作用明顯，還可以誘導(dǎo)辣椒體內(nèi)吲哚乙酸等促生長激素含量的提高，并降低脫落酸等激素的形成。周勇［20］對添加了外源菌劑枯草芽孢桿菌ACCC-10619的豬糞堆肥腐熟度進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示其不僅大大縮短了發(fā)酵周期，并且都達(dá)到了完全腐熟的程度，說明該枯草芽孢桿菌能夠有效降解有機(jī)質(zhì)并加速堆肥進(jìn)程。本研究通過菌落形態(tài)、生理生化和16S rRNA分析，發(fā)現(xiàn)菌株LYT-1也是具有高效降解油桐蛋白質(zhì)和解磷能力的枯草芽孢桿菌，其對黃瓜枯萎病菌和亞麻炭疽病菌抑制效果最顯著，是生產(chǎn)富含氨基酸的多功能生物菌肥的理想生物資源。