葉文斌，樊亮，胡文斌，楊文，孫娜，王林林

（1.隴南師范高等?？茖W校農林技術學院，甘肅成縣 742500）

（2.隴南特色農業(yè)生物資源研究開發(fā)中心，甘肅成縣 742500）

（3.隴南師范高等?？茖W校數信學院，甘肅成縣 742500）

油橄欖（Olea europaea）是世界著名的木本油料樹種[1]，上世紀50 年代由從地中海沿海引種到我國，隴南是我國最適宜栽培種植地區(qū)，也是全國主產區(qū)。而油橄欖所結果實鮮榨后即為橄欖油，在橄欖油加工過程中會產生大量的油橄欖果渣，而果渣中含有大量礦物質和多酚類營養(yǎng)物質，具有開發(fā)成功能性食品的巨大潛力[2-7]，但目前除將其作為肥料和飼料外，長期得不到高效的利用，造成了嚴重的資源浪費和環(huán)境污染[2]，金耳[Naematelia aurantialba（Bandoni &M.Zang）Millanes &Wedin]為著名藥食兼用菌，藥性溫中帶寒、味甘，具化痰、止咳、定喘、調氣平肝陽的功效[8]，現代研究表明，其子實體含有人體必不可少的蛋白質、氨基酸、膠質物、胡蘿卜素、多種維生素及礦物質等，在降血糖血脂、保肝、抗血栓、抗氧化、抗輻射等方面具有很高的食用價值和保健功能[9-11]。黃果槲寄生果實多糖是黃果槲寄生[Viscum coloratum（Kom.）Nakai f.lutescensKitag]果實中所分離得到的主要有效生物活性成分，主要由高度酯化半乳糖聚合物、中性多糖及酸性多糖[12]等多糖組成，具有出眾的流變學特性和眾多的生理活性[13-15]。而咀嚼片是形狀各異、外表美觀的片劑食品，具有攜帶方便、食用便利等優(yōu)點，是大眾喜愛和流行的食品，且呈現的固態(tài)狀態(tài)更具營養(yǎng)的穩(wěn)定性，保質和貯藏時間較長，是食品最流行的加工方法之一[16-18]。

為此，以油橄欖果渣為原料，同時添加金耳粉、黃果槲寄生果實多糖和食品添加輔助成分，研制一種可以直接食用的低糖復合咀嚼片，開展單因素篩選試驗，優(yōu)化最佳工藝，開展安全和抗氧化作用評價，為隴南油橄欖果渣開發(fā)保健新產品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

鮮油橄欖果渣，由隴南市經濟林研究院提供；潔凈級KM 小鼠，購自中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，許可證號：SCXK(甘)2020-0002。黃果槲寄生果實多糖，由隴南師范高等?？茖W校農林技術學院食品實驗室提供，純度為為99.65%；金耳，由隴南康元生物科技有限公司提供；木糖醇、檸檬酸、硬脂酸鎂、D-異抗壞血酸鈉、氯化鈉、氯化鈣均為食品級；總抗氧化能力（ABTS+·）試劑盒、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）試劑盒、羥自由基（·OH）試劑盒、超氧陰離子（O2-·）檢測試劑盒，均購自上海舒話生物科技有限公司。SOD、CAT、GSH-Px 酶活性和MAD 含量檢測試劑盒，購自南京建成生物工程研究所有限公司；XC-750 粉碎機，購自浙江永康石柱鉑歐五金廠；DK-S24 恒溫水浴鍋，購自上海精宏實驗設備有限公司；臺式離心機，購自上海安亭科學儀器廠；THDP-6單沖壓片機，購自上海天闔機械；UV-2100 紫外可見分光光度計，購自龍尼柯儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

隴南油橄欖果渣→烘干→過篩→粉碎→堿法提取→膳食纖維→加到氯化鈉溶液→添加黃果槲寄生果實多糖粉末→添加金耳粉末→添加氯化鈣→添加D-異抗壞血酸鈉→添加麥芽糊精→添加檸檬酸→添加木糖醇→硬脂酸鎂→制軟材→濕法造粒→干燥→整?！鷫浩鷾缇b

1.2.2 工藝要點

選取新鮮完整的金耳，切成4 mm 薄片，用清水沖洗干凈后，于60 ℃干燥箱中干燥8 h，干燥器內冷卻，粉碎后過200 目篩，備用。將新鮮的油橄欖果渣在50 ℃烘箱中干燥殺青，過100 目篩，超微粉碎6 000目過篩成粉末備用。取100 g 果渣粉末添加到350 mL 0.008 g/mL 的NaOH 堿液中，在70 ℃水浴鍋中進行堿法提取處理，40 min 后，在4 000 r/min 轉速下離心，對上清液減壓濃縮后，用4 倍體積的φ=95%乙醇醇沉過夜，沉淀用φ=95%乙醇洗至中性。50 ℃條件下真空干燥至恒重，粉碎得水溶性膳食纖維，對離心分離得到的濾渣，用蒸餾水洗至中性，50 ℃條件下真空干燥至恒重，粉碎得水不溶性膳食纖維，去掉雜質的總膳食纖維得率為92.73%。將所獲得的總膳食纖維添加到0.10%（m/V）的氯化鈉溶液中，在振蕩頻率為160 r/min的搖床中振蕩10 min，攪拌均勻，添加0.25%（m/m）黃果槲寄生果實多糖粉末和6.0%金耳粉末，在搖床中振蕩10 min 攪拌均勻，再添加0.01%（m/m）的氯化鈣和0.03%（m/m）的D-異抗壞血酸鈉繼續(xù)振蕩攪拌10 min，再添加0.50%（m/m）的麥芽糊精、0.18%（m/m）檸檬酸振蕩攪拌10 min 后，分別添加16%（m/m）的木糖醇和1%（m/m）硬脂酸鎂振蕩攪拌10 min，待穩(wěn)定后迅速冷凍干燥，添加少量水分制備的甜味油橄欖低糖果渣膳食纖維粉軟材，干燥整粒壓片，脫氣滅菌裝瓶包裝后，室溫陰涼干燥處保存。

1.2.3 咀嚼片制備工藝單因素試驗

將制備的隴南油橄欖果渣膳食纖維粉按照總量的80%添加，確定好添加量后，加入到用蒸餾水配制成質量比為0.10%（m/V）的氯化鈉溶液中，添加一定比例的木糖醇、檸檬酸、黃果槲寄生果實多糖和金耳粉末，再添加0.01%（m/m）的氯化鈣、0.03%（m/m）的D-異抗壞血酸鈉、1%（m/m）的硬脂酸鎂和0.50%（m/m）的麥芽糊精，開展低糖油橄欖果渣膳食纖維制備的咀嚼片單因素篩選。從咀嚼片的組織形態(tài)、口感、風味和色澤進行綜合感官評定，木糖醇的添加量以質量比（m/m）為12%、14%、16%、18%和20%來進行篩選，在其他條件不變的情況下，檸檬酸的添加量以質量比（m/m）為0.14%、0.16%、0.18%、0.20%和0.22%來進行篩選，黃果槲寄生果實多糖的添加量以質量比（m/m）為0.15%、0.20%、0.25%、0.30%和0.35%來進行篩選，金耳粉末的添加量以質量比（m/m）為2%、4%、6%、8%和10%來進行篩選。

1.2.4 感官綜合評價與質量指標測定

將制備好的油橄欖果渣低糖復合咀嚼片放置7 d，邀請10 名食品相關專業(yè)人員從組織狀態(tài)、口感、風味、色澤等方面進行感官評價，總分為100 分。評價等級和標準參考張夢宇等[17]和任小莉等[19]的方法有改動，感官評價標準如表1 所示。質量指標測定參考湯葆莎等[20,21]的方法通過測定咀嚼片硬度、崩解時限、脆碎度和片重差異來考察；總砷、總鉛、總鎘、總汞按照GB/T 5009.11、GB/T 5009.12、GB/T 5009.15-2014 和GB/T 5009.17-2014 中的方法測定，商業(yè)無菌、霉菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌按GB/T 4789.26、GB/T 4789.15-2003、GB/ 4789.4-2016 和GB/ 4789.10-2016所規(guī)定的方法測定；體外抗氧化指標（ABTS+·、DPPH·、·OH 和O2-·清除能力）依據試劑盒的方法進行檢測。

表1 油橄欖果渣低糖復合咀嚼片感官評價Table 1 Sensory evaluation of olive pomace low-sugar compound chewable tablets

1.2.5 對小鼠急慢性毒理實驗

選取25～28 g KM 小鼠120 只，適應性喂養(yǎng)7 d后，隨機分為12 組，每組10 只，雌雄各半。采用最大耐受劑量法，先取50 只小鼠分別灌胃制備好的咀嚼片溶液，將咀嚼片粉碎成粉末用蒸餾水配成溶液，以5 000、10 000、15 000、20 000 和250 000 mg/(kg·bw)標準空腹一次性灌胃，后取50 只小鼠以灌喂等體積的生理鹽水為CK（0）組，灌胃后觀察其急性中毒癥狀、體征，飼料和水正常飼喂，連續(xù)觀察7 d，檢測急性LD50和生理指標等[22]；再取10 只小鼠灌胃制備好的咀嚼片溶液，以400 mg/kg·bw 標準空腹灌胃，再將10 只小鼠以灌喂等體積的生理鹽水為CK（0）組，連續(xù)灌胃90 d，飼料和水正常飼喂，在觀察其中毒癥狀、體征時，檢測30、60 和90 d 后的生理指標，觀察慢性毒理小鼠生活情況[22]，小鼠急慢性毒理實驗中血清中SOD、CAT、GSH-Px 酶活性和MAD 含量全部用試劑盒中的方法進行檢測。

1.3 數據統(tǒng)計

實驗所得數據采用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析，顯著性分析采用單因素方差分析進行比較，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

木糖醇、檸檬酸、金耳和黃果槲寄生果實多糖添加量對咀嚼片綜合感官評價由圖1～2 所示，由此可以看出：咀嚼片的綜合感官評價分值均隨著四種因素添加量的升高而逐漸升高，木糖醇、檸檬酸、金耳和黃果槲寄生果實多糖添加量分別在16%、0.18%、6%和0.25%時綜合感官評價分數最高。木糖醇添加量在14%和18%、檸檬酸添加量在0.16%和0.20%、金耳在4%和8%、黃果槲寄生果實多糖添加量在0.20%和0.30%時咀嚼片的綜合感官評分數都呈下降趨勢。所以可以確定14%、16%和18%的木糖醇、0.16%、0.18%和0.20%的檸檬酸、4%、6%和8%的金耳以及0.20%、0.25%和0.30%黃果槲寄生果實多糖為后續(xù)的響應面實驗參數，來優(yōu)化咀嚼片加工工藝。

圖1 木糖醇和檸檬酸對咀嚼片感官評價的影響Fig. 1 Effects of xylitol and citric acid on sensory evaluation of chewable tablets

圖2 金耳和黃果槲寄生果實多糖對咀嚼片感官評價的影響Fig. 2 Effect of Naematelia aurantialba and Viscum coloratum fruit polysaccharides on sensory evaluation of chewable tablets

2.2 咀嚼片響應面試驗設計與結果

選取木糖醇添加量（A）、檸檬酸添加量（B）、金耳添加量（C）和黃果槲寄生果實多糖添加量（D）為試驗因素，以綜合感官評分為響應值，按照Box-Behnken 中心組合實驗設計，優(yōu)化加工工藝確定了咀嚼片的響應面試驗因素水平表[23,24]，如表2 所示。

表2 響應面中心組合實驗設計工藝因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-behnken design

通過對油橄欖果渣低糖復合咀嚼片進行響應面實驗設計和結果的綜合感官評價，得到了試驗因素的回歸模型為：

方差分析結果和響應面實驗設計結果如表3和4所示，由此可知，經檢測模型顯著（P＜0.001），決定系數（R2）和校正系數（R2adj）分別為0.935 5 和0.953 2，兩者接近，響應面擬合較好[2,23,24]，而且模型失擬項不顯著（P=0.972 7），試驗誤差小。綜合分析該方程能很好地反映復合咀嚼片品質與四個因素之間的響應關系[2]。模型中A 和D 的一次項為顯著水平（P＜0.01），C 的一次項為極顯著水平（P＜0.05），而B 的一次項不顯著，四個二次項（A2、B2、C2和D2）都達到了極顯著水平（P＜0.01），而且除A 和D 交互項不顯著外（P＞0.05）、其他交互項都表現出極顯著差異水平（P＜0.01），說明木糖醇、檸檬酸、金耳和黃果槲寄生果實多糖添加量與復合咀嚼片加工工藝影響顯著，表明復合咀嚼片各因子的試驗值與預測值接近，可信度較高，可用于復合咀嚼片加工工藝優(yōu)化的理論預測[2,23,24]。通過模型和方差分析可以確定影響復合咀嚼片品質的因素大小順序為：金耳添加量（C）＞木糖醇添加量（A）＞黃果槲寄生果實多糖添加量（D）＞檸檬酸添加量（B）。

表3 復合咀嚼片工藝優(yōu)化響應面模型分析Table 3 Response surface model analysis of composite chewable tablets process optimization

表4 復合咀嚼片響應面實驗設計與結果Table 4 Response surface design and results of compound chewable tablets

響應曲面的坡度和等高線都可直觀反映出添加因素對復合咀嚼片感官品質的敏感度[2,23,24]，四種因子之間交互作用對對復合咀嚼片感官品質的結果如圖3～8所示。響應面存在著最高值，而且四個因子之間交互影響均在等高線范圍之內，說明影響復合咀嚼片最優(yōu)條件就在所選的濃度范圍之內[2,23,24]。通過響應面分析預測的最佳工藝參數為：木糖醇添加量為18%、檸檬酸添加量為0.16%、黃果槲寄生果實多糖添加量為0.25%、金耳添加量為6%，而且復合咀嚼片最佳優(yōu)化工藝的理論預測綜合感官評價為95.54（分），按照預測的最佳優(yōu)化工藝重復實驗，復合咀嚼片綜合感官評價值為94.93（分），和理論值相比沒有差異（P＞0.05），與單因素實驗的結果一致。而且在優(yōu)化的配方中用木糖醇作為甜味劑，不但豐富了營養(yǎng)成分，還適用于糖尿病患者[5,25]；添加檸檬酸和D-異抗壞血酸鈉既可以增加立體的酸味感覺，又能提高保存時間，并有阻止氧化酸敗，穩(wěn)定產品的顏色的作用[25,26]，添加氯化鈣可以強化咀嚼片的均一性。添加黃果槲寄生果實多糖不但增添了保健功能[13-15]，更為增添了口感的層次性。

圖3 木糖醇和檸檬酸添加量對咀嚼片感官品質的響應圖Fig. 3 Response of xylitol and citric acid addition to the sensory quality of chewable tablets

圖4 木糖醇和金耳添加量對咀嚼片感官品質的響應圖Fig. 4 Response of xylitol and Naematelia aurantialba to the sensory quality of chewable tablets

圖5 木糖醇和黃果槲寄生果實多糖添加量對咀嚼片感官品質的響應圖Fig. 5 Response of xylitol and Viscum coloratum fruit polysaccharide addition to the sensory quality of chewable tablets

圖6 檸檬酸和金耳加量對咀嚼片感官品質的響應曲圖Fig. 6 Response of citric acid and Naematelia aurantialba addition to the sensory quality of chewable tablets

圖7 檸檬酸和黃果槲寄生果實多糖添加量對咀嚼片感官品質的響應圖Fig. 7 Response of citric acid and Viscum coloratum fruit polysaccharide addition to the sensory quality of chewable tablets

2.3 感官評價和質量指標測定

油橄欖果渣低糖復合咀嚼片的抗氧化能力由圖9～10 所示。用Vc 和咀嚼片對比考察抗氧化作用，隨著咀嚼片的質量濃度升高，對ABTS+·、DPPH·、·OH和O2-·清除能力也隨之升高，所表現出的綜合抗氧化能力也隨之增強，但均比Vc 弱。在5 mg/mL 的濃度下，復合咀嚼片所表現出的ABTS+·、DPPH·、·OH 和清除率分別為91.28%、83.47%、67.58%和79.84%，與同等濃度的Vc 相比均呈顯著性差異（P＜0.05）。

圖9 咀嚼片和Vc 對ABTS＋·和DPPH·的清除率Fig. 9 ABTS+· and DPPH radical scavenging by chewable tablets and Vc

圖10 咀嚼片和Vc 對超氧陰離子和羥基自由基的清除率Fig. 10 Superoxide anion and hydroxyl radical scavenging by chewable tablets and Vc

對油橄欖果渣低糖復合咀嚼片進行3 次重復試驗，考察崩解時限、硬度、質量差異以及減失質量百分比等質量指標，結果如表5 所示，由此可知：重復試驗的咀嚼片均在13 min 左右崩解完成，硬度在42～45 N 范圍之內，均大于30 N，質量差異在7.5%上下，減失質量百分比小于0.50%。通過對制得片劑咀嚼片質量指標測定可以看出，制備工藝優(yōu)化已達到片劑制備質量標準要求[20,21]。制備的復合咀嚼片形態(tài)完整，斷面結構細密、無粉末，硬度適中、薄厚均勻，酸甜適中、咀嚼性好、無顆粒感，油橄欖特有風味突出，整體氣味協(xié)調較好、無其他異味，顏色淡棕色，均勻一致，對其進行理化指標和微生物指標檢測，各項理化指標均符合《中國藥典》2015 版要求，未檢出致病菌，結果如表6 所示。

表5 油橄欖果渣低糖復合咀嚼片質量指標Table 5 Quality indes of olive pomace low-sugar compound chewable tablets

表6 油橄欖果渣低糖復合咀嚼片的微生物指標Table 6 Microbiological index of olive pomace low-sugar compound chewable tablets

2.4 對小鼠急慢性毒理檢測

油橄欖果渣低糖復合咀嚼片對小鼠口服灌胃急性毒理實驗中，一次性灌服最大劑量為25 000 mg/kg·bw，給藥后依據葉文斌等[22]的方法籠邊觀察7 d，給藥后各組小鼠外觀毛色光亮，無竄動跳躍、豎毛扭體等異常反應現象，小鼠活動自如，攝食進水、大小便正常，未出現死亡，LD50未檢出，根據毒理學評價標準，LD50＞10 000 mg/kg·bw 屬于無毒性物質[22]，對小鼠血清中生化指標進行檢測，結果如圖11～12 所示。灌胃劑量為25 000 mg/kg·bw，7 d 后對小鼠血清中SOD、CAT、GSH-Px 活性和MDA 含量進行檢測后，小鼠血清中SOD、CAT、GSH-Px 活性和MDA 含量均升高與CK（0）相比成極顯著性差異（P＜0.01）；對小鼠進行頸椎脫臼處死，進行重要臟器病理檢查，均未出現明顯病理變化，說咀嚼片對小鼠急性毒理安全。對小鼠口服灌胃慢性毒理實驗中，灌服劑量均為400 mg/kg·bw，連續(xù)灌胃90 d，給藥后依據葉文斌等[22]的方法持續(xù)觀察，對小鼠血清中生化指標進行檢測，結果如圖13～14所示。在灌胃劑量為25 000 mg/kg·bw，連續(xù)灌胃90 d后，小鼠血清中SOD、CAT 與GSH-Px 活性與CK（0）之間相比均呈極顯著升高（P＜0.01），小鼠血清中MDA 的含量與CK（0）之間相比均呈極顯著降低（P＜0.01），對重要的臟器進行病理檢查，均未出現明顯病理變化。在急慢性毒理實驗中通過提高機體的內源抗氧化酶SOD、CAT 與GSH-Px 活性而提高機體的抗氧化能力，啟動CAT 就可以有效分解H2O2，降低H2O2對細胞的損傷[27]，同時在清除自由基誘發(fā)的脂質過氧化產物的時候GSH-Px 和SOD 與CAT 一同保護了肝細胞膜結構和功能的完整性[27]，降低了機體內脂質和組織過氧化程度，進而減少MDA 的含量。

圖11 咀嚼片對小鼠急性毒理SOD 和CAT 活性的影響Fig. 11 Effect of chewable tablets on SOD and CAT activity in mice with acute toxicity

圖12 咀嚼片對小鼠急性毒理GSH-Px 活性和MDA 含量的影響Fig. 12 Effect of chewable tablets on GSH-Px activity and MDA content in mice with acute toxicity

圖13 咀嚼片對小鼠慢性毒理SOD 和CAT 活性的影響Fig. 13 Effect of chewable tablets on SOD and CAT activity in mice with chronic toxicologica toxicity

圖14 咀嚼片對小鼠急性毒理GSH-Px 活性和MDA 含量的影響Fig. 14 Effect of chewable tablets on GSH-Px activity and MDA content in mice with chronic toxicity

綜上所述，復合咀嚼片可以提高小鼠體內SOD、CAT 與GSH-Px 等內源抗氧化酶活性，增強機體的抗氧化能力，降低機體內脂質和組織過氧化的程度，進而減少MDA 的含量，對小鼠屬于急慢性無毒性物質。

3 結論

以隴南油橄欖果渣膳食纖維為材料復配金耳和黃果槲寄生果實多糖，添加木糖醇、檸檬酸、氯化鈣和D-異抗壞血酸鈉等食品添加劑研制油橄欖果渣低糖復合咀嚼片，根據綜合感官評價，進行響應面設計實驗，優(yōu)化的配方為木糖醇、檸檬酸、金耳和黃果槲寄生果實多糖添加量分別為16%、0.18%、6%和0.25%，并添加0.01%的氯化鈣和氯化鈉、0.03%的D-異抗壞血酸鈉、1%的硬脂酸鎂和0.5%的麥芽糊精。研制的低糖復合咀嚼片形態(tài)完整，斷面結構細密、無粉末，硬度適中、薄厚均勻，酸甜適中、咀嚼性好、無顆粒感，油橄欖特有風味突出，整體氣味協(xié)調較好、無其他異味，顏色淡棕色，均勻一致，對其進行理化指標和微生物指標檢測，各項理化指標均符合國家安全標準，一次性灌胃25 000 mg/(kg·bw)觀察7 d 和400 mg/(kg·bw)標準連續(xù)灌胃小鼠90 d，結果顯示其無急慢性毒理作用。對咀嚼片進行抗氧化能力檢測，表現出較好的ABTS+自由基、DPPH 自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基清除能力，通過最優(yōu)化的配方所得到的咀嚼片，實際測得感官評分與模型預測值相近，檢測的重金屬含量均低于國家安全標準（＜0.05 mg/kg），未檢出沙門氏菌和金黃色葡萄球菌等致病菌，大腸桿菌數和真菌數量均遠低于國家安全標準。