李晨雯，柏珺，趙力，楊思昱，羅雅俊，張青碧

（西南醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，環(huán)境健康效應(yīng)及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估瀘州市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川瀘州 646000）

酒精所造成的疾病是世界各國(guó)都重視的公共衛(wèi)生問(wèn)題，我國(guó)歸因于飲酒的疾病負(fù)擔(dān)仍舊沉重，2019 年因飲酒致死的人數(shù)是1990 年的1.44 倍，且飲酒是我國(guó)居民死亡的第三位危險(xiǎn)行為因素[1]，長(zhǎng)期飲酒會(huì)引起機(jī)體代謝失衡，甚至酒精中毒。研究表明，長(zhǎng)期飲酒可通過(guò)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肝臟損傷[2]。雖然藥物可以緩解酒精毒性，但也會(huì)對(duì)機(jī)體造成一定副作用[3]。因此，探討天然植物提取物緩解酒精毒性的作用成為了研究熱點(diǎn)[4]。

辣木（Moringa oleifera）是辣木屬多年生熱帶落葉喬木，因生長(zhǎng)快速、富有營(yíng)養(yǎng)且功能多樣而具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，被稱(chēng)為“奇跡之樹(shù)”。已有研究發(fā)現(xiàn)辣木籽具有抗氧化、保肝護(hù)肝、抗炎、抗醉等多種作用[5-7]。藥理學(xué)研究表明，辣木籽提取物能夠促進(jìn)體內(nèi)酒精代謝，在減少酒精吸收的同時(shí)提高乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的活性[8]，從源頭上減少酒精的傷害。體外研究發(fā)現(xiàn)辣木籽在抗氧化方面有一定應(yīng)用前景[9]，同時(shí)其具有抗炎、保肝等作用，從機(jī)制上分析其對(duì)慢性酒精性肝損傷可能具有良好的療效。目前在對(duì)于辣木籽提取物的研究中，有研究提示辣木籽提取物可有效緩解酒精所致的線(xiàn)蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)障礙[3]，另外，辣木籽對(duì)酒精和四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷有緩解作用[10]。但目前辣木籽提取物對(duì)慢性酒精性肝損傷的緩解作用機(jī)制仍不清楚。

核轉(zhuǎn)錄 NF-E2 相關(guān)因子 2（Nuclear Factor Crythroid-related Factor 2，Nrf2）是抗氧化體系上游的重要調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控著上百種抗氧化相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[11]。許多天然藥物可通過(guò)調(diào)控Nrf2 來(lái)保護(hù)肝細(xì)胞免受酒精所致的氧化損傷[12,13]，有研究表明辣木籽可激活Nrf2 及其下游轉(zhuǎn)錄因子血紅素加氧酶1（HemeOxygenase 1，HO-1）[14]，提示辣木籽可能通過(guò)激活Nrf2/HO-1 信號(hào)通路激活機(jī)體的氧化防御系統(tǒng)。而炎性小體是位于細(xì)胞內(nèi)的多蛋白復(fù)合體，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)，而炎癥小體的核心成分為核苷酸結(jié)合寡聚化合物結(jié)構(gòu)域樣受體（Nucleotide-binding Oligomerization Domain Like Receptors，NLRPs）家族蛋白，核苷酸結(jié)合寡聚化合物結(jié)構(gòu)域樣受體3（NACHT-LRR-PYD-containing Proteins 3 Inflammasome，NLRP3）是NLRPs 家族中的一員，具有啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的作用[15]。研究表明，酒精性肝損傷患者的肝臟樣本中NLRP3 表達(dá)增加[16]，提示NLRP3 可能與酒精性肝病的發(fā)生發(fā)展存在關(guān)聯(lián)。有研究證實(shí)，辣木籽可減少阿霉素介導(dǎo)的心臟毒性臨床前模型的促炎生物標(biāo)志物如NLRP3[17]。這一結(jié)果提示辣木籽可通過(guò)抑制NLRP3 的表達(dá)進(jìn)而抑制炎癥的發(fā)生。因此我們推測(cè)，辣木籽可能通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2 及NLRP3的表達(dá)來(lái)緩解酒精所致的慢性肝損傷。本實(shí)驗(yàn)使用乙醇熱浸法對(duì)辣木籽進(jìn)行提取并將提取物用于慢性酒精性肝損傷小鼠，探索辣木籽提取物通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2 及NLRP3 對(duì)慢性酒精性肝損傷的影響，為辣木籽緩解慢性酒精性肝損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(川)2018-065），為6～8周齡Balb/C 小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，動(dòng)物飼養(yǎng)溫度（23±2）℃，濕度50%±5%。

1.2 藥品與試劑

辣木籽，云南省昆明市；無(wú)水乙醇，成都市科隆化學(xué)品有限公司；Lieber-DeCarli 酒精液體模型飼料[TP4032，飼料配比（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：脂肪12%，蛋白質(zhì)18%，碳水化合物34%，酒精36%]、Lieber-DeCarli 酒精液體對(duì)照飼料[TP4032C，飼料配比（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：脂肪12%，蛋白質(zhì)18%，碳水化合物70%]，南通特洛菲飼料有限公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine Aminotransferase，ALT）試劑盒、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate Aminotransferase，AST）試劑盒、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）試劑盒、還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）和超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）試劑盒，上海橋社生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 辣木籽提取物的制備

辣木籽提取物的獲取參考湯興楠等[18]研究，選擇乙醇熱浸法，該方法辣木籽生物活性物質(zhì)的提取率較高，包括總苷、總黃酮和總酚。該提取方法的最佳工藝條件：將干燥辣木籽研磨為粉末后過(guò)篩，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液按1:30 g/mL 料液比，70 ℃加熱提取，提取時(shí)間為2 h，提取2 次，用真空濾膜泵過(guò)濾提取物后，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器50 ℃真空濃縮過(guò)濾液，最后將濃縮液冷凍真空干燥后獲得固體提取物。用蒸餾水將終產(chǎn)物分別配制成5、10、15 mg/mL 的溶液，于4 ℃冰箱保存待用。

1.3.2 Lieber-DeCarli 酒精液體飼料動(dòng)物模型的建立

參考初君怡[16]的研究構(gòu)建小鼠慢性酒精性肝損傷模型。將60 只小鼠隨機(jī)分為以下6 組：A：空白對(duì)照組（CON group）；B：高劑量辣木籽提取物（15 mg/mL）對(duì)照組（HMo-CON group）；C：Lieber-DeCarli 酒精液體飼料組（酒精造模組，L-D group）；D：低劑量辣木籽提取物（5 mg/mL）酒精造模組（LMo group）；E：中劑量辣木籽提取物（10 mg/mL）酒精造模組（MMo group）；F：高劑量辣木籽提取物（15 mg/mL）酒精造模組（HMo group）。A、B 組用不含酒精的液體飼料喂養(yǎng)，C、D、E、F 組用等體積Lieber-DeCarli 酒精液體飲料喂食，同時(shí)，B、F 組用15 mg/mL 辣木籽提取物按每天10 mL/kg 灌胃，D 組用10 mg/mL 辣木籽提取物按每天10 mL/kg 灌胃，E 組用5 mg/mL 辣木籽提取物按每天10 mL/kg 灌胃。連續(xù)喂養(yǎng)小鼠8 周，模擬慢性酒精性肝損傷模型，8 周末處死小鼠。

1.3.3 血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠后采用眼球靜脈取血方式收集小鼠血液，將收集的血液置于2 mL 離心管中，血樣靜置30 min 后，4 000 r/min 離心15 min 后，取上清液并根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清中AST、ALT 及炎癥因子IL-18、IL-1β的含量。

1.3.4 肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察

取血后處死小鼠，剝離肝臟，將肝臟用冰生理鹽水漂洗、濾紙吸干水后，切取1 cm3的肝臟組織，用濾紙吸干血水，福爾馬林緩沖液固定，石蠟包埋后切片，經(jīng)蘇木精-伊紅染色法（Hematoxylin-Eosin Staining，HE），光鏡下觀察肝組織的病理學(xué)改變。

1.3.5 肝臟中MDA、GSH 和SOD 的檢測(cè)

將1.3.4 中剩余肝臟組織分裝于-80 ℃保存?zhèn)溆谩７盅b的各組肝臟組織稱(chēng)取1 g放入玻璃勻漿管口剪碎，加入9 倍體積冷生理鹽水。低溫狀態(tài)下降肝臟組織充分研碎使組織勻漿化，低溫離心機(jī)離心3 000 r/min 離心15 min 取上清液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作測(cè)定MDA、GSH 和SOD 的含量。

1.3.6 Western blot 檢測(cè)肝臟中蛋白表達(dá)水平

稱(chēng)取適量分裝的小鼠肝臟組織，加入4 ℃裂解緩沖液提取總蛋白。使用BCA 蛋白測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。將各樣品蛋白濃度調(diào)整至一致后，將等量蛋白加入提前配好的SDS-PAGE 凝膠上進(jìn)行電泳，電泳完成后進(jìn)行濕轉(zhuǎn)恒流轉(zhuǎn)膜，使蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，將PVDF 膜浸入封閉液封閉90 min，封閉完成后將PVDF 膜放在加入相應(yīng)抗體的一抗稀釋液中，37 ℃恒溫滴膜孵育2 h 或4 ℃過(guò)夜。一抗孵育完畢后用TBST 清洗4 次，每次5 min；清洗完畢后將PVDF 膜放在二抗稀釋液中，37 ℃恒溫滴膜孵育1 h；孵育完畢后用TBST 清洗4 次，每次5 min；將PVDF 膜浸泡于ECL 發(fā)光液中，在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行曝光。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析和單因素方差分析，分析后兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣木籽提取物對(duì)慢性酒精性肝損傷小鼠肝臟功能的影響

隨著肝細(xì)胞的破壞，肝損傷會(huì)導(dǎo)致血清學(xué)指標(biāo)的明顯改變，慢性酒精性肝損傷常表現(xiàn)為肝細(xì)胞壞死和各種肝功能損傷指標(biāo)均明顯高于正常動(dòng)物。梁華峰等[19]的研究表明，采用血清AST、ALT、MDA、γ-GT、腫瘤壞死因子TNF-α、IL-1β能較為可靠的反映肝功能的變化。AST 和ALT 是臨床評(píng)估肝功能是否損傷的常用指標(biāo)[20]，在酒精性肝損傷的相關(guān)研究中可發(fā)現(xiàn)，酒精干預(yù)組均會(huì)引起模型動(dòng)物血清中AST 及ALT的顯著升高[8,21]，表明酒精會(huì)造成動(dòng)物出現(xiàn)一定程度的肝損傷。而在本研究中，通過(guò)小鼠血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖1），與對(duì)照組相比，高劑量辣木籽提取物對(duì)照組ALT 及AST 無(wú)明顯變化，表明在無(wú)酒精影響的情況下，辣木籽提取物對(duì)大鼠的肝功能影響不大；而Lieber-DeCarli 酒精液體飼料組的ALT 及AST 的表達(dá)顯著升高，ALT 的表達(dá)增高至105.77 U/L，AST 的表達(dá)增長(zhǎng)至210.37 U/L；與酒精造模組相比，給予不同濃度辣木籽提取物處理的酒精液體飼料喂食小鼠的血清中ALT 及AST 含量顯著降低，并與辣木籽提取物的濃度呈現(xiàn)劑量—效應(yīng)關(guān)系，而高劑量的辣木籽提取物處理的酒精造模組的ALT 及AST 分別降至46.84 U/L 和71.68 U/L。這些結(jié)果提示辣木籽提取物能降低慢性酒精性肝損傷小鼠血清中ALT 及AST 的含量。

圖1 各組血清ALT 及AST 含量Fig. 1 Contents of ALT and AST in serum of each group

3.2 辣木籽提取物對(duì)慢性酒精性肝損傷小鼠肝臟質(zhì)量及肝臟指數(shù)的影響

為進(jìn)一步判斷酒精對(duì)肝臟的損傷程度及辣木籽是否具有保肝護(hù)肝作用，我們對(duì)小鼠體質(zhì)量及肝臟進(jìn)行稱(chēng)量并計(jì)算肝臟指數(shù)。

式中：

L——肝臟指數(shù)，%；

m——肝臟質(zhì)量，g；

m0——小鼠體質(zhì)量，g。

如表1 所示，與對(duì)照組相比，慢性酒精暴露的小鼠體質(zhì)量明顯減輕，但肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)明顯增加。辣木籽提取物干預(yù)可明顯降低小鼠的肝臟指數(shù)，與Lieber-DeCarli 酒精液體飼料組相比，辣木籽提取物中劑量和高劑量組小鼠的肝臟質(zhì)量指數(shù)分別降低了10.70%和23.20%。這一結(jié)果提示了辣木籽提取物可減輕酒精所致的小鼠慢性肝損傷。

表1 各組小鼠肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)Table 1 Liver weight and liver index of mice in each group

3.3 辣木籽提取物對(duì)慢性酒精性肝損傷小鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)的影響

為更進(jìn)一步判斷酒精造模是否成功并確定辣木籽提取物對(duì)酒精造成的肝損傷有抑制作用，我們將肝臟組織進(jìn)行了HE 染色并觀察其病理學(xué)變化。根據(jù)圖2的HE 染色結(jié)果顯示，對(duì)照組和高劑量辣木籽提取物對(duì)照組的小鼠肝細(xì)胞排列整齊、大小均一，細(xì)胞核呈圓形，界限清晰，分布在肝細(xì)胞中央，肝小葉結(jié)構(gòu)正常。Lieber-DeCarli 酒精液體飼料組肝細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞質(zhì)疏松、腫脹，嗜酸性下降，細(xì)胞核固縮，形態(tài)不一，小靜脈周?chē)梢?jiàn)大量點(diǎn)狀或片狀壞死，肝細(xì)胞索排列紊亂，肝細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)明顯空泡狀。這一結(jié)果結(jié)合血清學(xué)指標(biāo)和肝臟指數(shù)的變化，提示采用本方法構(gòu)建慢性酒精性肝損傷小鼠模型成功。而在造模成功的慢性酒精性肝損傷大鼠肝組織中，辣木籽提取物隨著劑量的增加呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性的肝保護(hù)作用，對(duì)酒精所致的肝細(xì)胞脂肪變性、炎性浸潤(rùn)及壞死有不同程度的減輕。這一結(jié)果與張蕾等[10]的研究結(jié)果類(lèi)似，提示辣木籽提取物在一定程度上抵抗長(zhǎng)期攝入酒精所致的肝損傷。

圖2 各組小鼠肝組織HE 染色圖片F(xiàn)ig. 2 HE staining pictures of liver tissues of mice in each group

3.4 辣木籽提取物對(duì)慢性酒精性肝損傷小鼠肝臟氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

慢性酒精性肝損傷主要是由于乙醇在人體內(nèi)的代謝產(chǎn)生有害的活性氧（ROS）等活性分子引發(fā)氧化應(yīng)激，抑制肝細(xì)胞的抗氧化能力并通過(guò)增加脂質(zhì)過(guò)氧化物的形成，使肝組織得不到足夠的氧導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡，此外乙醇的代謝物乙醛也會(huì)通過(guò)脂質(zhì)的過(guò)氧化與蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)合而對(duì)肝產(chǎn)生毒害作用導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡[22]。丙二醛（MDA）作為體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的主要終產(chǎn)物，其水平反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化程度，可間接判斷細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度；超氧化物歧化酶（SOD）活力反映機(jī)體清除自由基能力；還原型谷胱甘肽（GSH）主要作用是清除自由基，防止脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)發(fā)生，其水平也是衡量機(jī)體抗氧化能力的重要因素[23]。酒精可以導(dǎo)致SOD、GSH 等抗氧化物質(zhì)減少，進(jìn)而導(dǎo)致MDA 的增加[4]，這一現(xiàn)象證明了氧化應(yīng)激可能是酒精造成肝臟損傷的重要因素。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明（圖3），與對(duì)照組相比，給予酒精飲料進(jìn)行慢性酒精性肝損傷造模后，小鼠肝臟中SOD 和GSH 的含量顯著降低，而MDA 含量顯著升高；而同時(shí)給予不同劑量辣木籽提取物后，SOD 和GSH 的含量較模型組均有不同程度的升高，MDA 有不同程度的降低。提示辣木籽提取物能調(diào)節(jié)慢性酒精性肝損傷模型小鼠肝臟中的氧化應(yīng)激反應(yīng)，起到抗氧化作用，減輕酒精引起的氧化損傷。

圖3 各組肝臟MDA、SOD 和GSH 含量Fig. 3 Contents of MDA,SOD and GSH in liver of each group

3.5 辣木籽提取物對(duì)慢性酒精性肝損傷小鼠肝臟炎癥因子表達(dá)的影響

炎癥在肝損傷中發(fā)揮重要作用，而酒精的代謝產(chǎn)物會(huì)增加腫瘤壞死因子、白介素IL-1、IL-6、IL-10 等炎性因子的產(chǎn)生進(jìn)而影響甘油三酯的轉(zhuǎn)運(yùn)而引起脂代謝紊亂[24]，進(jìn)而加重肝損傷。有研究證實(shí)，長(zhǎng)期飲酒后，肝細(xì)胞會(huì)合成大量炎性因子，進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡[25]。在關(guān)于肝臟疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-18 是重要的促炎因子和免疫調(diào)節(jié)因子，同時(shí)IL-1β能夠誘導(dǎo)肝細(xì)胞產(chǎn)生眾多細(xì)胞因子，加速肝細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步加重肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)，使肝細(xì)胞清理炎癥因子和內(nèi)毒素的能力下降[26]。因此，選擇IL-18 和IL-1β這兩個(gè)代表性的炎癥因子進(jìn)行檢測(cè)。如圖4 所示，與對(duì)照組相比，Lieber-DeCarli 酒精液體飼料組的小鼠血清中IL-18 和IL-1β的含量顯著增加至105.77 pg/mL 和125.77 pg/mL，與對(duì)照組相比呈明顯增加（P＜0.05）。不同濃度的辣木籽提取物能夠有效降低酒精引起的IL-18 和IL-1β水平的升高，高劑量辣木籽提取物灌胃治療后分別降低至56.84 pg/mL 和52.84 pg/mL，與酒精造模組相比具有顯著差異（P＜0.05）。這些結(jié)果提示辣木籽提取物可能通過(guò)降低炎癥因子IL-18和IL-1β的分泌，起到抗炎作用。

圖4 各組血清中IL-18 和IL-1β 的含量Fig. 4 Contents of IL-18 and IL-1β in serum of each group

3.6 辣木籽提取物對(duì)慢性酒精性肝損傷小鼠相關(guān)氧化應(yīng)激及炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

上述研究結(jié)果表明，酒精可通過(guò)氧化應(yīng)激和增加炎癥因子的表達(dá)造成肝損傷，而辣木籽提取物可通過(guò)增加抗氧化物質(zhì)含量以及降低炎癥因子的表達(dá)從而減緩酒精造成的肝損傷。有研究表明，Nrf2 作為抗氧化體系上游的重要調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，在氧化應(yīng)激的狀態(tài)下，Nrf2 可促進(jìn)多種抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄，如GSH、HO-1等。而在酒精的作用下，Nrf2 蛋白表達(dá)被抑制，抑制抗氧化防御系統(tǒng)，導(dǎo)致肝臟氧化應(yīng)激加重[27]。因此，為進(jìn)一步探討辣木籽提取物調(diào)控抗氧化因子的分子機(jī)制，測(cè)定了抗氧化體系上游的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 及其下游轉(zhuǎn)錄因子HO-1 的蛋白表達(dá)。

如圖5 所示，慢性酒精性肝損傷小鼠肝臟中Nrf2及HO-1 的蛋白表達(dá)水平顯著下降，表明慢性酒精暴露能顯著抑制肝臟Nrf2 的表達(dá)，進(jìn)而抑制下游轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而影響肝組織中Nrf2 的抗氧化通路。不同劑量的辣木籽提取物能夠劑量依賴(lài)的提高Nrf2 蛋白水平，同時(shí)HO-1 蛋白的表達(dá)水平也顯著提高，提示在辣木籽提取物的作用下Nrf2 信號(hào)通路被有效激活，進(jìn)而增強(qiáng)氧化防御系統(tǒng)，產(chǎn)生抗氧化應(yīng)激。在糖尿病腎病大鼠的研究中，辣木籽提取物可通過(guò)激活Nrf2/HO-1 通路保護(hù)患病大鼠的腎功能，證實(shí)了辣木籽提取物可以激活Nrf2/HO-1 信號(hào)通路對(duì)機(jī)體產(chǎn)生一定的保護(hù)作用[28]。同時(shí)Nrf2 也是NLRP3 炎癥小體的上游調(diào)控因子，其與NLRP3 炎癥小體的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而NLRP3 炎癥小體可促進(jìn)含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（Cysteinyl Aspartate Specific Proteinase 1，Caspase-1）的產(chǎn)生，同時(shí)Caspase-1 涉及了IL-18 及IL-1β成熟與釋放[29,30]，提示NLRP3 的增加可加速炎癥反應(yīng)的進(jìn)程。而辣木籽可減少心臟毒性臨床前模型中NLRP3 炎癥小體的表達(dá)[17]，因此我們推測(cè)，辣木籽可能也存在抑制炎癥因子的表達(dá)進(jìn)而延緩酒精所致的慢性肝損傷進(jìn)程，因此我們檢測(cè)了小鼠肝組織中的NLRP3 及Caspase-1 的蛋白表達(dá)水平。Western blot 結(jié)果顯示，慢性酒精性肝損傷小鼠肝臟中NLRP3 的蛋白水平顯著增高，提示慢性酒精暴露促進(jìn)肝臟NLRP3的表達(dá)，同時(shí)Caspase-1 在慢性酒精性肝損傷小鼠的肝臟組織中的表達(dá)水平也顯著升高，證明在酒精的長(zhǎng)期作用下，小鼠肝臟組織中的NLRP3 炎性小體被激活并促進(jìn)下游促炎因子Caspase-1 的表達(dá)，加重其肝臟損傷。而不同劑量的辣木籽提取物能夠劑量依賴(lài)性的降低NLRP3 蛋白表達(dá)，同時(shí)降低Caspase-1 的蛋白表達(dá)，提示辣木籽提取物可以通過(guò)降低NLRP3 的表達(dá)，降低下游促炎因子的表達(dá)，從而減輕慢性酒精暴露所致的小鼠肝臟的炎癥反應(yīng)。在關(guān)于Nrf2 的研究中，有研究提示Nrf2 是NLRP3 炎性小體的上游調(diào)控因子，激活Nrf2 的基因表達(dá)可有效抑制NLRP3 炎性小體的表達(dá)[29]，在辣木籽提取物的作用下，Nrf2 的蛋白表達(dá)增高，其下游轉(zhuǎn)錄因子HO-1 的表達(dá)增高，激活肝臟組織中的氧化防御系統(tǒng)，同時(shí)減少NLRP3 炎性小體的表達(dá)，進(jìn)而降低Caspase-1 蛋白的表達(dá)，減輕肝臟組織中的炎癥反應(yīng)，從而改善酒精所致的慢性肝損傷，表明辣木籽提取物對(duì)肝臟具有保護(hù)作用。

圖5 各組肝組織中相關(guān)蛋白表達(dá)Fig. 5 Protein expression of Nrf2 and NLRP3 in liver tissues of each group

3 結(jié)論

綜上所述，辣木籽提取物能夠降低慢性酒精性肝損傷小鼠血清中ALT、AST 水平，呈現(xiàn)出對(duì)肝臟的保護(hù)作用。辣木籽提取物一方面通過(guò)激活Nrf2/HO-1 信號(hào)通路，提升肝臟抗氧化水平，降低脂質(zhì)過(guò)氧化水平；另一方面通過(guò)抑制NLRP3/Caspase-1 信號(hào)通路，減少I(mǎi)L-18、IL-1β的成熟與釋放，減輕炎癥反應(yīng)。因此辣木提取物可能通過(guò)促進(jìn)小鼠肝臟的抗氧化及減少抗炎因子的表達(dá)來(lái)減輕酒精對(duì)小鼠肝臟的慢性損傷。