安立昆,姚有華,姚曉華,吳昆侖

(1.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院,西寧 810016;2.青海省青稞遺傳育種重點實驗室,西寧 810016;3.國家麥類改良中心青海青稞分中心,西寧 810016)

青稞(HordeumvulgareL.var.nudumHook.f.),是大麥的變種,是青藏高原歷史最悠久栽培最廣泛的作物。青稞富含纖維素、蛋白質(zhì)、β-葡聚糖,是獨具高原地方特色的保健食品,也是食品和飼料加工的重要原料,在青藏高原糧食安全和農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展中占有重要的地位[1-3]。青藏高原是青稞的主要產(chǎn)區(qū)之一,青藏高原地區(qū)氣候惡劣,在土壤貧瘠、干旱、低溫、強紫外線等多種逆境環(huán)境中經(jīng)過長期的進化和人工培育,產(chǎn)生了種類豐富的青稞資源[4]。

氮元素是作物最重要的營養(yǎng)元素之一,是作物生長發(fā)育過程中需求量最大的元素,直接影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[5]。在低氮條件下作物的耐低氮性與其產(chǎn)量緊密相關(guān),很多研究表明作物對氮素的吸收和利用存在顯著的基因型差異,作物對氮素的利用能力是可遺傳性狀[6-9]。篩選耐低氮作物品種是提高作物氮利用效率減少氮肥施用最有效途徑之一[10]。苗期是進行作物耐低氮性研究的最佳時期之一,在苗期低氮條件對不同作物品種的農(nóng)藝性狀或生理特點進行測定,并進一步篩選耐低氮作物資源已經(jīng)成為廣泛采用的研究方法[11-12]。陳志偉等[12]分別采用正常供氮 (2.0mmol/L NH4NO3)和低氮(0.4mmol/L NH4NO3)的改良Hoagland’s溶液對6種不同基因型的大麥進行培養(yǎng),并對耐低氮相關(guān)性狀指標進行研究發(fā)現(xiàn)不同基因型大麥對低氮脅迫的耐受能力存在極顯著的差異。張錫洲等[13]對16份野生大麥全生育期氮素吸收利用能力進行了研究,發(fā)現(xiàn)不同基因型野生大麥在同一低氮水平下其氮素的吸收利用存在顯著差異。楊麗娜[14]采用苗期水培的方法以82份西藏野生大麥和16份栽培大麥為材料進行耐低氮品種篩選,發(fā)現(xiàn)不同大麥基因型的耐低氮能力具有顯著差異,認為發(fā)達的根系是大麥耐低氮特性的關(guān)鍵,并篩選出5個耐低氮大麥品種。趙化田等[15]采用水培的方法對46份小麥苗期低氮脅迫下的農(nóng)藝性狀和生理特性進行研究,從中篩選出耐低氮小麥資源15份,并認為采用苗期水培的方法進行不同基因型作物耐低氮研究可以消除不同基因型間固有的生物學(xué)和遺傳學(xué)特性差異,具有速度快,環(huán)境條件易控制等優(yōu)點,能更充分地進行作物耐低氮能力的評價。主成分和隸屬函數(shù)分析是作物耐低氮性評價中廣泛采用的方法。黃興東[16]對60個谷子品種在低氮條件下的農(nóng)藝性狀和生理指標進行了主成分和隸屬函數(shù)分析,從中篩選出了2個耐低氮谷子品種。張楚[17]對低氮脅迫下9份苦蕎品種苗期農(nóng)藝性狀和生理特征進行主成分和隸屬函數(shù)分析,篩選出2個耐低氮苦蕎品種,并認為優(yōu)良的根構(gòu)型和根系生理特性是苦蕎耐低氮特性的關(guān)鍵。

目前對大多數(shù)作物的耐低氮資源篩選和研究都有廣泛而深入的報道,但關(guān)于青稞耐低氮資源篩選和生理研究的報道極少。本研究采用苗期水培方法,對低氮培養(yǎng)條件下不同青稞品種苗期生理特性進行研究,為篩選和培育耐低氮青稞品種,減少青稞生產(chǎn)中氮肥的使用奠定了重要的研究基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 試驗材料

青稞品種‘康青3號’‘昆侖15’‘黃青1號’‘肚里黃’‘洛隆宗’‘特鄔’‘二道眉白青稞’‘昆侖18’由青海省青稞遺傳育種重點實驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 青稞萌發(fā)和培養(yǎng) 選取飽滿的青稞種子用84消毒液浸泡6 min后用清水沖洗5次,將種子放在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中室溫下進行萌發(fā),5 d后選取長勢一致的幼苗固定于泡沫板中,每個青稞品種20株幼苗,所有青稞品種放于同一黑色塑料盒(600 mm × 500 mm × 160 mm)中,共設(shè)置2盒。采用改良Hoagland’s培養(yǎng)液(80 mg/L NH4NO3)進行培養(yǎng)。每個塑料盒20 L培養(yǎng)液。用空氣泵24 h向培養(yǎng)液中通入空氣,每3 d更換一次培養(yǎng)液,每天用1 mol/L KOH溶液穩(wěn)定pH值為7.0。當幼苗生長至3葉期胚乳營養(yǎng)耗盡時,選其中的一盒改用(20 mg/L NH4NO3)改良Hoagland’s培養(yǎng)液進行低氮培養(yǎng)。待青稞生長至5葉期時對生理指標進行測定。

1.2.2 測定指標與方法 生理指標測定:葉綠素SPAD值測定采用日本柯尼卡美能達SPAD-502Plus便攜式葉綠素SPAD測定儀測定。選取待測青稞新鮮的葉片和根為樣品,參照各參考文獻和試劑盒說明書進行處理和測定。采用考馬斯亮藍比色法測定植物可溶性蛋白含量;采用茚三酮比色法測定植物脯氨酸含量[18];采用凱氏定氮法測定植物全氮含量?？偟鞍?TP)、丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)谷氨酰胺合成酶(GS)、硝酸還原酶(NR)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所有限公司。采用美國賽默飛Multiskan FC酶標儀對各指標進行測定,所有指標均測定3次重復(fù)。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 低氮培養(yǎng)條件下各青稞品種葉和根的總氮、總蛋白、NR酶活性、葉綠素SPAD值、脯氨酸、MDA、SOD、POD、CAT、GS活性的生理指標顯著性、變異系數(shù)、相關(guān)性、主成分和隸屬函數(shù)分析,參考文獻[19-22]等進行計算和分析。利用Microsoft Excel 2019和SPSS 22.0分析處理數(shù)據(jù)。

耐低氮系數(shù)=低氮處理下測定值/正常處理下測定值

變異系數(shù)=標準偏差/平均值×100%

隸屬函數(shù):μ(Xj)=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)j=1,2,3,…,N;

反隸屬函數(shù):μ(Xj)=1-(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)j=1,2,3,…,N;(Xj)表示第j個綜合指標的隸屬函數(shù)值;Xj表示第j個綜合指標值;Xmax表示第j個綜合指標的最大值;Xmin表示第j個綜合指標的最小值。

j=1,2,3,…,n;Wj表示第j個綜合指標在所有綜合指標中的重要程度及權(quán)重;Pj為各品種第j個綜合指標的貢獻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 低氮脅迫對不同青稞品種幼苗生理指標的影響

利用獨立樣本T檢驗比較不同處理方式(正常、低氮)下不同青稞品種中葉和根中總氮、總蛋白、脯氨酸、MDA、葉綠素SPAD、SOD、POD、CAT、NR、GS含量或酶活性變化情況。結(jié)果如表1所示,相較于正常培養(yǎng)條件下,低氮脅迫處理后所有青稞品種中葉和根中總氮、總蛋白、NR酶活性和葉綠素SPAD均出現(xiàn)顯著下降(P< 0.05)。另外,無論是葉還是根,青稞中脯氨酸、MDA、SOD、POD、CAT、GS含量或酶活性都出現(xiàn)了顯著上升(P<0.05)。計算各指標變異系數(shù)進一步比較不同處理方式下各指標的波動情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)葉綠素SPAD、NR活性和GS活性在正常和低氮兩組間的變異程度相差較大,說明低氮脅迫下對青稞葉綠素SPAD、NR活性和GS活性影響較大。其余生理指標在正常和低氮兩組間的變異程度基本無顯著性差異。進一步比較不同生理指標的耐低氮系數(shù)變化情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)NR、POD和GS活性耐低氮指數(shù)變異系數(shù)較大,說明根NR活性、POD和GS活性對低氮脅迫敏感。根GS活性耐低氮指數(shù)變異系數(shù)最大可以作為耐低氮指初級篩選指標(表2)。

表1 低氮脅迫對青稞苗期葉和根中的生理指標影響Table 1 Effect of low nitrogen stress on physiological indexes in leaves and root of hulless barely at seedling stage

表2 正常和低氮水平處理下青稞苗期生理指標間的變異Table 2 Variation coefficient of physiological indexes in leaves and roots of hulless barely at seedling stage under normal nitrogen and low nitrogen treatment

2.2 不同供氮水平下青稞資源主成分分析

利用相關(guān)性分析探索19個生理指標之間的內(nèi)在聯(lián)系,結(jié)果如表3所示。從組織類型角度分析發(fā)現(xiàn),葉和根中的生理指標的相關(guān)性結(jié)果基本一致。19個生理指標中有19對指標之間存在顯著相關(guān)(P<0.05),27對呈極顯著相關(guān)(P< 0.01)。相關(guān)性結(jié)果說明這些生理指標之間在解釋青稞耐低氮性信息時存在協(xié)同關(guān)系。因此,采用主成分分析對青稞品種耐低氮進行綜合評價以提取公因子來對原始19個生理指標進行維度劃分,進一步篩選能代表青稞耐低氮能力的關(guān)鍵生理指標。主成分分析結(jié)果顯示特征值排名前三的主成分在解釋樣本間聯(lián)系的累計貢獻率達到 90.16%,說明可以利用提取的主成分表示原始數(shù)據(jù)的主要信息。其中第一主成分貢獻率 71.99%,葉和根MDA含量的特征向量絕對值遠高于其他指標,表明第一主成分主要由葉和根MDA構(gòu)成,可以總結(jié)為細胞膜系統(tǒng)氧化損傷指標因子。第二主成分貢獻率為12.35 %,主要由葉和根SOD、POD、CAT活性、總氮、葉綠素SPAD值構(gòu)成,可以總結(jié)為細胞抗氧化酶活性因子。而變異系數(shù)分析中POD和葉綠素SPAD耐低氮指數(shù)變異系數(shù)也較大。第三主成分貢獻率為5.82%,同樣由葉和根SOD、POD、CAT活性構(gòu)成,同樣可以總結(jié)為細胞抗氧化酶活性因子(表4)。公因子提取結(jié)果也與相關(guān)性結(jié)果(表3)結(jié)論基本一致:第一主成分MDA與同樣被提取出來的第二主成分的幾個指標之間存在較強的相關(guān)性;第二主成分:POD和SOD酶活、總氮與CAT、SOD和CAT、葉綠素和CAT之間存在相關(guān)性,說明這些指標在表征青稞的耐低氮能力中存在協(xié)同作用。主成分分析表示MDA和抗氧化酶類活性在評價青稞耐低氮特性中起主導(dǎo)地位,可以作為評價青稞耐低氮能力的重要生理指標。

表3 青稞苗期不同生理指標相對值之間的相關(guān)性分析Table 3 Correlation coefficients among low nitrogen stress coefficients of physiological indexes in leaves and roots of hulless barely at seedling stage

表4 低氮處理下青稞苗期葉和根生理指標主成分分析Table 4 Principal component analysis of physiological indexes in leaves and roots of hulless barely at seedling stage under low nitrogen treatment

2.3 不同供氮水平下青稞生理指標的相關(guān)性和隸屬函數(shù)分析值

根據(jù)綜合得分值利用隸屬函數(shù)計算隸屬值,對8個青稞品系進行模糊隸屬函數(shù)分析。結(jié)果如表5所示,隸屬排名平均值越大,說明該品系耐低氮能力越強,具體排序為‘黃青1號’>‘肚里 黃’>‘昆侖15’>‘二道眉白青稞’>‘特鄔’>‘洛隆宗’>‘昆侖18’>‘康青3號’。本研究根據(jù)各品種隸屬值對8種青稞的耐低氮能力進行評估,結(jié)果發(fā)現(xiàn)‘黃青1號’和‘肚里黃’隸屬值大于0.5,說明這兩個品種對低氮有更強的耐受能力?！?5’‘二道眉白青稞’‘特鄔’‘洛隆宗’‘昆侖18’和‘康青3號’的隸屬值集中為0.243～ 0.415,說明這6個品種對低氮相對敏感。

3 討 論

農(nóng)作物對低氮的耐受機制是有一系列非常復(fù)雜的生理調(diào)控過程,不同基因型作物對低氮耐受機制各有差異。目前很多關(guān)于大麥和青稞耐低氮研究大多集中于對低氮條件下的農(nóng)藝性狀進行分析,并且通常選擇植株相對干質(zhì)量作為大麥耐低氮篩選的重要農(nóng)藝性狀指標,關(guān)于大麥尤其是青稞中耐低氮篩選相關(guān)生理指標的報道極少[12,23-25]。本研究對8種青稞在低氮條件下植株葉片和根中的相關(guān)生理指標進行了測定和分析,各青稞品種在低氮處理下各生理指標都出現(xiàn)了明顯差異,不同青稞品種對低氮的耐受性表現(xiàn)出了明顯差異。