劉笑蓉，李碩夫，梅文亞，湛 歡，劉平安，周日寶

1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；3.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長沙 410006

類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis, RA）是一種以多關(guān)節(jié)滑膜炎癥增生、骨及軟骨破壞為主要特征的一類慢性自身免疫性疾病[1-2]。 該病久治不愈，致殘率極高，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[3-4]。 雖然多種抗風濕藥，如細胞因子拮抗劑、B 細胞耗竭藥和T細胞共刺激阻滯劑對治療RA 有一定臨床療效，但RA 患者的死亡率仍然高于普通人群[5]。 因此，探索新的有效和安全的治療RA 的方法非常重要。

羊躑躅（Rhododendron Molle G.Don）屬杜鵑花科杜鵑花屬藥用植物，在《滇藥錄》《畬醫(yī)藥》《瑤藥》等書中均有記載。 羊躑躅根提取物炮制后可去除毒性，廣泛應(yīng)用于RA 的臨床防治，有較好的治療效果[6]，同時還能消腫、祛風、止痛及治療風寒和濕氣[7]。目前，對羊躑躅及其有效活性成分抗RA 的藥理研究較多，主要集中在藥效學研究[8-10]等方面。 然而，羊躑躅治療RA 的具體作用機制尚未完全闡明。

本研究通過腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）誘導RA 細胞模型，探究羊躑躅含藥血清對TNF-α 處理的RA 成纖維樣滑膜細胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial, RAFLS)增殖和炎癥因子分泌的影響和機制，為羊躑躅的臨床應(yīng)用提供科學依據(jù)。

1 方法

1.1 動物及細胞

健康SPF 級SD 雄性大鼠30 只，4 周齡，體質(zhì)量（200±20） g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。 RA-FLS（批號：BS-C1162506）購自上海賓穗生物科技有限公司。

1.2 主要儀器

低速離心機（型號：SL02，上海知信實驗儀器技術(shù)有限公司）；Bio-Tek 酶標儀（型號：MB-530，深圳市匯松科技發(fā)展有限公司）；超凈工作臺（型號：YTCJ-2NB，北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司）；化學發(fā)光成像系統(tǒng)（型號：ChemiScope6100，上海勤翔科學儀器有限公司）。倒置生物顯微鏡（型號：DSZ2000X，北京中顯恒業(yè)儀器儀表有限公司）；培養(yǎng)箱（型號：DH-160I，上海三騰儀器有限公司）。

1.3 主要試劑

TNF-α（貨號：P5318，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；雷公藤多苷（純度98%，貨號：JKBw1779，上海經(jīng)科化學科技有限公司）；CCK-8（貨號：NU679，日本同仁化學研究所）；DMEM 培養(yǎng)基（貨號：D5796-500ML，美國Sigma 公司）；胎牛血清（貨號：10099141，美國Gibco 公司）；RIPA 裂解液（貨號：AWB0136，長沙艾碧維生物科技有限公司）；青霉素-鏈霉素溶液（貨號：SV30010，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；γ 干擾素（interferon-γ, IFN-γ）（貨號：RIF00）、白細胞介素-1β （interleukin-1β, IL-1β）（貨號：RLB00）、白細胞介素-6（interleukin-6, IL-6）（貨號：R6000B）、白細胞介素-17A（interleukin-17A, IL-17A）（貨號：DY8410-05）（美國R&D Systems 公司）；白細胞介素-2（interleukin-2, IL-2）（貨號：BMS634，美國賽默飛世爾科技公司）；p-c-JUN（貨號：ab32385）、p-p65（貨號：ab76302）、IL-6（貨號：ab259341）、c-JUN（貨號：ab40766）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR， 貨號：ab52894） 均購自英國Abcam 公司；p-AKT1（28731-1-AP）、AKT1（貨號：10176-2-AP）、p65（貨號：10745-1-AP）、β-actin（貨號：66009-1-Ig）（美國Proteintech 公司）；羊抗鼠IgG-HRP（貨號：SA00001-1）和羊抗兔IgG-HRP（貨號：SA00001-2）均購于美國Proteintech 公司。

1.4 羊躑躅提取物及含藥血清的制備

將羊躑躅根粉碎，與10 倍量的純水混合，將混合物回流提取2 h，重復3 次，合并提取液。 羊躑躅提取物經(jīng)洗脫、減壓濃縮后制得[8，11]。 羊躑躅水提取液大鼠用藥劑量為42.84 mg/kg，空白組給予等體積的生理鹽水，雷公藤多苷組給藥劑量為9.45 mg/kg。各組均采用灌胃給藥，每日1 次，連續(xù)給藥1 周。 末次給藥90 min 后腹主動脈采血，3 000 r/min 離心10 min 收集血清。所得血清于56 ℃下滅活30 min，過濾后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 細胞培養(yǎng)及分組處理

RA-FLS 在含有胎牛血清（10%）與青霉素-鏈霉素溶液（1%）的DMEM 中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件為5%CO2、37 ℃。 細胞貼壁后吸出培養(yǎng)液，分別加入5%、10%、20%、30%不同濃度的羊躑躅含藥血清進行干預(yù)，并用CCK-8 測定在48 h 時細胞的增殖活性。將細胞隨機分為7 組，即空白組（細胞正常培養(yǎng)）、模型組（細胞用10 ng/mL TNF-α 處理24 h[12-15]）、雷公藤多苷組（細胞用10 ng/mL TNF-α 和10%雷公藤多苷血清培養(yǎng)基處理24 h）、5%空白血清組（細胞用10 ng/mL TNF-α 和5%空白血清培養(yǎng)基處理24 h）、5%含藥血清組（細胞用10 ng/mL TNF-α 和5%羊躑躅含藥血清培養(yǎng)基處理24 h）、10%空白血清組（細胞用10 ng/mL TNF-α 和10%空白血清培養(yǎng)基處理24 h）、10%含藥血清組（細胞用10 ng/mL TNF-α 和10%羊躑躅含藥血清培養(yǎng)基處理24 h）。

1.6 CCK-8 法測定細胞增殖能力

將細胞接種于96 孔板內(nèi)，每孔1×104個細胞（100 μL），設(shè)3 個復孔。 用不同劑量的羊躑躅提取物干預(yù)細胞，處理48 h 后，加入CCK-8 溶液（10 μL/孔）。 采用Bio-Tek 酶標儀測定450 nm 處的光密度（optical density, OD）值，即吸光度值。

1.7 ELISA 測定細胞上清液中炎癥因子的含量

使用相應(yīng)試劑盒檢測細胞上清液中炎癥因子（IL-1β、IL-17A、IL-6、IL-2 和INF-γ）的含量。 板上固定相應(yīng)的一抗，將未結(jié)合的抗體洗去，然后將標準品、對照品或樣品加入每個孔中，混勻并密封，在室溫下孵育2 h。隨后，吸去每個孔的液體并用洗滌緩沖液清洗，向每個孔中加入120 μL 特異性二抗。 將未結(jié)合的二抗洗去后，向每個孔中加入100 μL辣根過氧化物酶底物溶液。 孔板在室溫下避光孵育30 min，之后加入終止液終止反應(yīng)。 然后使用Bio-Tek 酶標儀在30 min 內(nèi)測定各組樣品在450 nm 處的光密度值，并通過標準曲線計算樣品中目標蛋白的濃度。

1.8 Western blot 測定細胞中蛋白的相對表達水平

用RIPA 裂解液（含蛋白酶和磷酸酶抑制劑）對RA-FLS 進行裂解。收集蛋白質(zhì)，100 ℃沸水變性，通過10% SDS-PAGE 分離并轉(zhuǎn)移到NC 膜上，用PBST配制5%脫脂奶粉封閉NC 膜，1 h 后， 分別加入AKT1（1∶1 000）、p-AKT1（1∶3 000）、c-JUN（1∶3 000）、p-c-JUN（1∶5 000）、p65（1∶1 000）、p-p65（1∶1 000）、EGFR（1∶5 000）和β-actin（1∶5 000）一抗，4 ℃下孵育過夜。用PBST 洗滌3 次后，按上述一抗的種屬特異性加入二抗∶羊抗兔 IgG-HRP（1∶6 000）或羊抗鼠IgGHRP（1∶5 000），常溫下孵育1 h，PBST 沖洗3 次。隨后使用ECL 化學發(fā)光系統(tǒng)和放射自顯影，掃描和分析蛋白質(zhì)。 最后用Quantity one 專業(yè)灰度分析軟件分析曝光后條帶的灰度值。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 羊躑躅含藥血清對RA-FLS 增殖的影響

與未添加羊躑躅含藥血清的RA-FLS 相比，添加了5%和10%羊躑躅含藥血清的細胞增殖活性在48 h 內(nèi)無明顯變化（P＞0.05）。 然而當羊躑躅含藥血清濃度上升至20%和30%時，RA-FLS 增殖活性受到明顯抑制（P＜0.05）。 故本研究選擇5%和10%含藥血清進行后續(xù)實驗。 詳見圖1。

圖1 羊躑躅含藥血清對RA-FLS 增殖的影響

2.2 羊躑躅含藥血清抑制TNF-α 誘導的RA-FLS增殖

CCK-8 結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組的細胞增殖活性顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，雷公藤多苷組的細胞增殖活性明顯降低（P＜0.05），而5%和10%空白血清組無明顯變化（P＞0.05）。 與5%和10%空白血清組相比，5%和10%羊躑躅含藥血清組的細胞增殖活性顯著降低（P＜0.05）。另外，與雷公藤多苷組相比，10%羊躑躅含藥血清組的細胞增殖活性顯著降低（P＜0.05）。 詳見圖2。

圖2 羊躑躅含藥血清抑制TNF-α 誘導的RA-FLS增殖

2.3 羊躑躅含藥血清抑制TNF-α 誘導的RA-FLS中促炎因子的分泌

與空白組比較，模型組的IL-1β、IL-17A、IL-6、IL-2 和IFN-γ 水平均明顯升高（P＜0.05）。 與模型組相比，雷公藤多苷組的IL-1β、IL-17A、IL-6、IL-2 和IFN-γ 水平顯著下降（P＜0.05），而5%和10%空白血清組無明顯變化（P＞0.05）。 與5%和10%空白血清組相比，5%和10%羊躑躅含藥血清組的IL-1β、IL-17A、IL-6、IL-2 和IFN-γ 水平顯著降低（P＜0.05）。與雷公藤多苷組相比，10%羊躑躅含藥血清組的IL-1β、IL-17A、IL-6、IL-2 和IFN-γ 水平顯著降低（P＜0.05）。詳見圖3。

圖3 羊躑躅含藥血清抑制抑制TNF-α 誘導的RA-FLS 中促炎因子的分泌

2.4 羊躑躅含藥血清抑制TNF-α 誘導的RA-FLS中增殖和炎癥相關(guān)蛋白的表達

與空白組比較，模型組的EGFR 的表達及AKT1、c-JUN 和p65 的磷酸化水平均明顯增加（P＜0.05）。與模型組相比，雷公藤多苷組的EGFR 的表達及AKT1、c-JUN 和p65 的磷酸化水平均明顯下降（P＜0.05），而5%和10%空白血清組無明顯變化（P＞0.05）。 與5%和10%空白血清組相比，5%和10%羊躑躅含藥血清組的EGFR 的表達及AKT1、c-JUN 和p65 的磷酸化水平均顯著降低（P＜0.05）。 與雷公藤多苷組相比，10%羊躑躅含藥血清組的EGFR 的表達及AKT1、c-JUN 和p65 的磷酸化水平均明顯降低（P＜0.05）。詳見圖4。

圖4 躑躅含藥血清抑制TNF-α 誘導的RA-FLS 中增殖和炎癥相關(guān)蛋白的表達

3 討論

RA 是一種常見的全身性免疫介導的炎癥性疾病，其特征是關(guān)節(jié)疼痛、腫脹，并嚴重損害身體功能和生活質(zhì)量[1-2]。 活化的RA-FLS 表現(xiàn)出與腫瘤細胞相似的侵襲性特征，這是異常增生和關(guān)節(jié)破壞的主要觸發(fā)因素[16]。因此，能否有效控制RA-FLS 的增殖是治療RA 的關(guān)鍵。 目前，雷公藤多苷在RA 的治療中顯示出了顯著的臨床療效，并成為RA 相關(guān)研究中常用的陽性藥物[17]。 如研究：苗藥金烏健骨方對RA-FLS 細胞自噬以及IL-17/IL-17R 的影響[18-19]、自擬蠲痹補腎方含藥血清對RA-FLS 細胞增殖與凋亡的影響[20]，以及紅景天含藥血清對TNF-α 誘導的RA-FLS 增殖的影響[21]等，都將雷公藤多苷作為陽性藥物對照。

有研究表明，RA 的發(fā)病機制亦涉及各種細胞因子和細胞的復雜網(wǎng)絡(luò)，這些細胞因子和細胞會觸發(fā)滑膜細胞增殖并導致軟骨和骨的損傷[22]。其中，炎癥相關(guān)的細胞因子在RA 的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，如促炎因子IL-1β、IL-6 以及IFN-γ 分別通過影響破骨細胞的發(fā)育，刺激中性粒細胞遷移、破骨細胞成熟和血管內(nèi)皮生長因子刺激的血管翳增殖以及破壞軟骨和骨骼，促進RA 的發(fā)生[2,23-24]。 同時，有令人信服的證據(jù)支持EGFR、NF-κB、AKT 和JNK 信號通路也參與RA 的病理調(diào)節(jié)[12,25-28]。 具體來說，EGFR靶向的FLS、內(nèi)皮細胞和破骨細胞在RA 的發(fā)病機制中起主要作用[25]。 NF-κB 和JNK 是RA 等免疫性疾病的兩種關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，通過誘導炎癥介質(zhì)的表達，在炎癥調(diào)節(jié)中起著重要作用[26,29-30]。AKT 通路是NF-κB的上游分子，是參與RA 發(fā)病的重要細胞內(nèi)通路[12,27]。因此，抑制EGFR、NF-κB、AKT 和JNK 信號通路被認為是治療RA 的關(guān)鍵靶點和有效的治療策略。 據(jù)報道，使用厄洛替尼抑制EGFR 可改善膠原誘導的小鼠關(guān)節(jié)炎[25]。 此外，通過阻斷MH7A 細胞NFκB/AKT/JNK 信號通路，可以抑制TNF-α 刺激的炎癥反應(yīng)[28]。 同樣地，YANG 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，苯丙素化合物通過調(diào)節(jié)NF-κB/AKT/JNK 信號通路顯示出抗RA 的作用。

羊躑躅是一種常用的藥用植物，其根、葉、花和果實均可入藥，在民間醫(yī)學中常用于治療RA[6]。 有研究表明，羊躑躅中的二萜組分能顯著降低IL-6、IL-1β 和TNF-α 的水平，可明顯緩解RA 的癥狀，效果類似于雷公藤多苷[9]。 LUO 等[32]研究發(fā)現(xiàn)，羊躑躅提取物在體內(nèi)能抑制完全弗氏佐劑誘導的大鼠關(guān)節(jié)炎的后足腫脹，降低關(guān)節(jié)炎指數(shù)，在體外能顯著抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）和NO 的水平，從而起到抗RA 的作用。

本研究通過TNF-α 誘導RA 細胞模型，以雷公藤多苷作為陽性對照，探究了羊躑躅含藥血清對TNF-α誘導的RA-FLS 增殖及炎癥因子分泌的作用及機制。 本次體外實驗發(fā)現(xiàn)，相比于正常的RA-FLS，TNFα 處理的細胞的增殖活性和IL-1β、IL-17A、IL-6、IL-2 和IFN-γ 的水平、EGFR 的表達及AKT1、c-JUN 和p65 的磷酸化水平顯著升高。 而羊躑躅含藥血清能顯著降低TNF-α 誘導的RA-FLS 增殖活性和IL-1β、IL-17A、IL-6、IL-2 和IFN-γ 的水平。 此外，羊躑躅含藥血清還降低了RA-FLS 中EGFR 的表達及AKT1、c-JUN 和p65 的磷酸化水平。 綜上所述，羊躑躅含藥血清能抑制TNF-α 誘導的RA-FLS增殖及促炎因子的分泌，其機制可能與對EGFR、NFκB、AKT 和JNK 通路的調(diào)控有關(guān)。 本研究為后續(xù)從羊躑躅中開發(fā)出治療RA 的新藥提供了依據(jù)，未來將進行體內(nèi)實驗以進一步驗證羊躑躅提取物對RA的治療作用。