劉溪源，喻京生*

1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007

全球范圍內常見的一類高致盲眼病——葡萄膜炎，發(fā)病率為17/10 萬～52/10 萬，致盲率較高，發(fā)病率逐年上升[1]。 常見病因包括感染與非感染因素，其中，非感染因素包括自身免疫反應、創(chuàng)傷及理化、氧化損傷、炎癥因子釋放、遺傳因素等，臨床大多以自身免疫反應多見[2-5]。 葡萄膜炎的治則主要為散大瞳孔防止粘連、抗炎及消除致病因素，目前，臨床常采用中西醫(yī)結合療法防治葡萄膜炎，具有較好療效。中醫(yī)藥雖有確切療效，但對具體的治療機制缺乏詳細闡述。 本研究團隊的前期研究發(fā)現，祛風明目丸能夠通過多種途徑調節(jié)機體自身免疫機制，減輕實驗性自身免疫性葡萄膜炎（experimental autoimmune uveitis, EAU）大鼠的炎癥反應[6-9]；有研究證實，祛風明目丸治療EAU 大鼠是通過上調視網膜組織中Bcl-2 的表達，并抑制Bax、Caspase-3，調節(jié)細胞凋亡途徑而發(fā)揮療效[10]。 本研究擬通過觀察EAU 動物模型中房水及視網膜組織中NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3）、蛋白凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis related spot like protein, ASC）、白細胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）的動態(tài)變化情況，從細胞凋亡途徑，深入研究祛風明目丸治療EAU 的效果與機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 70 只純系健康雄性Lewis 大鼠（SPF 級），4～6 周齡，大鼠體質量180～220 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供[動物生產許可證號：SCXK（京）2021-0006]。 實驗開始前，對70只大鼠雙眼進行常規(guī)檢查以排除眼部病變及全身疾病，剔除患鼠，后進行為期1 周的喂養(yǎng)使其適應環(huán)境。 實驗室為SPF 級，實驗室環(huán)境保障：維持室溫（24±2） ℃、相對濕度50%～60%、通風情況良好。 所有大鼠均予以常規(guī)飼料及動物飲用水喂養(yǎng)。 本實驗研究方案及過程均嚴格遵守湖南省實驗動物管理辦法，并按相關倫理要求執(zhí)行（湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批號：ZYFY20211104-05）。

1.1.2 實驗藥物 祛風明目丸由熟地黃、當歸、川芎、柴胡、魚腥草、黃芩、菊花、防風、車前子、白芍、丹參構成，每瓶120 g，于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院（批號：20220304）購進。需要時用粉碎機將藥丸打粉，用蒸餾水溶散成質量分數為100 mg/mL 的懸濁液。

1.1.3 主要試劑 光感受器間維生素A 結合蛋白（interphotoreceptor retinoid-binding protein, IRBP 1177-1191)、結核菌素（tuberculin, TB）（上海生工生物工程股份有限公司，批號：P25801-22070401、24761）；完全弗氏佐劑（complete Freund's adjuvant, CFA）（美國Sigma 公司，批號：SLCJ4384）；PBS 緩沖液（普諾賽公司，批號：WH0021A061）；ASC 抗體、NLRP3 抗體、β-actin 抗體、羊抗兔IgG-HRP（Affinity 公司，批號：DF6034、DF7438、T0021、BL003A）；大鼠隱熱蛋白3（NLRP3）ELISA 檢測試劑盒、大鼠白細胞介素1β（IL-1β）ELISA 檢測試劑盒（廈門侖昌碩生物科技有限公司，批號：YD-34924、YD-30206）。

1.1.4 主要實驗儀器 酶標分析儀（美國Rayto 公司，型號：RaytoRT-6100）；電泳儀（北京百晶生物技術有限公司，型號：BG-subMIDI）；電熱恒溫水浴槽（上海一恒恒溫設備廠，型號：HWS-24）；PVDF 膜（美國Millipore 公司，型號：ISEQ00010）；低溫離心機（德國Sigma 公司，型號：3-30k）；脫色搖床（海門其林貝爾儀器制造公司，型號：TS-100）；凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP 公司，型號：GelDoc-It310）；化學發(fā)光成像系統(tǒng)（中國CLINX 勤翔，型號：chemiScope6100）；全自動洗板機（雷杜生命科技有限公司，型號：RT-3100C）；酶標檢測儀（Bio TeK，型號：Epoch）；臺式高速冷凍離心機（大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司，型號：D3024R）。

1.2 造模方法

1.2.1 試劑準備 根據造模需求，對IRBP1177-1191和TB 分別進行精確稱量：100 μg/只；將CFA（150 μL/只）和PBS 緩沖液(150 μL/只）準確地加入并充分混合到5 mL EP 管中，直至乳糜狀(滴入水中成團狀不散開）。

1.2.2 造模 根據隨機數字表法取19 只Lewis 大鼠為空白組，剩余51 只為造模組，參照文獻方法[11-13]：在造模組大鼠后腿內兩足底皮下注射混合好的乳糜液，每只100 μL，建立大鼠EAU 模型；空白組大鼠注射等量不含IRBP 的乳糜液于相同部位。連續(xù)4 d每天重復以上操作1 次，共對51 只大鼠進行動物模型制作。

1.2.3 模型驗證 每天同時段，使用便攜式手持裂隙燈，觀察各組大鼠眼部表現變化，當Lewis 大鼠出現睫狀血管充血明顯，角結膜水腫，前房滲出，虹膜血管擴張、紋理消失，對光反射遲鈍或消失、瞳孔粘連或膜閉等眼前節(jié)炎癥表現，則說明EAU 模型成功建立。 參照表1 Caspi 0～4 分的標準[13]，對大鼠眼前節(jié)表現進行炎癥評分。 造模后第7 天，從空白組和造模組大鼠中各隨機抽取3 只處死，取眼球組織制作病理切片，HE 染色后進行組織病理學檢查并進行炎癥評分。

1.3 實驗分組及干預

HE 染色后，依照隨機數字表法，將造模成功的48 只大鼠分為3 組：模型組、祛風明目丸正常劑量組（簡稱正常劑量組）和祛風明目丸低劑量組（簡稱低劑量組），每組16 只，未注射IRBP乳糜液的16 只為空白組。

于造模后第7 天開始灌胃。 將提純的藥物按照人-動物體表面積等效劑量比值表[14]計算得出的結果給藥。根據計算得出正常劑量組及低劑量組分別予以祛風明目丸藥液4、2 g/（kg·d）灌胃，使用大鼠專用灌胃針頭，連續(xù)14 d 灌胃給藥；另兩組均予以等容量蒸餾水，每天1 次灌胃處理。干預14 d 后，在顯微操作下取眼球、房水及視網膜組織，進行指標檢測。

1.4 觀察指標和方法

1.4.1 EAU 大鼠眼前節(jié)改變觀察 自造模開始后每天于同時段，采用Caspi 臨床分級評分標準，使用便攜式手持裂隙燈顯微鏡觀察各組大鼠的眼前節(jié)體征變化，進行評分并記錄。

1.4.2 組織病理學檢查 自造模后第7 天隨機抽取6 只大鼠處死（空白組和造模組大鼠中各3 只），腹腔注射麻醉后，靜待大鼠逃避等運動反射消失，將大鼠眼球摘除，放入1.5 mL 離心管中，浸泡于4%多聚甲醛中性緩沖液中固定24 h 后去除多余組織，脫水浸蠟，包埋，予以HE 染色。 顯微鏡下進行觀察并拍照，對病理切片進行組織病理學檢查。

1.4.3 ELISA 檢測房水中NLRP3、IL-1β 水平 給藥14 d 后，大鼠予以10%水合氯醛經腹腔麻醉，在手術顯微鏡下將針頭輕輕刺入前房，房水自動吸入毛細管中，收集房水于無菌EP 管中，立即轉移至-80 ℃超低溫冰箱冷凍保存。 參照ELISA 試劑盒說明書的要求，對獲得的房水標本，進行規(guī)范操作，利用酶標儀檢測各組大鼠房水中NLRP3、IL-1β 表達水平。

1.4.4 Western blot 檢測視網膜組織中ASC、NLRP3蛋白水平 大鼠取出房水后，隨即充分暴露大鼠眼球，將周圍結締組織分離后剪斷視神經，取出眼球。參考MCMENAMIN 的方法[15]，在顯微鏡下使用顯微剪沿角鞏膜緣剪開，并仔細分離其他組織。 將剝離的視網膜組織小心地放入1.5 mL 離心管中，并立即存放至-80 ℃冰箱。 檢驗時， 加入適量液氮與PBS后離心提取蛋白質，制備BCA 工作液，測定蛋白質濃度，加入相應體積的總蛋白樣品與5×蛋白質凝膠電泳上樣緩沖液混合， 進行SDS-PAGE 電泳，后在PVDF 膜上轉?。灰来渭尤胪每故驨LRP3（1∶500）、ASC（1∶500）、β-actin（1∶1 000）一抗4 ℃反應過夜孵育，洗膜后將羊抗兔IgG-HRP 二抗用1×TBST 稀釋1 500 倍，室溫、避光環(huán)境中緩慢搖動60 min 后洗膜，按1∶1（V/V）混合ECL 試劑盒中兩種液體后，均勻鋪在PVDF 膜表面4 min，隨后抖除膜上液體，放入化學發(fā)光成像系統(tǒng)中成像，對蛋白條帶行灰度分析，蛋白相對表達量用目的蛋白與β-actin 灰度值比值表示。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 EAU 大鼠眼前節(jié)變化

造模后連續(xù)使用手持裂隙燈觀察大鼠眼前節(jié)變化，造模第1 天：大鼠眼前節(jié)無明顯炎癥反應，眼部情況基本如圖1A；造模第3 天：觀察到炎癥反應，睫狀充血，虹膜血管輕度擴張，48 只大鼠如圖1B，2 只大鼠如圖1A，1 只出現圖1C；造模第5 天：觀察到葡萄膜炎反應，多數大鼠睫狀充血明顯，虹膜血管中度擴張、迂曲，部分出現前房輕度混濁，瞳孔欠圓，對光反射稍遲鈍，眼底紅光反射減弱，29 只大鼠如圖1C，22 只如圖1B；造模第7 天：多數體征同前，部分大鼠出現前房積膿、瞳孔膜閉，視網膜紅光反射減弱或消失，46 只大鼠如圖1C，4 只如圖1D。

圖1 造模后不同時間大鼠眼前節(jié)表現對比

自造模第3 天起，造模組評分均明顯高于空白組（P＜0.01），說明EAU 大鼠模型制備成功。 詳見表2。

表2 造模后不同時間Caspi 臨床分級評分比較（±s，分）

表2 造模后不同時間Caspi 臨床分級評分比較（±s，分）

注：與空白組相比，*P＜0.01。

組別空白組造模組n 19 51第3 天0.01±0.11 0.74±0.34*第5 天0.05±0.16 1.54±0.71*第7 天0.10±0.20 2.71±0.64*

2.2 組織病理學檢查

造模后第7 天，空白組可見視網膜各層組織結構清晰完整；造模組可見視網膜的視細胞層、雙極細胞層等有炎癥細胞的浸潤，血管擴張，且組織結構較空白組欠清晰。 詳見圖2。

造模第7 天，裂隙燈顯微鏡下觀察大鼠眼前節(jié)改變，可見大部分大鼠房水中度混濁，少數大鼠前房重度混濁，瞳孔膜閉，視網膜紅光反射消失。 炎癥評分為（2.71±0.64）分，HE 染色顯示，免疫后第7 天造模組大鼠視網膜多層出現不同程度的炎癥細胞浸潤。 以上表明，免疫后第7 天，EAU 大鼠模型建立成功。

2.3 祛風明目丸對房水中NLRP3、IL-1β 水平的影響

與空白組對比，模型組房水中NLRP3 及IL-1β水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，給藥14 d后，正常劑量組及低劑量組房水中NLRP3 與IL-1β含量均降低（P＜0.05）；正常劑量組與低劑量組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 詳見表3。

表3 各組大鼠給藥后14 d 房水中NLRP3、IL-1β水平比較（±s，ng/mL）

注：與空白組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。

組別空白組模型組正常劑量組低劑量組n 16 16 16 16 NLRP3 10.34±1.51 17.86±2.30*14.13±2.07#13.93±1.38#IL-1β 13.31±3.12 27.66±3.56*20.90±3.48#22.28±3.60#

2.4 祛風明目丸對視網膜組織中ASC、NLRP3 蛋白水平的影響

與空白組相比，模型組視網膜組織中ASC、NLRP3 蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，給藥14 d 后，正常劑量組及低劑量組視網膜組織中ASC、NLRP3 蛋白表達含量均下降（P＜0.05）；與正常劑量組相比，低劑量組視網膜組織ASC、NLRP3蛋白表達水平升高（P＜0.05）。 見表4、圖3。

圖3 祛風明目丸對視網膜中ASC、NLRP3 蛋白水平影響（±s，n=16）

表4 各組大鼠給藥后14 d 視網膜中ASC、NLRP3蛋白水平比較（±s）

表4 各組大鼠給藥后14 d 視網膜中ASC、NLRP3蛋白水平比較（±s）

注：與空白組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05；與正常劑量組相比，+P＜0.05

組別空白組模型組正常劑量組低劑量組n 16 16 16 16 ASC 0.32±0.02 0.68±0.02*0.53±0.01#0.61±0.01#+NLRP3 0.32±0.01 0.69±0.01*0.53±0.01#0.63±0.01#+

3 討論

葡萄膜炎在臨床上的治療較為棘手，近幾年針對葡萄膜炎的中西醫(yī)結合治療手段較多。 臨床研究表明，配合中醫(yī)治療能減輕治療藥物帶來的毒副作用，臨床療效良好，運用中醫(yī)藥辨證施治及多靶點整體調節(jié)的特點既能保證療效，又能降低疾病復發(fā)率[16-18]，但是具體的治療機制缺乏詳細闡述。 葡萄膜炎屬于中醫(yī)學“瞳神緊小”范疇，歷代醫(yī)家多將其發(fā)病歸于肝膽的風熱、濕熱[19]。祛風明目丸是喻京生教授根據“除風益損湯”加減所制的中成藥，臨床中多因風熱上擾，氣血受損導致本病，治以祛風清熱、養(yǎng)血活血，常用熟地黃、當歸、柴胡、菊花、防風、魚腥草等中藥。 葉天士言：“目盲無所見，在肝經之風也。”柴胡、當歸、菊花等藥物均入肝經，上連目系，肝氣通于目，柴胡退六經邪熱往來，與黃芩一升一降，防風治風通用、除上焦風邪，入肝，甘溫發(fā)散；配合菊花、魚腥草祛風清熱。 瞳神之處脈絡較多，虛火上炎損傷脈絡，故配伍熟地黃、當歸、白芍等藥養(yǎng)血活血?，F代藥理研究表明，柴胡、菊花、黃芩具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌作用，熟地黃、川芎、魚腥草此類中藥還具有雙向免疫調節(jié)功效[20-21]。

大部分EAU 與自身免疫性應答關系密切[22-23]，其發(fā)病與體內免疫系統(tǒng)的激活及多種細胞因子及信號通路的異常表達致細胞凋亡關系密切[24-26]。 活性氧（reactive oxygen species, ROS）的產生與清除平衡維持著機體正常的生理功能，且作為信號分子參與調節(jié)細胞內多種信號通路和免疫應答[27]。 ROSNLRP3 通路作為誘導和調節(jié)細胞凋亡的一條重要通路，當ROS 水平升高時，與硫氧還蛋白互作蛋白（thioredoxin interacting protein, TXNIP）發(fā)生反應，NLRP3炎癥小體被激活[28]。 在ROS 的誘導下，TXNIP 與核心蛋白NLRP3 結合，結合后可引起內皮細胞炎癥小體受激活化，再激活Toll 樣受體通道，引起一系列炎癥反應發(fā)生。

NLRP3 炎癥小體是一種多蛋白復合體，具有高度保守性，包括核心蛋白NLRP3、效應蛋白pro-Caspase-1 以及接頭蛋白ASC，是固有免疫系統(tǒng)的一大重要組成部分，屬于模式識別受體，IL-1β、IL-18 為其下游炎癥小體[29-30]。 核心蛋白NLRP3 響應微生物感染和細胞損傷后，介導Caspase-1 的激活及促炎因子IL-1β、IL-18 的分泌。有研究表明，免疫性葡萄膜炎（autoimmune uveith, AU）的發(fā)生發(fā)展與NL RP3 炎癥小體密不可分，部分AU 患者的外周靜脈血有NLRP3 的表達[31]。 另外，研究發(fā)現使小鼠體內的NLRP3 基因突變后，小鼠自身炎癥反應明顯減弱[32]。上述研究均證實，ROS-NLRP3 通路可引發(fā)一系列炎癥反應。

目前，公認的研究人類AU 發(fā)病機制及藥物治療的動物模型為使用視網膜蛋白IRBP 誘導Lewis大鼠EAU 模型[33]。 本實驗通過構建EAU 大鼠模型發(fā)現，造模第7 天，結合裂隙燈觀察到的大鼠眼部體征與眼球HE 染色結果，提示造模成功。模型組大鼠房水中IL-1β 與NLRP3、視網膜組織中NLRP3與ASC 的表達均較空白組大鼠增加，經祛風明目丸治療后，通過手持裂隙燈觀察大鼠眼前節(jié)炎癥變化，以及檢測房水和視網膜中ROS 通路相關蛋白的表達量，均證實祛風明目丸的治療發(fā)揮了一定療效。 本病的消退與IL-1β 及NLRP3 兩者的表達相關，通過影響IL-1β 及NLRP3 的平衡，使促炎因子與抑炎因子兩者之間的平衡失調。 與空白組相比，模型組NLRP3、ASC、IL-1β 表達增加（P＜0.05），正常劑量組與低劑量組同模型組相比，表達均減少（P＜0.05）。正常劑量組及低劑量組均可有效減輕EAU 大鼠葡萄膜炎的炎癥表現。

綜上，本研究結果顯示，祛風明目丸可通過多種途徑在EAU 的治療中發(fā)揮免疫調節(jié)作用。經祛風明目丸干預后，EAU 大鼠房水中NLRP3、IL-1β 水平及視網膜組織中ASC、NLRP3 蛋白水平降低，這表明祛風明目丸可能是通過下調ROS、ASC 的表達，抑制NLRP3 炎性小體的激活，然后抑制炎癥因子如IL-1β 的分泌，進而發(fā)揮治療葡萄膜炎的作用。但是本研究僅證實祛風明目丸對EAU 大鼠ROS 信號通路相關蛋白的影響，但ROS 信號通路相關蛋白復雜多樣，且實驗設計中未加入任何一種蛋白的有關抑制劑或激動劑，不能完全證實祛風明目丸是完全針對ROS 信號通路而發(fā)揮具體的作用，且ROS/NLRP3通路還涉及如細胞焦亡、線粒體自噬等多個機制，還需進行更深層次的研究，為本項目組開展進一步實驗提供思路。