楊 兵, 劉孟學, 趙春芳, 阮崇美, 許金根*

(1.安徽科技學院 動物科學學院,安徽 鳳陽 233100;2.動物營養(yǎng)調(diào)控與健康安徽省重點實驗室,安徽 鳳陽 233100)

天然抗性相關巨噬細胞蛋白1(Natural Resistance Associated Macrophage Protein 1,Nramp1),又稱溶質(zhì)載體轉(zhuǎn)運家族11成員1(Solute Carrier Family 11 Member 1,SLC11A1),是一種離子轉(zhuǎn)運蛋白,可抵抗多種胞內(nèi)病原菌的侵染而發(fā)揮免疫功能[1]。

豬Nramp1基因的cDNA序列已被克隆出來,編碼538個氨基酸,包含15個外顯子和14個內(nèi)含子[2-3]。作為免疫候選基因,目前已在中外多個豬品種中開展了Nramp1基因單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)研究。劉麗霞等[4]研究稱,除杜洛克豬外,大白豬、長白豬、八眉豬、蕨麻豬、煙臺黑豬Nramp1基因第2外顯子均存在2個SNPs。相德才等[5]檢測發(fā)現(xiàn),迪慶藏豬Nramp1基因第2內(nèi)含子和第2外顯子都具有多態(tài)性。張斌等[6]研究表明,滇陸豬第5外顯子至第6外顯子區(qū)域發(fā)現(xiàn)3個SNPs,且SNP2位點AA和AG型個體間的肝臟相對表達量存在顯著差異。此外,Nramp1與動物機體的抗病性有關,研究者開展了該基因多態(tài)性與豬免疫力指標、抗病性狀的關聯(lián)分析。Wu等[7]報道,大白豬Nramp1基因內(nèi)含子6不同基因型個體的單核細胞毒性百分率、中性粒細胞還原力存在顯著差異。趙生國等[8]表明,豬Nramp1基因外顯子2和內(nèi)含子6處的多態(tài)位點都顯著影響大白豬、長白豬和杜洛克仔豬腹瀉評分。Cho等[9]發(fā)現(xiàn),Nramp1基因多態(tài)位點(523G/A)顯著影響斷奶后仔豬的成活率。

目前,有關豬Nramp1基因的研究主要是對多態(tài)性及其抗病性狀的相關性研究。因此,本研究基于生物信息學分析了豬Nramp1基因及其編碼蛋白序列的結(jié)構特征,為該基因在豬抗病育種中的應用提供一定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗序列

在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫下載豬Nramp1基因mRNA序列(NM_213821),以及豬(NP_998986)、人(NP_000569)、小鼠(NP_038640)、普通牛(NP_777077)、水牛(XP_006046464)、綿羊(AAC28241)、山羊(NP_001272623.1)的Nramp1蛋白序列。

1.2 試驗方法

用ExPASy數(shù)據(jù)庫分析豬Nramp1蛋白的理化性質(zhì)、親水性;用SOPMA軟件分析蛋白的二級結(jié)構;用CBS數(shù)據(jù)庫預測蛋白的信號肽、跨膜結(jié)構、磷酸化位點、N-糖基化位點;用STRING軟件分析蛋白互作網(wǎng)絡;用DNAStar軟件分析蛋白序列的同源性。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬Nramp1基因編碼區(qū)序列分析

NCBI收錄的豬Nramp1基因的編碼區(qū)長為1 617 bp,堿基組成見表1,其中G-C含量(58.50%)高于A-T含量(41.50%)。

表1 豬Nramp1基因編碼區(qū)的堿基組成

2.2 豬Nramp1蛋白的理化性質(zhì)分析

經(jīng)ProtParam預測,豬Nramp1蛋白的分子量為58 829.22 u,等電點為8.01,不穩(wěn)定系數(shù)為44.76,平均親水系數(shù)為0.605。豬Nramp1蛋白的氨基酸組成見圖1,其中亮氨酸數(shù)(85個)最多,色氨酸數(shù)(8個)最少。

圖1 豬Nramp1蛋白的氨基酸組成Fig.1 The amino acid composition of pig Nramp1 protein

經(jīng)ProtScale預測(Kyte&Doolittle法),豬Nramp1蛋白含有的疏水性氨基酸殘基較多,這與ProtParam預測結(jié)果一致,其中第499位的值最大,為3.056,而第268位的值最小,為-2.778(圖2)。

圖2 豬Nramp1蛋白親疏水性預測Fig.2 Prediction of the hydrophilicity and hydrophobicity of pig Nramp1 protein

2.3 豬Nramp1蛋白的信號肽和跨膜區(qū)分析

經(jīng)SignalP 6.0軟件預測,豬Nramp1蛋白不存在信號肽(概率為0.999 9,圖3)。

圖3 豬Nramp1蛋白信號肽預測Fig.3 Prediction of the signal peptide of pig Nramp1 protein

經(jīng)DeepTMHMM軟件預測,豬Nramp1含有12個跨膜區(qū),分別位于62～75、89～104、134～157、165～185、192～213、238～256、281～304、358～378、405～415、427～444、464～484和492～513處(圖4)。

圖4 豬Nramp1蛋白跨膜結(jié)構預測Fig.4 Prediction of the transmembrane structure of pig Nramp1 protein

2.4 豬Nramp1蛋白的二級結(jié)構

經(jīng)SOPMA軟件預測,豬Nramp1蛋白的二級結(jié)構含有α螺旋、無規(guī)卷曲、延伸鏈和β轉(zhuǎn)角(圖5),分別占55.58%(299個)、26.95%(145個)、14.13%(76個)和3.35%(18個)。

圖5 豬Nramp1蛋白二級結(jié)構預測Fig.5 Prediction of the secondary structure of pig Nramp1 protein注:h為α螺旋;e為延伸鏈;t為β轉(zhuǎn)角;c為無規(guī)卷曲。

2.5 豬Nramp1蛋白磷酸化和N-糖基化位點分析

經(jīng)NetPhos 3.1軟件預測,豬Nramp1蛋白有40個潛在的磷酸化位點(預測值>0.5,圖6),包括24個絲氨酸位點(第11、17、19、20、21、23、37、51、66、145、229、258、263、323、371、393、403、423、433、458、467、468、483和527位)、12個蘇氨酸位點(第13、34、59、114、132、153、206、269、375、377、401和514位)和4個酪氨酸位點(第15、69、183和209位)。

圖6 豬Nramp1蛋白磷酸化位點預測Fig.6 Prediction of phosphorylation sites of pig Nramp1 protein

經(jīng)NetNGlyc 1.0軟件預測,豬Nramp1蛋白有2個N-糖基化位點,位于第321和335處(預測值>0.5,圖7)。

圖7 豬Nramp1蛋白N-糖基化位點預測Fig.7 Prediction of N-glycosylation sites of pig Nramp1 protein

2.6 豬Nramp1蛋白互作網(wǎng)絡分析

經(jīng)STRING軟件預測,與豬Nramp1(即SLC11A1)互作的蛋白有TLR4、SLC39A14、ATP7A等(可信度>0.4,圖8)。

圖8 豬Nramp1蛋白互作網(wǎng)絡分析Fig.8 Interaction network analysis of pig Nramp1 protein

2.7 Nramp1蛋白序列的同源性分析

經(jīng)MegAlign(Clustal W法)分析,豬Nramp1蛋白序列與水牛、普通牛、山羊、人、小鼠、綿羊的同源性分別為87.2%、88.1%、87.7%、86.8%、84.4%和88.5%(圖9)。

圖9 豬Nramp1蛋白序列同源性分析Fig.9 Homology analysis of pig Nramp1 protein sequences

3 結(jié)論與討論

疾病威脅畜禽的健康且阻礙畜牧業(yè)的發(fā)展,抗病育種研究是解決此問題的一條途徑。研究發(fā)現(xiàn),大腸桿菌刺激豬腸上皮細胞后,Nramp1基因的表達量顯著上升[10],表明Nramp1基因與豬的抗病性相關?；诠驳姆肿由飳W數(shù)據(jù)庫和生物信息學分析,為預測畜禽基因及其編碼蛋白的功能提供基礎[11-12]。

本研究對NCBI公布的序列(NM_213821)進行分析,豬Nramp1基因編碼區(qū)長為1 617 bp,G-C含量(58.50%)高于A-T含量(41.50%)。豬Nramp1蛋白的相對分子量為58 829.22 u,等電點為8.01,為不穩(wěn)定(不穩(wěn)定系數(shù)44.76>40)的疏水性蛋白(平均親水系數(shù)0.605>0)。豬Nramp1蛋白由538個氨基酸殘基組成,其中亮氨酸數(shù)量(85個)最多,而色氨酸數(shù)量(8個)最少。

本試驗預測發(fā)現(xiàn),豬Nramp1蛋白沒有信號肽結(jié)構,二級結(jié)構主要由α螺旋和無規(guī)卷曲構成,這與荷斯坦牛Nramp1蛋白的信號肽、二級結(jié)構預測結(jié)果相似[13];而豬Nramp1蛋白預測含有12個跨膜區(qū),這與綿羊Nramp1蛋白的跨膜數(shù)一致[14]。另外,本研究預測豬Nramp1蛋白有40個磷酸化位點(包括24個絲氨酸、12個蘇氨酸和4個酪氨酸位點)以及2個N-糖基化位點,表明這些氨基酸殘基是豬Nramp1蛋白翻譯后潛在的修飾位點。預測顯示,與豬Nramp1互作的蛋白有TLR4等蛋白。TLR4是調(diào)控仔豬腹瀉的抗病基因[15],這也間接反映Nramp1在豬免疫應答中發(fā)揮作用。

7個哺乳動物Nramp1蛋白的序列分析表明,豬與人、小鼠、普通牛、水牛、山羊、綿羊Nramp1蛋白序列的同源性均大于80%,提示Nramp1蛋白的保守性較高。當前對豬Nramp1蛋白的結(jié)構和功能研究較少,鑒于Nramp1蛋白在物種進化中具有保守性,可參考人、小鼠等動物Nramp1蛋白的功能研究。

綜上,豬Nramp1預測為不穩(wěn)定的疏水性蛋白,無信號肽,但存在12個跨膜區(qū),含有40個磷酸化和2個N-糖基化位點,其蛋白序列在物種間保守性較高,試驗結(jié)果為進一步研究豬Nramp1基因的功能積累基礎資料。