李文超, 李加佳, 陳東錢, 李創(chuàng)偉,程啟航, 馬明宣, 羅昕雨, 李喬喬

(1.安徽科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,安徽 鳳陽 233100;2.動(dòng)物營養(yǎng)調(diào)控與健康安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 鳳陽 233100)

兔球蟲病是由多種艾美耳球蟲寄生于兔肝臟或腸道引起的一種常見多發(fā)的原蟲病,嚴(yán)重威脅養(yǎng)兔業(yè)的健康發(fā)展[1]。傳統(tǒng)上,球蟲蟲種的鑒定主要基于卵囊形態(tài)、寄生部位及病變特征等,但不同的蟲種在上述指標(biāo)有重疊,導(dǎo)致這些方法特異性差,費(fèi)時(shí)費(fèi)力等,因此早期兔球蟲的命名較為混亂,至少有25個(gè)種被描述及命名。最近,依據(jù)多種能精確鑒定不同兔球蟲蟲種的的分子檢測(cè)方法,已有15種兔球蟲蟲種被確定為有效種[1-5]。

大量現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查顯示,兔球蟲感染率高達(dá)100%,混合感染非常普遍[1,6]。國內(nèi)多個(gè)省份也有兔球蟲病流行情況的相關(guān)報(bào)道,但相關(guān)研究多采用傳統(tǒng)方法進(jìn)行蟲種鑒別[7-10]。采用分子方法對(duì)兔球蟲進(jìn)行調(diào)查的研究不多,目前僅見四川省和甘肅省有相關(guān)報(bào)道[11-12]。近年來,安徽省兔養(yǎng)殖量越來越大,但迄今僅見肥西縣有兔球蟲感染的相關(guān)報(bào)道,其余地區(qū)尚未報(bào)道,這對(duì)安徽省兔球蟲病的防控非常不利[13]。鑒于此,本研究擬對(duì)安徽省多個(gè)地區(qū)規(guī)模兔場(chǎng)球蟲感染情況進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查,以期為安徽省兔球蟲病防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2020年6—9月,分別從亳州市利辛縣、蚌埠市懷遠(yuǎn)縣、六安市裕安區(qū)、黃山市歙縣、淮南市鳳臺(tái)縣和安慶市宿松縣等地區(qū)的6個(gè)規(guī)模兔場(chǎng),收集新鮮兔糞樣418份,分別裝進(jìn)潔凈自封袋中,編號(hào)、標(biāo)明采集地等信息后,置于4 ℃冰箱待檢。上述兔場(chǎng)均飼喂添加抗球蟲藥物的商品全價(jià)料,且從未使用過任何兔球蟲疫苗產(chǎn)品。

1.2 主要儀器和試劑

T100型梯度PCR儀(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司);Tan2500R凝膠圖像處理系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);糞便基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)。

1.3 基因組DNA的提取

按照試劑盒說明書提取糞便基因組DNA,所提取的DNA于-20 ℃保存,用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。

1.4 PCR擴(kuò)增

11種艾美耳球蟲ITS1基因的引物參照Oliveira等[2]的方法進(jìn)行(表1),委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PCR引物及條件

2輪PCR反應(yīng)體系體積均為25 μL,含0.25 μL 5 U/μL rTaq酶,2 μL 1.25 mmo/L dNTP,2.5 μL 10×PCR緩沖液,各0.3 μL 20 mol/L上、下游引物,1 μL模板,18.65 μL雙蒸水。2輪PCR反應(yīng)參數(shù)一致,均為94 ℃預(yù)變性 2 min;94 ℃變性60 s,56 ℃退火 60 s,72 ℃ 延伸60 s,共35個(gè)循環(huán);最后72 ℃ 延伸10 min。

1.5 測(cè)序及分析

每種球蟲隨機(jī)選取2個(gè)陽性PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。所得序列經(jīng)Dnaman 9.0軟件比對(duì)和加工,在GenBank中進(jìn)行Blast搜索,驗(yàn)證其是否為相應(yīng)兔艾美耳球蟲ITS1序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 兔球蟲ITS1基因擴(kuò)增及序列分析

418份樣本共擴(kuò)增出19份中型艾美耳球蟲(Eimeriamedia,E.media)、3份盲腸艾美耳球蟲(Eimeriacoecicola,E.coecicola)、16份大型艾美耳球蟲(Eimeriamagna,E.magna)、12份腸艾美耳球蟲(Eimeriaintestinalis,E.intestinalis)、2份小型艾美耳球蟲(Eimeriaexigua,E.exigua)、18份穿孔艾美耳球蟲(Eimeriaperforans,E.perforans)、14份維氏艾美耳球蟲(Eimeriavejdovskyi,E.vejdovskyi)和15份斯氏艾美耳球蟲(Eimeriastiedai,E.stiedai)陽性樣本,擴(kuò)增產(chǎn)物大小均符合預(yù)期(圖1,僅顯示E.intestinalis和E.media部分PCR擴(kuò)增結(jié)果)。每種球蟲隨機(jī)選取2個(gè)陽性PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,序列經(jīng)加工后進(jìn)行Blast分析,均顯示為相應(yīng)兔球蟲ITS1基因。

圖1 部分兔球蟲ITS1基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Partial PCR amplication of ITS1 gene in Eimeria spp. in rabbits注:M為DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000;1～4為部分樣本;A為E. intestinalis;B為E. media。

2.2 安徽省兔球蟲感染情況

本調(diào)查顯示,418份樣本中共檢測(cè)出99份兔艾美耳球蟲陽性樣品,感染率為23.98%,且本調(diào)查的所有兔場(chǎng)均有球蟲感染,場(chǎng)感染率為100%,不同兔場(chǎng)球蟲感染率在8.20%～41.27%。共檢出8種兔球蟲蟲種,其中E.media感染率最高(4.55%),E.exigua感染率最低(僅0.48%),未檢出黃艾美耳球蟲(Eimeriaflauescens,E.flauescens)、無殘艾美耳球蟲(Eimeriairresidua,E.irresidua)和梨形艾美耳球蟲(Eimeriapiriformis,E.piriformis)。其中,歙縣兔場(chǎng)檢出6種球蟲,宿松縣、利辛縣和裕安區(qū)兔場(chǎng)各檢出5種球蟲,鳳臺(tái)兔場(chǎng)檢出4種球蟲,懷遠(yuǎn)兔場(chǎng)檢出3種球蟲。E.media、E.magna和E.vejdovskyi在5個(gè)兔場(chǎng)均有檢出,E.perforans在4個(gè)兔場(chǎng)均有檢出,E.stiedai和E.intestinalis在3個(gè)兔場(chǎng)均有檢出,E.coecicola和E.exigua在2個(gè)兔場(chǎng)均有檢出(表2)?；旌细腥据^為普遍,以二重感染和三重感染為主。

表2 安徽省兔艾美耳球蟲感染情況

3 結(jié)論與討論

兔球蟲病是嚴(yán)重危害家兔的腸道原蟲病之一,1～4月齡的幼兔感染率為100.00%,死亡率高達(dá)60.00%～90.00%,嚴(yán)重危害養(yǎng)兔業(yè)的健康發(fā)展[1]。目前,兔球蟲病尚無疫苗可用,主要依靠抗球蟲藥物治療以及加強(qiáng)衛(wèi)生管理等措施進(jìn)行預(yù)防。因此,定期對(duì)兔球蟲感染情況進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查,是生產(chǎn)中做好兔球蟲病防控的前提和基礎(chǔ)。本研究利用兔艾美耳球蟲ITS1基因特異的巢式PCR方法對(duì)安徽省部分地區(qū)兔場(chǎng)11種球蟲感染情況進(jìn)行調(diào)查,可為安徽省兔球蟲病防控提供參考。

本研究中,安徽省部分地區(qū)兔場(chǎng)艾美耳球蟲感染率為23.98%,這一結(jié)果低于用傳統(tǒng)方法調(diào)查所得的四川省(56.40%)、河南省(64.11%)、新疆維吾爾自治區(qū)(100.00%)和安徽省肥西縣(100.00%)兔球蟲的流行率,同時(shí)也低于用分子方法調(diào)查所得的甘肅省(50.00%)和四川省(71.11%)兔球蟲的流行率[10-15]。研究顯示球蟲感染情況與采樣地區(qū)、采樣季節(jié),養(yǎng)殖方式以及兔子的品種、年齡等多種因素相關(guān),本次調(diào)查感染率較低可能與本次調(diào)查的均為規(guī)模較大的養(yǎng)兔場(chǎng)、飼養(yǎng)管理較為規(guī)范、平時(shí)注重球蟲病的預(yù)防有關(guān)[12,15]。此外,盡管本調(diào)查的6個(gè)兔場(chǎng)飼養(yǎng)管理均較好,且都飼喂添加抗球蟲藥物的商品全價(jià)料,但所有兔場(chǎng)均檢出有球蟲感染,顯示上述兔場(chǎng)可能存在較為廣泛的耐藥球蟲蟲株,用常規(guī)添加抗球蟲藥物劑量的飼料并不能完全控制球蟲在兔群中的流行。

多個(gè)研究顯示,國內(nèi)不同地區(qū)流行的兔球蟲優(yōu)勢(shì)蟲種不同,如甘肅省兔艾美耳球蟲的優(yōu)勢(shì)蟲種為大型艾美耳球蟲、維氏艾美耳球蟲和穿孔艾美耳球蟲,四川省規(guī)模兔場(chǎng)感染的球蟲優(yōu)勢(shì)種為巨型艾美耳球蟲、中型艾美耳球蟲和黃艾美耳球蟲等[11-12]。本調(diào)查發(fā)現(xiàn),安徽省兔場(chǎng)中共檢出8種球蟲蟲種,其中中型艾美耳球蟲(4.55%)、穿孔艾美耳球蟲(4.31%)、大型艾美耳球蟲(3.83%)、斯氏艾美耳球蟲(3.59%)、維氏艾美耳球蟲(3.35%)的檢出率相對(duì)較高,提示養(yǎng)殖場(chǎng)要注意這些蟲種的防控。此外,本調(diào)查未檢出黃艾美耳球蟲、無殘艾美耳球蟲和梨形艾美耳球蟲,與甘肅省的報(bào)道類似,但報(bào)道顯示黃艾美耳球蟲是四川省兔場(chǎng)流行的優(yōu)勢(shì)蟲種之一,且無殘艾美耳球蟲在該省兔場(chǎng)流行率也高達(dá)60.00%,這些差異可能與不同地區(qū)的地理環(huán)境、氣候、養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)管理等有一定關(guān)系,尚需要做進(jìn)一步研究[11-12]。

綜上,本研究顯示安徽省多地兔場(chǎng)球蟲感染較為普遍,且檢出8種球蟲蟲種,提示上述兔場(chǎng)要高度重視兔球蟲的防控。