何曉其

1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053；2. 杭州市第九人民醫(yī)院，浙江 杭州 311225

多發(fā)性骨髓瘤可造成骨髓造血衰竭、骨破壞、器官組織損傷等[1]，目前臨床對(duì)多發(fā)性骨髓瘤尚無有效治療方案。雷公藤紅素是衛(wèi)矛科植物雷公藤和南蛇藤的主要活性成分，具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗病原微生物、抗腫瘤等藥理學(xué)活性[2]。有研究顯示，雷公藤紅素對(duì)肝癌、乳腺癌、前列腺癌、膠質(zhì)瘤等具有廣譜的藥理學(xué)活性，其作用機(jī)制在于上調(diào)人骨肉瘤U-2OS 細(xì)胞中促凋亡蛋白Bcl-2 關(guān)聯(lián)X蛋白和細(xì)胞色素C 的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3]。H929細(xì)胞系由骨髓瘤患者的惡性積液建立，主要用于人骨髓瘤疾病研究。本研究觀察雷公藤紅素誘導(dǎo)人多發(fā)性骨髓瘤H929 細(xì)胞凋亡的效果，并參考饒俊珍等[4]研究結(jié)果確定雷公藤紅素濃度，分析其分子作用機(jī)制，報(bào)道如下。

1 研究材料

人多發(fā)性骨髓瘤H929 細(xì)胞株購自中國質(zhì)粒載體菌株細(xì)胞株基因保藏中心；雷公藤紅素購于南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，純度為99.2%；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清等均購于美國Gibco 公司；青鏈霉素雙抗購自武漢尚恩生物技術(shù)有限公司；二甲亞砜（DMSO）溶液購自北京索萊寶科技有限公司；CCK-8 試劑盒購于和元生物技術(shù)（上海）股份有限公司；Annexin V-PE/7-AAD 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒及流式細(xì)胞儀購自美國BD 公司；兔抗人P53 蛋白、剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved caspase-3）抗體、剪切型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1（cleaved PARP-1）抗體和羊抗兔熱根辣氧化物酶標(biāo)記的二抗購于美國Abcam 公司；RIPA 緩沖液購于翌圣生物科技（上海）股份有限公司；SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳購于常州伯儀生物科技有限公司；硝酸纖維素購于上海閃晶分子生物科技有限公司。

2 研究方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)H929 細(xì)胞采用DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)，其中含10%胎牛血清，使用濃度為100 U/mL 的青鏈霉素雙抗，細(xì)胞在37 ℃、5%二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期，去除舊的培養(yǎng)液，使用磷酸鹽緩沖液沖洗，加入1 mL胰蛋白酶消化，至細(xì)胞間隙增大、形態(tài)變圓時(shí)，馬上脫離M 底分裝，再在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞活力抑制情況檢測(cè)培養(yǎng)48 h 后細(xì)胞長滿瓶壁，此時(shí)細(xì)胞雖有活力但不再分裂，判定為細(xì)胞處于平臺(tái)期。取培養(yǎng)48 h 后的H929 細(xì)胞，用10%胎牛血清RPMI-1640 培養(yǎng)液懸浮，細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度至1.0×109/L，接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分為對(duì)照組、雷公藤紅素組（0.5 mg/L、1.0 mg/L 和5.0 mg/L）。各濃度雷公藤紅素組分別加入對(duì)應(yīng)濃度的雷公藤紅素，對(duì)照組加入等體積DMSO 溶液。加入CCK-8 后在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，測(cè)定A450。細(xì)胞活力抑制率=（1-雷公藤紅素組A450/對(duì)照組A450）×100%。

2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)取上述培養(yǎng)48 h 后的H929 細(xì)胞，保持每孔細(xì)胞密度＞1.0×109/L，使用胰酶消化后離心，丟棄上清液，將H929 細(xì)胞密度調(diào)整為1.0×109/L。吸取200 μL 細(xì)胞懸液，加入5 μL 的Annexin V-PE 和10 μL 的7-ADD，于室溫下避光孵育15 min，再加入300 μL 預(yù)冷Binding buffer 混勻。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每種處理重復(fù)6 次，取平均值。

2.4 Western Blotting取上述培養(yǎng)48 h 后的H929細(xì)胞，離心機(jī)恒溫4 ℃處理10 min，用含蛋白酶抑制劑的RIPA 緩沖液懸浮沉淀細(xì)胞，用BCA 試劑盒測(cè)定懸液中蛋白質(zhì)含量。以SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳分離蛋白，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。以凝膠成像儀分析蛋白條帶灰度，以GAPDH 蛋白灰度值作為參照，觀察各組P53、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1、bax、bcl-2 表達(dá)情況。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間對(duì)比采用F檢驗(yàn)，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 研究結(jié)果

3.1 不同濃度雷公藤紅素組H929 細(xì)胞活力抑制率比較見表1。H929 細(xì)胞活力抑制率隨著雷公藤紅素處理濃度升高而升高，不同濃度雷公藤紅素組H929 細(xì)胞活力抑制率兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 不同濃度雷公藤紅素組H929 細(xì)胞活力抑制率比較（）%

表1 不同濃度雷公藤紅素組H929 細(xì)胞活力抑制率比較（）%

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3.2 各組H929 細(xì)胞凋亡率比較見表2 及圖1。與對(duì)照組比較，不同濃度雷公藤紅素組H929 細(xì)胞凋亡率均較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。H929細(xì)胞凋亡率隨著雷公藤紅素處理濃度增加而增加，不同濃度雷公藤紅素組H929 細(xì)胞凋亡率兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 各組H929 細(xì)胞凋亡率

表2 各組H929 細(xì)胞凋亡率比較（）%

表2 各組H929 細(xì)胞凋亡率比較（）%

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3.3 各組H929 細(xì)胞培養(yǎng)物中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較見表3 及圖2。與對(duì)照組比較，不同濃度雷公藤紅素組H929 細(xì)胞培養(yǎng)物中P53、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1、bax 表達(dá)水平均較高，bcl-2 表達(dá)水平均較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。H929 細(xì)胞培養(yǎng)物中P53、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1、bax 表達(dá)水平隨著雷公藤紅素處理濃度升高而升高，bcl-2 表達(dá)水平隨著雷公藤紅素處理濃度升高而降低，不同濃度雷公藤紅素組H929 細(xì)胞培養(yǎng)物中P53、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1、bax、bcl-2 表達(dá)水平兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 各組H929 細(xì)胞培養(yǎng)物中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)WB 圖

表3 各組H929 細(xì)胞培養(yǎng)物中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（）

表3 各組H929 細(xì)胞培養(yǎng)物中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（）

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4 討論

有研究表明，腫瘤細(xì)胞過度增殖、凋亡抑制、骨髓微環(huán)境改變?cè)诙喟l(fā)性骨髓瘤發(fā)生、進(jìn)展中具有重要作用[5-6]。目前臨床治療多發(fā)性骨髓瘤以細(xì)胞移植、免疫調(diào)節(jié)劑、蛋白酶體抑制劑為主，但由于患者通常年齡偏大，且多合并腎功能損害、免疫功能低下、感染、骨質(zhì)破壞等，耐受度均不高，療效受限。細(xì)胞凋亡的過程非常復(fù)雜，P53、caspase-3、PARP-1、bcl-2、bax 均在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮一定作用。本研究應(yīng)用CCK-8 法和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)分析雷公藤紅素對(duì)H929 細(xì)胞是否具有生長抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用，并檢測(cè)各組H929 細(xì)胞培養(yǎng)物中P53、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1、bcl-2、bax 表達(dá)水平，目的在于探究雷公藤紅素對(duì)H929 細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，以及該機(jī)制是否與P53、caspase-3、PARP-1、bcl-2、bax 之間存在聯(lián)系。

細(xì)胞凋亡是常見的細(xì)胞生物學(xué)特征，又被稱為Ⅰ型程序性細(xì)胞死亡。有研究顯示，雷公藤紅素能夠通過蛋白酶體途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[7]。本研究結(jié)果顯示，隨著雷公藤紅素處理濃度增加，多發(fā)性骨髓瘤H929 細(xì)胞活力抑制率明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯增加。顧恪波等[8]研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素能夠抑制MCL1 mRNA 轉(zhuǎn)錄，并通過泛素-蛋白酶體途徑快速降解MCL1 蛋白，進(jìn)而激活線粒體凋亡途徑，引起細(xì)胞生長抑制和凋亡。結(jié)合本研究結(jié)果表明，雷公藤紅素對(duì)多發(fā)性骨髓瘤H929 細(xì)胞具有生長抑制和凋亡誘導(dǎo)作用。

PARP-1 能夠通過調(diào)節(jié)能量代謝影響細(xì)胞生存，并和腫瘤細(xì)胞獲得性耐藥的發(fā)生有密切關(guān)系。李金霞等[9]研究認(rèn)為，PARP-1 參與乳腺癌細(xì)胞耐藥形成，沉默PARP-1 能夠提高乳腺癌細(xì)胞化療敏感性，關(guān)閉腫瘤細(xì)胞線粒體凋亡信號(hào)通路。caspase-3是細(xì)胞胞外凋亡途徑中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行蛋白，而PARP-1 是caspase-3 的切割底物，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[10]。本研究結(jié)果顯示，不同濃度雷公藤紅素組H929 細(xì)胞培養(yǎng)物中P53、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1、bax 表達(dá)水平均高于對(duì)照組，bcl-2 表達(dá)水平均低于對(duì)照組（P＜0.05）。隨著雷公藤紅素處理水平增加，P53、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1、bax 表達(dá)水平均上升，bcl-2 表達(dá)水平均下降。提示P53、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1、bax、bcl-2 與細(xì)胞凋亡之間存在一定聯(lián)系。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激后，bax/bak 形成低聚物復(fù)合體，插入到線粒體外膜孔隙，導(dǎo)致線粒體滲透壓改變，跨膜電位丟失，促使凋亡復(fù)合體形成，活化caspase-9 前體，進(jìn)而激活caspase-3 和caspase-7，引發(fā)caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡。誘導(dǎo)凋亡蛋白的大量表達(dá)，也可引起bcl-2 表達(dá)下降，導(dǎo)致bax 從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體，啟動(dòng)線粒體凋亡通路?？梢姡坠偌t素促進(jìn)H929 細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制可能與誘導(dǎo)線粒體凋亡途徑有關(guān)。

綜上，雷公藤紅素對(duì)人多發(fā)性骨髓瘤H929 細(xì)胞具有活力抑制和凋亡誘導(dǎo)作用，且有一定劑量效應(yīng)，為多發(fā)性骨髓瘤的臨床治療提供了理論基礎(chǔ)。