尹 娜,沈珠甫,陳麗娟,康 丹,陳艷萍

(解放軍聯(lián)勤保障部隊第九二〇醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科,云南 昆明 650032)

細(xì)胞凋亡,又稱程序性死亡,是有核細(xì)胞在相關(guān)誘導(dǎo)因素作用下通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑啟動胞內(nèi)的一種死亡機制,是生物體的一種自穩(wěn)機制[1],細(xì)胞凋亡最早由Kerr在1972年提出。細(xì)胞凋亡廣泛存在于心腦血管疾病、糖尿病、腎病、各種腫瘤等病理變化中[2-4]。血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)作為是機體的主要調(diào)節(jié)因子之一,發(fā)揮多種生物功能,如促進(jìn)血管平滑肌收縮、刺激醛固酮分泌、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡等[5],而內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)是許多心腦血管疾病發(fā)病的基礎(chǔ),與多種心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展密切關(guān)聯(lián),故研究Ang Ⅱ誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的調(diào)控機制有著重要的臨床意義,現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

參照Madan等[6]方法分離人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,用含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在 37℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。神經(jīng)酰胺(ceramide)購自某公司,用無水乙醇配制成50mmol/L儲備液-20℃保存。給藥時無水乙醇在細(xì)胞培養(yǎng)液中的體積分?jǐn)?shù)≤0.1%,胎牛血清購自某公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 流式細(xì)胞儀檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

將血管內(nèi)皮細(xì)胞按1×104/mL接種于6孔培養(yǎng)板,在培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁后,對照組不加入Ang Ⅱ,Ang Ⅱ組各組終濃度分別為10-7mol/L、10-6mol/L和10-5mol/L,對照組及Ang Ⅱ各組24 h后PBS緩沖液(Phosphate Buffered Saline)洗滌細(xì)胞,加入0.25%胰酶消化,1000r/min轉(zhuǎn)速離心,加binding buffer重懸細(xì)胞,加入5uL Annexin V-FITC與1uLPI避光反應(yīng)15mL,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.2 Ang Ⅱ誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

采用終濃度為10-6mol/L的Ang Ⅱ分別處理血管內(nèi)皮細(xì)胞6、24、48 h后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.3 神經(jīng)酰胺合成酶抑制劑煙曲霉素B1(fumonisin B1,FB1)抑制 Ang Ⅱ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

FB1預(yù)處理細(xì)胞24h后,再加入終濃度為10-6μmol/L的Ang Ⅱ處理 24h后與對照組血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況相比較。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Ang Ⅱ誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

2.1.1 Ang Ⅱ呈劑量依賴性誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

用終濃度分別為10-7mol/L、10-6mol/L和10-5mol/L的Ang Ⅱ分別干預(yù)血管內(nèi)皮細(xì)胞24 h后,根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果,與對照組相比,Ang Ⅱ組細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增高,且隨Ang Ⅱ劑量的加大逐漸上升。P<0.05,見表1、圖 1。

圖1 不同濃度Ang Ⅱ誘導(dǎo)的調(diào)亡細(xì)胞率

表1 不同濃度 Ang Ⅱ 誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞率

2.1.2 Ang Ⅱ呈時間依賴性誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

終濃度為10-6mol/L的Ang Ⅱ分別干預(yù)血管內(nèi)皮細(xì)胞6 h、24 h 和 48 h后,隨干預(yù)時間的延長細(xì)胞凋亡指數(shù)逐漸升高,見表2、圖2。

圖2 不同時間Ang Ⅱ誘導(dǎo)的調(diào)亡細(xì)胞率

表2 不同時間 Ang Ⅱ 誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞率

2.2 FB1抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

Ang Ⅱ和Ang Ⅱ+FB1分別干預(yù)血管內(nèi)皮細(xì)胞24 h后,根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果,與對照組相比,Ang Ⅱ組凋亡指數(shù)明顯升高(P<0.05),Ang Ⅱ+FB1組細(xì)胞凋亡指數(shù)則無明顯變化。P>0.05,見表3、圖3。

圖3 各組間調(diào)亡細(xì)胞率

表3 內(nèi)皮細(xì)胞凋亡指數(shù)在各組間的差異

3 討論

越來越多的證據(jù)揭示了Ang Ⅱ在心血管系統(tǒng)、腎臟、大腦等系統(tǒng)中的病理生理學(xué)作用,包括引起細(xì)胞表型改變、通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大、纖維化、炎癥、代謝功能障礙、衰老和細(xì)胞凋亡等[7]。Ang Ⅱ誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有神經(jīng)酰胺信號系統(tǒng)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,Fas)/配體(fatty acids ynthase ligand,FasL)信號系統(tǒng)、酪氨酸蛋白激酶(protein tyrosine kinase,PTK)/絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(mitogen-activated protein kinase phosphatase 1,MKP-1)信號系統(tǒng)[8]和蛋白激酶C信號系統(tǒng)[9]等。

神經(jīng)酰胺作為鞘脂類的代謝產(chǎn)物,是構(gòu)成細(xì)胞膜的主要磷脂之一,具有高度疏水性,對細(xì)胞穩(wěn)態(tài)起重要作用,同時也是作為第二信使,對細(xì)胞的生長、增殖、分化、衰老、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞免疫等方面等起重要的調(diào)節(jié)作用,同時也介導(dǎo)了腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)等應(yīng)激因子及熱休克、紫外線照射、電離輻射、超氧自,TNF由基等誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[10,11]。

血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡導(dǎo)致其功能失調(diào),血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)是許多心血管病如冠心病、心力衰竭的發(fā)病基礎(chǔ)。本試驗結(jié)果表明Ang Ⅱ能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,且細(xì)胞凋亡率有濃度-效應(yīng)關(guān)系。FB1能顯著抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,驗證了神經(jīng)酰胺作為第二信使,可以介導(dǎo)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,為進(jìn)一步研究神經(jīng)酰胺信號途徑在血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用提供實驗依據(jù)。